スターレットイソギンチャクの尾方Physaから完全ポリープ再生を誘導 Nematostella vectensis

サマリー

ここでは、モデル刺胞動物のアントゾアンであるStarlet Sea Anemone Nematostella vectensisの再生を誘導し、監視する方法を実演します。 私たちは、形態学的病期分類システムを使用して再生を切断および分類する方法を示し、このシステムを使用して、ポリープ構造の再生におけるオートファジーの必要性を明らかにします。

要約

刺胞動物、具体的にHydraは 、損傷を受けたり、切断構造を再生するために示した第一の動物であった、そして実際にこのような研究は間違いなく250年以上前にトレンブレーの仕事を通じて、現代生物学的調査を開始しました。現在再生の研究では、両方の「クラシック」の再生などヒドラ 、プラナリアやUrodelesのような生物、ならびに海綿から哺乳動物を介して、後生動物の範囲を、スパニング種の拡大スペクトルを用いて復活を見ています。生物学的現象としての本質的な関心に加えて、再生は様々な種でどのように機能するかを理解することは、再生プロセスは、共通の特徴および/または種またはコンテキスト固有の細胞および分子メカニズムを共有しているかどうかをお知らせします。女優のイソギンチャク、Nematostella vectensisは 、再生のための新たなモデル生物です。 ヒドラのように、Nematostellaは古代の門、刺胞動物のメンバーですが、トン内彼のクラス花虫綱、進化的により基礎であるヒドロ虫の姉妹クレード。したがってNematostellaでの再生の側面は、比較し、 ヒドラ及びその他の刺胞動物のものと対比するために興味深いものになります。この記事では、我々は、二等分観察し、physaと呼ばれるNematostella大人の尾方端の再生を分類する方法を提示します。 physaは自然に無性生殖の手段として、核分裂を起こし、自然核分裂またはphysaの手動切断のいずれかは、複雑な形態の再成長と改革をトリガします。ここでは、Nematostella再生ステージングシステム（NRSS）におけるこれらの単純な形態学的変化を成文化しています。私たちは、クロロキンの効果、リソソーム機能ブロックのオートファジーの阻害剤をテストするためにNRSSを使用しています。結果は、自食作用が阻害されたときにポリープ構造、特に腸間膜の再生が異常であることを示しています。

概要

単一ヒドラにおける再生の観察は、実験科学の^1,2のような生物学の出現で精液のイベントでした。再生は、生物学者に非常に広くアピールの現象のままと同様に人を置きます。人間の再生の限界を理解し、克服する発生生物学者、臨床医、生物医学科学者や組織のエンジニアの可能性はより本質的に興味深いより再生生物学になります 。

さて、このようなゲノム配列決定およびゲインと機能ツールの損失などの新たな技術を使用して、フィールドが回生機構を離れていじめるために、最終的に他の人がすることはできませんが再生成することができますどのように様々な種を理解する態勢を整えています。 、分子細胞性および形態学的応答における共通の度合いはまだ解明されていないが、今のところ再生することができる動物の間の基本的な応答がimagiであったであろうよりも類似していると思われますNEDのみ一昔前^3。

特に、刺胞動物は、形態的多様性の広いスペクトルの中で、ほぼすべての身体の部分のを再生するに容易です。孤独な淡水ポリープから、ハイドラは、ポルトガル人-O-戦争のような複雑な植民地siphonophoresに、広大なサンゴ礁を構築小さな海洋ポリープと共に、再生はのための機構に加えて、多くの場合、再生モードであり、怪我や捕食に起因する破損や紛失の体の部分を修理または改。刺胞動物門の多様な種が再生のために類似または異なるメカニズムを使用するかどうかを根本的に興味深い質問^4-6です。

私たち、そして他の人が再生^7-17のモデルとして花虫類、Nematostella vectensisを開発してきました。我々は最近、aboraから二分組織の形態学的に均一な片から体全体の再生を記述するためのステージングシステムを開発しましたポリープ¹⁰のリットルの終わり。任意のレベルで二分したときNematostellaポリープを再生成することができますが、我々はこれが自然な無性分裂¹⁸の通常の平面に近いため一部では、ほとんどの形態学的に単純な地域、physaで尾方の位置で大人をカットすることを選んだ、ともあるため体全体が最も単純な形態学的構成要素から組み立て直されているかを観察し、分子解析を可能にします。

Nematostella再生ステージングシステム（NRSS）は、通常の培養条件下で、切断physaによって再生のいずれかの態様の進捗状況を採点するために使用することができる形態学的ベンチマークの比較的単純なセットを提供したり、実験的にそのような小分子治療、遺伝子操作などの状況を摂動しました、または環境の変化。予想通り、NRSSは再生の細胞および分子事象を参照することが可能な形態学的足場として採用されつつあります10。

最後に、切断の我々の方法は、最近の研究¹⁷で使用されるピンポイント穿刺よりも数桁大きいぽっかりと穴を生成し、まだ両方の傷は6時間の周りで癒します。創傷閉鎖の視覚的に逮捕した別個のフェーズを文書化することは傷の大きさと、それを閉じるのにかかる時間の見かけ上の独立性を説明するために実験的アプローチを示唆している必要があります。したがって、このプロトコルによって提供される尾方切断プロセスのより深い視覚的理解は、このモデル再生システムにさらなる研究を支援し、Nematostella vectensisのを使用して、この病期分類システムの適用を拡大します。

プロトコル

温度、栄養および明/暗サイクルのための動物の1コンディショニング

1. 世界中の数多くのNematostellaラボの1、または非営利業者からNematostella vectensis成人を得る（ 表1）
2. 千あたり12部（PPT）の塩分で「1/3× "人工海水（ASW）で、暗闇の中で（典型的には18と21°C）一定温度でNematostellaを維持します 。一般的に250 mlまたは1.5 L容量^11、シンプルなソーダライムガラス培養皿で培養を維持します。
   注：これらの単純な培養条件は、一般的にNematostellaを研究ラボの中で使用されているが、文化のケアも^19を自動化することができます。
3. 週4倍- 2ノープリウスNematostella新しく孵化したアルテミアを養います。フル強度（36 PPT）または1/3倍の浅い長方形のガラス皿²⁰内またはで30℃、でASWでハッチアルテミアシスト小規模、商業や自家製ブラインシュリンプ孵化場の数のいずれか。インキュベーターが使用できない場合は、エビはRTで孵化が、よりゆっくりとそうなります。
   注：これは、多くの場合、完了のために24時間以上を必要とします。
4. 少なくとも週に一度アネモネ培養水を交換してください。最高の大人の健康のために、徹底的にクリーン（石鹸なし）文化が一度コートボウルと缶トラップ食べ残しや廃棄物の蓄積粘液分泌、の週をボウル、動物を絡ませます。

栄養的に馴化動物の2.選択とリラクゼーション

1. ほぼ同じ長さの大きさがマッチしたポリープを選択（3〜5センチメートルを、ときに自然にリラックスした）前切断に3日間コロニーから分離ボウルに配置します。
   注：切断のために選択された動物の数は、実験によって決定されますもちろん、行われているが、一般的に、我々は6反復でサンプル点当たり少なくとも5匹の動物をお勧めします。このように、典型的な実験では30匹の動物の最小値は、事前に選択されたことになります。 （下記参照）不規則な切断術の後スコアに影響を与えることができるので、一般には、より多くの最小数（30）より選択することが賢明です。
2. 切断する前に少なくとも1時間室内光にインキュベーターから選択した動物の食器を削除します。
   注：室内光とハンドリングの振動への曝露は、おそらく動物が収縮する原因となりますので、実験台上でのインキュベーションによって適合または「リラックス」する必要があります。動物は触れるために、耐火及び露光となり、その時点での穏やかなピペッティングして移動することができます。
3. オプション：（1/3×ASWに）7.5％のMgCl _2を追加することにより、動物を麻酔。静かに標準的なプラスチック5 mLのピペットでボウルへのMgCl ₂溶液を追加します。
   注：動物は、最終的に光へと物理的な操作に慣れになるだろうが、維持またはトンを「修正」するために動物を麻酔することが有利な場合があります彼らは細長い^16,21,22となった後、彼は状態を緩和しました。
4. 12 PPTのASWを含む直径100mmの滅菌ガラス切断皿の底に、切断されるように、プールから5匹の動物（1/3×ASWに）転送するために広い口径（> 0.5センチメートル）プラスチックピペットを使用してください。 40X - 10の間に可変倍率の実体顕微鏡のステージに上の皿を置きます。
   注：動物は、切断のために麻酔をかけ、リラックスされていない場合、彼らはまだ触れないように対応し、ステレオスコープの照明ので、再びリラックスになるために数分を必要とする場合があります。

3.切断術

1. 滅菌メスを使用して、約限り、それは広いと全く腸間膜を含まないあるようですphysaのセクションを得ることを目標に、各ポリープから尾方physaを切断します。
   注：理想的な切断部位は、腸間膜の終了にちょうど尾方です。切断面に薄いリットルに対して適切腸間膜からの移行がありますINESは、各腸間膜挿入（ 図1参照、矢印）に対応します。それは穴^{17,30 'を}差し込む」容易にすることができる粘液を生成するので、腸間膜の不在は重大です。
   1. 切断の所望の部位での動物と接触したメスの刃を配置します。 （フリーハンド）補助なし、または静かに＃5鉗子（デュモンスタイルまたは類似）で動物の体を把握することでこのいずれかの操作を行います。
   2. 体全体の「ロッキング」運動にメスの湾曲した刃を活用することで、組織を通ってカット。
      注：組織は、メスが揺動されるようにきれいに切断し、ドナーからphysaの所望の部分を解放する必要があります。組織の小片がまだ体とphysaを接続する場合は、メスでそれをカット。これはphysaに損傷を与える可能性として、引っ張ることにより、接続された作品を分離しようとしないでください。
2. 皿から各切断「ドナー」ポリープを削除し、SEPAに戻します「プールされた切断者」の標識率ボウル。日付ボウルとストック培養物に戻します。
   注：切断ポリープ日以内に尾方の傷を癒してくれるし、その後正常に供給することができます。彼らは、必要に応じてphysaが再び切断することができ、その時点で2週間以内に通常見physaを再生成します。
3. 12 PPT ASWで切断皿に残って切除したphysaをすすぎ、その後、すでに各ウェルに12 PPT ASWの10ミリリットルを持つマルチウェル細胞培養プレートに別々の無菌ウェルに各physaを転送します。
   注：この例では、各ウェル海水の10 mL及び5切除したphysaを保持して、6ウェルプレートを使用しています。一般海水でハンドリングし、潜在的な蒸発に起因する動きに空気への暴露を避けるために十分physaをカバーする必要があります。プレートまたはウェルは、蓋を持っている必要があります。
4. 各実験治療のために、各ウェルの予約で少なくとも5 physaを収集するために、3.3 - 繰り返して、3.1を繰り返します。
5. 箴ます温度でphysaをインキュベート計画された実験的な取調べのための再生の最高の速度をIDE。再生の所望の速度によって決定される一定の温度で、温度調節インキュベーターにphysaを含むプレートを置きます。
   注：physaが欠落した組織を再生し、15と27℃の間の温度でインキュベートした場合、完全なポリープを形成することになります。再生の速度は、最初の2つのステージを除いて、温度依存性です。全ての温度のための段階4に到達するための平均日は、切断後7日であり、これはまた、21℃における再生と一致します。 27℃では、ステージ4は、約3日早く到達し、15℃で、ステージ4は、21°C（参照文献10）で再生と比較して約3 dだけ遅延されます。

4. Nematostella再生ステージングシステム（NRSS）で再生を評価します

1. 変数壮麗なステレオ-化合物顕微鏡を用いてphysaスコアエーション（10 - 80X）。ステージ0のように新鮮にカットNematostellaの physaスコアと同時に、NRSS ^10を使用して、毎日ポスト切断術（DPA）をスコアリングを続けます。
   注：キーのステージング基準や詳細についてはリファレンス10を参照してください。
   1. オープン創傷部位で、弛緩性バルーンに似ているcup-形の質量はそう見えるようたてカットphysaが表示された場合、ステージ0（開いた傷口）としてphysaスコア。
      注：傷のエッジがまた最初から一緒に固執する可能性がありますが、組織はまだ崩壊され、剛性が不足しています。開放創のエッジは、創傷治癒のような半径方向の収縮を受けて観察することができます。
   2. 切断術創が閉じて表示された場合（閉鎖した創傷）第1段階としてphysaスコア。
      注：創傷場所は、将来の経口極に対応させていただきます。将来の経口ポールの周りの外表面は、基礎となる放射対称内胚葉腸間膜の挿入に対応する明確なアーチを表示し始める可能性があります。
   3. スコアのpHYSAステージ2（ラジアルアーチ）などの経口極の表面が放射状に対称なパターンに配置された8つの隆起したアーチを明らかにし、膨張した溝によって分離された表示されます。アーチの頂点に小さな半球状のブレブを守ってください。彼らは広い、おそらく一過性のように背の高い、と最初は単一の外胚葉細胞層によって構成についてになります。
      注：いくつかのケースでは二重層ブレブを安定化させることができます。注：この以降の段階で粘液層がphysa膜状の「鞘」で（ 図2）をカプセル化するために表示されることがあります。このカプセル化材料は、スコアリングを容易にするために削除する必要があります。
   4. 内胚葉と外胚葉組織層を含む触手の芽を安定的に、少なくともいくつかの半径方向のアーチの経口端部に形成されている場合には、ステージ3（触手）としてphysaスコア。
      注：触手は、彼らが広く、最小限の運動性よりも長くなっています。腸間膜の基礎が可視になるようにphysaは増加したが、変数インフレ率が表示されます体腔（腔腸）に腸間膜の挿入から延びるible。
   5. physaは、彼らが接続されているように見えたところから測定その2倍の半径方向の幅よりもある口腔尾方の長さで、体壁に挿入から腔腸中に延びる8明確な、目に見える腸間膜が含まれている場合は、ステージ4（リニア腸間膜）としてphysaスコアその尾方端（enterostome）で咽頭へ。
      注：4つ以下の腸間膜には、「プリーツ」内部の自由縁を持っています。咽頭が表示されます。以上8触手は、運動性表示され、時には彼らは体内に収縮します。
   6. physaはプリーツとつ以上の腸間膜を有しており、プリーツは、動物はほとんど "通常の"大人の外観を持っていますが、目に見えるはありませんステージ4でより完全かつしなやかである場合、ステージ5（主にプリーツ腸間膜）としてphysaスコア生殖細胞。

結果

切断されたphysaで再生中の形態学的イベントの進行は、各NRSS段階でphysaの代表的な景色を備えて、図1Aに示されています。典型的なphysa切断部位は、成人（矢じり）に示されています。 図1Aの写真は完全に形成されたポリープを介して新鮮にカットphysaから口頭と身体構造のプログレッシブ再生を示しています。 図1B、Cにはそれぞれ、ステージ4、ステージ5で、腸間膜を内部セプタムの配置を示します。第4段階でいくつかの腸間膜が「プリーツ」を欠くが、大部分はプリーツを開発している必要があり、ステージ5のように修飾することに注意してください。 図1Dは、鉗子（ 図1E）を用いて除去することができる粘液の膜に包まphysaを示しています。再生に有害な通常ではないが（それが不当に動物をトラップしない限り）、膜はphysaを得点妨げと行うことができますこのような分子/生化学分析のための顕微鏡検査、サンプルの固定...

ディスカッション

創傷治癒および再生のモデルとしてNematostellaの使用は、ますます人気が高まっています。したがって、効果的な細胞および分子分析は、割り当てと比較することができる前に、特定のプロトコルの形態学的パターンを可視化できることが重要です。生活の後プラヌラの段階で、ほぼすべての場所で切断し、不足している構造を改革することができるという、回生「柔軟性」の高い学位を持っているNematostella。このように、様々な研究者らは、異なる年齢やサイズ^7-18で、再生切断から生じるまたはポリープの異なる領域に負傷を検討しました。

ここで説明したステージングシステムは、生殖組織を欠いている解剖学的に完全な若年性ポリープに大人の尾方端から切断physaの形態学的に均一な部分の変換を、（これらの回生少年が性的メートルになったときに、我々はまだ決定していない以下のature）。このアプローチは、最大に近い複雑さの一つに組織の簡単な原基から再生を調べます。最小グループサイズは、潜在的な個体差と生存のために正規化することをお勧めしますように5 p...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Nematostella vectensis、大人	海洋生物学研究所(MBL)		非営利サプライヤー
ガラス培養皿、250mL	ロライナ生物学的供給	741004	250mL
ガラス培養皿、1,500mL	ロライナ生物学的供給	741006	1,500mL
ポリエチレン転写ピペット、5 mL	USAサイエンティフィック	1022-2500	ナローボア、目盛り付き
ポリエチレントランスファーピペット、テーパーSamco		202-205	、ワイドボアを作るために先端の1インチを切り取りました
	使い捨てメスフェザー安全カミソリ株式会社	第10	ブレードは湾曲する必要があります
#5デュモンファインポイントピンセット	Roboz	RS5045	代替サプライヤーが利用可能
レックスペトリ皿、直径100ミリメートル	コーニング	3160	他のガラスペトリプレートを置き換えることができます
滅菌6ウェルプレート	コーニングファルコン		他のメーカーの353046または同様の
滅菌済み12ウェルプレート	Nunc		他のメーカーの150628または類似
のもの 滅菌24ウェルプレート	Cellstar、Greiner bio-one	662-160	または他のメーカーの
同様のもの ブラインシュリンプハザリーキット	サンフランシスコ湾; drsfostersmith.com	CD-154005
	で一般的な	パイレックスグラタンディッシュ	オプション ブラインシュリンプ
を育てるためのオプション人工海水混合物50ガロン以上	インスタントオーシャン;	drsfoster-smith.com CD-116528	他のブランドは、
ストックASWの準備のためのプラスチック浴槽 ASWの準備	様々な		一般的な25ガロンのプラスチックゴミ箱OK
ポリプロピレンカーボー	カロライナ生物学的供給	716391	ASW @ 12 ppt
ビーカーの作業ストック用、卒業、4,000 mL	PhytoTechnology Laboratories	B199	36 pptのASWを12 pptに希釈するための
実体顕微鏡・光源	各種		連続1〜40倍の倍率

カカはパイはもの 食料品店ブラインシュリンプを育てるためのイ