ヒト肝細胞癌細胞株HepG2細胞と三次元肝モデルに再増殖におけるウイルスベクターの研究

現在のほとんどの生物医学研究は、二次元(2D)の細胞培養実験または動物モデルのいずれかに依存しています。これらはその性質上、三次元(3D)です。ただし、これらのアプローチにはいくつかの深刻な欠点があります。2D培養で増殖した細胞は、3D条件下で培養した細胞とは遺伝子発現パターンや細胞生理機能が異なることが示されています。¹ 動物モデルは、倫理的な懸念と関連しているだけでなく、しばしば人間の生理学をうまくモデル化していません。化合物の明らかな毒性作用の欠如は、ヒトへの最初の投与前に動物モデルで確認する必要がありますが、臨床試験で深刻な、時には致命的な副作用が発生した複数のケースが文書化されています。.²

最近の研究では、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの分布と導入遺伝子発現を研究するために、ヒト化された3D肝臓モデルを使用しました。⁸ AAVベクターは、遺伝子治療用途で最も有望なウイルスベクターに属しています。⁹ 西洋世界で最初に承認された、そして現在までに承認された唯一の遺伝子治療介入は、リポタンパク質リパーゼの転写にAAVベクターを使用する。¹⁰

注：RLはLandesamtのfürお大事にウントSoziales（LaGeSo）からの器官の外植のための倫理的な承認を得ました。肝臓をウィスター系ラットから外植されました。下大静脈および肝臓の門脈は22 Gカニューレでカニューレを挿入しました。外植された肝臓の脱細胞化するための方法は、以前に記載されている。ここで使用される^4,5、細胞外マトリックスは、1％デオキシコール酸ナトリウムでラット肝臓の過度の灌流により得ました。

ラット肝臓の細胞外マトリックス（ECM）の1.再細胞化

1. 肝細胞株HepG2の拡大
   1. 培養ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）10％ウシ胎児血清、2mMグルタミン、及びペニシリンの2mMのストレプトマイシン、それぞれを補充1640培地中で肝細胞癌細胞株HepG2。
   2. T175ボトル中1.5×10 ⁷個^の細胞を播種し、37℃、5％CO ₂で細胞を成長させます2で5分間トリプシン処理により4日後に収穫細胞。
   3. 300×gで細胞をスピンダウンし、4 mlのPBSで再懸濁し、顕微鏡下でノイバウアー室で細胞を数えます。 One T175ボトルは、約4.5×10 ⁷個^の細胞が得られます。
      注：文化はECMあたり6×10 ⁸ HepG2細胞（4-5×10 ⁸個^の細胞それぞれに10×175cm ²の培養フラスコ）を持つラット肝臓ECMの再細胞化のために十分な細胞数が含まれていることを確認してください。

図1.バイオリアクターシステム。A）このバイオリアクターシステムは、カスタムメイドでした。これは、37℃、5％CO ₂で、臓器モデルを維持します。蠕動ポンプの流量を個別に調整することができる。B）肝臓成長チャンバとの接続に配置されています蠕動ポンプ、媒体貯蔵、気泡トラップと圧力センサで構成されて灌流回路にエド。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

2. ECMの再細胞化
   1. 肝灌流チャンバー、灌流システム、媒体のリザーバと気泡トラップを含む、バイオリアクターシステムを設定します。バイオリアクターシステム（121℃、15分）を滅菌します。
   2. 蠕動ポンプでバイオリアクターシステムを接続し、適切な条件（37℃、5％CO _2）を提供_するインキュベーターに置き。バイオリアクターシステム（ 図1）の肝灌流チャンバー内の脱細胞化ラットの肝臓の足場^8を配置します。
   3. 灌流システムにチューブクリップを使用してカニューレを挿入し、門脈と大静脈を接続します 。 （1.1に記載のように）150 mlのRPMI培地で足場の平衡/分1.25ミリリットルの流量で5日間にわたって。
   4. メディア回路からの肝臓の足場を外し、5ミリリットルの注射器を使用して、門脈を経由して（5ミリリットル中）3×10 ⁸ HepG2細胞と足場に接種、気泡の形成を回避し、細胞がためにそれらをインキュベートすることによって、ECMを再投入することを可能にしますポンプと足場で1時間はオフ。
   5. 徐々に10分間1.25 ml /分で開始し、ポンプを調整することで流量を増加させます。 20分間、2.5ml /分、最後に3.75ミリリットル/ 30分間分。
   6. 繰り返しは、6×10 ⁸の全細胞数に到達するために1.2.4-1.2.5を繰り返します。
   7. /分3.75ミリリットルの流量でバイオリアクターシステムを実行します。文化2週間の再細胞化ラット肝。
      注：一日おきに新鮮な培地（50ml）で媒体の三分の一を交換してください。このような乳酸デヒドロゲナーゼ活性、培地試料のpHおよびグルコースおよび乳酸の濃度などの生理学的パラメータを測定するための培地をサンプリングします。

再細胞化ラット肝の2伝達

1. AAVベクターの大規模生産
   1. 前述のように、生成、精製、及びAAVベクターを定量^：11
      1. 簡潔には、ローラーボトルにAAVベクターを生成し、イオジキサノール勾配遠心分離により、それらを精製します。 PD10ゲル濾過カラム上で濾過することにより、残留イオジキサノールを削除します。標準として、ゲノムのAAV DNAを用いて、qPCRによりAAVベクターの濃度を決定します。
         注：本研究で使用される自己相補的、偽AAV2 / 6ベクターは、形質導入効率および内因的に発現する遺伝子のノックダウンのためのshRNA発現カセット（ ヒトシクロフィリンB（hCycB）、 図2）を実証するためのレポーターとしてEmGFPをコードしていました。血清型6（肝臓モデルあたり2.7×10 ¹³ AAVベクター）の偽scAAVベクトルの十分な量を確保。

本研究で使用される自己相補的、偽AAV2 / 6ベクターの図2.地図。ゲノムはAAV2の逆方向末端反復（ITR）で構成され、同様に、CMVプロモーターの制御下EmGFPを符号化するshRNA制御下U6プロモーターの。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

2. 肝臓モデルの導入
   1. PBSのそれぞれの容量を追加することで、5ミリリットル中に2.7×10 ¹³ベクターゲノムの最終濃度までAAVベクター溶液を調整します。
   2. カニューレからチューブを除去することにより、メディア回路から肝臓を外します。門脈のカニューレに5ミリリットルの注射器を接続し、完全なAAVベクター溶液（5 ml）を注入します。
      注：Optionallyは、肝臓全体のAAVベクター溶液の分布に従うようにフェノールレッド（5μg/ ml）を加えます。
   3. ポンプなしで1時間インキュベートします。徐々に10分間1.25 ml /分で開始し、流量を増加させます。 2.5ミリリットル/ 20分および30分間3.75はml /分分間。文化6日間の再細胞化ラット肝。
      注：1.2.7下の注で与えられる媒体の三分の一を交換してください

再細胞化形質導入ラット肝臓の3評価

1. ヘマトキシリンおよびエオシン（HE）染色および免疫組織化学的解析
   1. メスを用いて、各肝葉からのサンプル（0.5×0.5×1.5〜2センチメートル）を取ります。
   2. 4％パラホルムアルデヒド（PFA）に4℃で1.5時間、+ 4％スクロース溶液（3.1.1）からのサンプルをインキュベートします。 （ 注意 ：PFAは、必ず換気フード内でPFAを維持し、適切な防護服を着用し、有毒で発癌性である）洗浄PBSで3回（洗浄ステップあたり1分）および8％でインキュベート4℃でのスクロース一晩。
   3. プラスチックcryomoldsに培地を固定注ぎ、気泡を含まない培地中固定にサンプルを置きます。サンプルが十分に覆われるまで固定培地を追加します。ストアは、さらに使用するまで-80℃でサンプルを組み込み。
   4. cryotome ¹²で凍結切片（10μm）を準備します。ヘマトキシリン+エオシン染色⁸によって再細胞化を評価します。 （：EmGFPここでは）目的遺伝子のための免疫組織化学染色により形質導入効率を評価します。
2. 分子生物学的サンプリング
   1. 生検パンチ（直径4mm）で各肝葉をサンプリング。 EmGFPの導入遺伝子発現の評価のための製造元の指示に従って全RNA、DNAやタンパク質を単離、および^8をノックダウンhCycB。

再細胞化の程度の評価のために、凍結切片を各再細胞化肝臓モデルの各葉から調製しました。切片を次にヘマトキシリンおよびエオシン染色によって分析しました。 図3に見られるように、TLM1、TLM2（形質導入された肝モデル1 +2）とCtrl（形質再細胞化された肝臓モデルの制御ではなく）として示される3つの肝臓モデルの各ローブは、HepG2細胞で再増殖しました。この肝細胞癌細胞株は、15歳のアルゼンチン人の少年の腫瘍組織から確立されました。肝臓モデルの一部の地域では、より集中的に他のものよりも再細胞化されました。これらの変化の原因を決定することが残っています。

図 3分析肝臓モデルの各ローブの 3 ヘマトキシリンおよびエオシン染色 TLM1 + 2：形質導入された肝臓モデル1および2;再細胞化が、形質導入されていなかったのCtrl：制御肝臓モデル。スケールバー：200μmです。 （参考文献からの許可を得て再印刷。8.） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

次のステップでは、肝臓のモデルの導入を評価しました。この目的のために、DNAは、肝臓モデルのそれぞれの28のパンチ生検から調製し、ベクターの力価は、qPCRにより定量しました。平均して、セル当たり55および90に内在ベクターゲノム（VG /セル）は、2つの形質導入された肝臓モデルを測定しました。 2D細胞培養における実験は、30 VG /セルを示している強力なトランスジーン発現およびRNAi媒介性サイレンシングのために十分です。 EmGFPの製造は、RT-PCRおよびウェスタンブロッティングによって分析しました。実際には、レポーターの発現は、それぞれ、mRNAおよびタンパク質レベルに対する生検の80〜90％で検出されました。8形質導入効率の全体像を得るために、凍結切片を免疫組織学的に分析しました。 図4に見られるように、DAPI染色により可視化に成功し、再細胞化された肝臓モデルの領域は、また、EmGFP発現の免疫組織化学的分析に強い蛍光シグナルが得られました。予想されるように、AAVベクターで処理されていない対照肝臓モデルは、任意のEmGFP発現を示しませんでした。

EmGFP式図 4. 免疫組織化学的分析の肝臓モデルを再増殖細胞をDAPI染色（青色）によって可視化しました。 EmGFP発現は免疫化学染色（赤色）で可視化しました。 TLM1 + 2：形質肝臓モデル1及び2を、再細胞化が、形質導入されていなかったのCtrl：制御肝臓モデル。スケールバー：200μmです。 （許可を得て再印刷文献から。 8.） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

最後の試験では、hCycBのAAV媒介性ノックダウンは、定量RT-PCRによって分析しました。 hCycBのノックダウンは、70〜90％であることがわかっ2形質導入された肝臓モデル（ 図5）のすべてのローブを渡って平均しました。

AAV-形質導入した3D肝臓モデルでhCycBの図5. RNAi仲介ノックダウン。hCycBのサイレンシングは、定量RT-PCRによって決定しました。平均値と標準偏差（SD）は、（それぞれ、TLM1及び2）各形質導入された3D肝臓モデルの全てのサンプルについて計算し、非形質導入コントロールの平均値に標準化した（Ctrlキー。）。 （Rからの許可を得て再印刷エフ。 8.） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

著者らは開示するものは何もない。