私たちは、オプシンで再構成された大きな単層リポソームにおけるリン脂質のスクランブルを測定するための蛍光ベースのアッセイについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
Scramblasesは、ATP非依存的に双方向膜二重層を横切ってリン脂質を移動さ。識別され、生化学的に検証された最初のスクランブラーゼはオプシン、感光体ロドプシンのアポタンパク質でした。ロドプシンは、光の知覚の原因である網膜の桿体ディスク膜に局在するGタンパク質共役受容体です。ロドプシンのスクランブ活動、 すなわち 、そのリガンド11- シス -レチナールに依存しない、アポタンパク質オプシンは、スクランブラーゼとしても活躍。スクランブリング構成および調節リン脂質は、細胞生理学において重要な役割を果たしているが、わずか数リンscramblasesこれまでオプシン他に特定されています。ここでは、オプシンのスクランブラーゼ活性の蛍光ベースのアッセイを記載しています。オプシンは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール及び蛍光NBD標識PCの微量（1-Pで構成される大単層リポソームに再構成され、almitoyl -2- {6- [7-ニトロ2-1,3ベンゾオキサジアゾール-4-イル）アミノ]ヘキサノイル} - SN -glycero -3-ホスホコリン）。スクランブラーゼ活性は、小胞の内部小葉に位置NBD-PCの分子はその蛍光が化学的に膜を通過することができない還元剤によって除去される外層にアクセスすることができる程度を測定することによって決定されます。我々が説明した方法は、一般的な適用性を有しており、他の膜タンパク質のスクランブ活動を特定し、特徴付けるために使用することができます。
概要
光受容体ロドプシン、（参照1、例えばレビュー）プロトタイプのGタンパク質共役型受容体は、同定され、生化学的に2,3を検証するための最初のリン脂質スクランブラーゼです。 Scramblasesは、双方向、ATPに依存しない方法4-6で二層間のリン脂質の動きに、生理学的に適切なレベルの本質的に遅い速度を向上させるリン脂質トランスポーターです。彼らの行動の例としては、小胞体および構成スクランブリングは、膜の恒常性と成長のためだけでなく、グリコシル化経路5の様々なために必要とされる細菌の細胞質膜で見つけることができます。規制リン脂質スクランブリングは、それが、マクロファージ7は、「食べる・私」-signalとして作用し、タンパク質因子の産生を触媒する活性化血小板の凝血促進表面を提供する、アポトーシス細胞の表面上のホスファチジルセリン（PS）を露出させるために必要とされます血液凝固に必要なのです。感光ディスク膜に、ロドプシンのスクランブル活性は、ATP依存性により生成される二重層の二つの膜リーフレットの間のリン脂質の不均衡を相殺することが提案されている、一方向性脂質は、ABCA4 4,8,9 10-12フリッパーゼ。
ロドプシンは、原形質膜でのPS露出のために必要2+依存性scramblasesが（参照して見直さ....
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プロトコル
リポソームおよびプロテオリポソームの調製
- リポソーム生成
- ガラスシリンジを使用して、POPCのモル比で52.5モル脂質を得るために、丸底フラスコに（クロロホルム中、25 mg / mlで）および160μlのPOPG（クロロホルム中、25 mg / mlで）1,435μlのPOPCを追加：POPG = 9：1。
- （何の水浴を溶媒のこのボリュームのために必要とされていない）145回転の回転速度で回転蒸発器を用いて30分間、脂質を乾燥させ、次いで、室温で、一晩、少なくとも3時間、または真空デシケーターにフラスコを転送（RT）。
- 穏やかに均質な、濁った懸濁液が得られるまで、フラスコを旋回することによって、50mMのHEPES pH7.4中、100mMのNaCl（以下、緩衝液Aと称する）の10mlの乾燥した脂質フィルムを水和。
注：この段階で脂質濃度は、全く損失がこれまでに発生していないはずですとして5.25 mMのことが予想されます。 - 周波数Oで室温で10分間水浴中懸濁液を超音波処理40 kHzのF。解決策は、やや明確になります。
- 押出機を用いて、200 nmの細孔サイズを有する膜を介して4パスで押し出しの第2サイクルに続いて、400 nmの細孔サイズを有する膜を通して懸濁液を10回通過します。
注：結果LUVをの平均直径は〜175 nmです。必要であれば、たLUVのサイズおよび均質性は、製造業者の指示に従....
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結果
我々は、蛍光ベースのアッセイを使用して、そのスクランブ活動を特徴づけるためたLUVへオプシンの再構成を説明します。私たちは、スクランブルオプシン媒介リン脂質の速度に下限を配置するとオプシンは、機能的に小胞に再構成したオリゴマー状態を決定するために、結果を分析します。
最適な再構成条件を特定するためには、経験的に、それらがタンパク質挿入に受容されるようにLUVを膨潤するために使用されなければならない界面活性剤の量を決定する必要があります。このような実験は、 図2Aに示されています。 POPCのアリコート：POPGのLUVを3時間、DDMの異なる量で処理し、試料の吸光度を540nmで測定し、濁度の測定値、したがって、小胞の大きさ。 540 nmの（OD 540）のグラフで測定した光学密度は、小胞がDDM concentrとして膨潤することを示していますエーションは4~6 mMのより増加するDDMがさら.......
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ディスカッション
スクランブラーゼ活性アッセイは、オプシンは、リン脂質スクランブラーゼ活性2を持っているかを決定するために、もともと私たちを可能にしました。アッセイはまた、（私たちは、図1AにNBD-PCのために示すように、アシル鎖にNBDで標識されたようなNBD-ホスファチジルエタノールアミンなどのNBD標識化レポーター脂質、さまざまなを使用、または上で私たちは、特異性をテストすることによってオプシンのスクランブ活動を特徴づけるために許可されました頭部基、NBD-スフィンゴミエリンまたはNBD-ホスファチジルセリン2）、小胞の脂質組成（小胞構成成分として、異なる量で例えば 、コレステロール）の効果、およびオプシンとすべての展示スクランブラーゼ活性のロドプシンの異なるコンホメーション状態かどうか。これらの分析は、リン脂質のための非特異的およびロドプシンの立体配座状態とは無関係に、またはそれはその発色団レチナール2,3が含まれているかどうかに関係なく、（毎秒万リン脂質>）ロドプシンのスクランブ活動が非常に高速であ.......
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開示事項
著者らは、開示することは何もありません。
謝辞
この研究は、Velux Stiftung（A.K.M.)、NIH grant EY024207）（A.K.M.）およびAustrian Science Fund（FWF）プロジェクトJ3686））によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1-パルミトイル-2-オレオイル-SN-グリセロ-3-ホスホコリン | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
| 1-パルミトイル-2-オレオイル-sn/EM<>-グリセロ-3-ホスホ-RAC-(1-グリセロール) (ナトリウム塩) | Avanti Polar Lipids | 840457C | POPG |
| 1-パルミトイル-2-{6-[7-ニトロ-2-1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル)アミノ]ヘキサノイル}-sn-グリセロ-3-ホスホコリン | Avanti Polar Lipids | 810130C | NBD-PC |
| 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 | VWR Scientific | EM-5330 | HEPES |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | NaCl |
| Dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310 5 GM | DDM |
| 蛍光計キュベット | sigma | C0918-100EA | キュベット |
| 分光蛍光光度計 | Photon Technology International, Inc. | 蛍光計 | |
| 亜硫酸ナトリウム テクニカルグレード、85% | シグマ | 157953-5G | ジチオナイト |
| GraphPad プリズム 5 ソフトウェア | プリズム | ||
| トリス ベース | VWR | JTX171-3 | トリス |
| LIPEX 10 ml 押出機 | ノーザンリピッズ株式会社 | 押出機 | |
| Whatman、ドレンディスク、PE、25 mm | シグマ | 28156-243 | ディスクサポート |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes、0.4 & micro;m、直径25 mm | シグマ | WHA110607 | 400 nmメンブレン |
| Whatman Nucleopore Track-Etched メンブレン、0.2 & マイクロ;m、直径25mm | シグマ | WHA110606 | 、200nm膜 |
| リン酸ナトリウム | シグマ | S3264-500G | |
| VWR培養チューブ、使い捨て、ホウケイ酸ガラス、13 x 100 mm | VWRサイエンティフィック | 47729-572 | 管過 |
| 塩素酸 | シグマ | 30755-500ML | |
| モリブデン酸アンモニウム四水和物 | シグマ | A-7302 | リブデン酸アンモニウム |
| (+)-L-アスコルビン酸 | ナトリウム Σ | A7631-25G | アスコルビン酸ナトリウム |
| バイオビーズ SM2吸着剤 | バイオ・ラッド | 1523920 | ポリスチレンビーズ |
| 2.0 ml マイクロチューブ クリア | VWR サイエンティフィック | 10011-742 | 再構成チューブ |
| 再構成ガラス管 | VWR サイエンティフィック | 53283-800 | 再構成ガラス管 |
| ゼータサイザー | マルバーン | DLSの |
参考文献
- Ernst, O. P., et al. Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms. Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).
- Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).
- Goren, M. A., et....
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