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方法論記事

タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのツールとしての蛍光異方性

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DOI：

10.3791/54640

⸱

2016年10月21日

 ,  , 
1Departamento de Química de Biomacromoléculas, Instituto de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México

この記事について

サマリー

タンパク質相互作用は、細胞の機能の中心にあります。熱量分光技術は、一般に、それらを特徴付けるために使用されます。ここでは、Shwachman-ダイヤモンド症候群（SBDS）で変異タンパク質と伸長因子様1 GTPアーゼ（EFL1）間の相互作用を研究するためのツールとして蛍光異方性を説明します。

要約

タンパク質 - タンパク質相互作用は、生体の機能において重要な役割を果たす。相互作用が同定され、検証された後には、構造的および機構的レベルでそれを特徴付けることが必要です。いくつかの生化学的および生物物理学的方法は、そのような目的のために存在します。中でも、蛍光異方性は、フルオロフォアで標識されたタンパク質の蛍光強度は、タンパク質 - タンパク質相互作用の際に一定のままである場合に特に使用される強力な技術です。この技術では、フルオロフォアで標識されたタンパク質は、選択的に入射ビームとの相対的な向きに応じて蛍光体のサブセットを励起する適切な波長の垂直偏光で励起されます。得られた発光はまた、関係垂直方向と水平方向の面で次のように異方性（r）を定義して方向性があります：私はVVとI R =（I VV -I VH）を /（I VV + 2I VH）、

概要

細胞は常に互いに相互作用の生体高分子の多くが含まれています。この関連付けは、シグナル伝達、遺伝子発現、およびとりわけ、細胞遊走の調節におけるそれらの機能を担当する細胞経路に関与する複合体を生じさせます。細胞内で発生するすべてのタンパク質 - タンパク質相互作用は、インタラクトームと呼ばれるネットワークを含みます。 サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）におけるそのタンパク質の70％以上は、相互作用パートナー1を有することが示されています。セルとその機能のインタラクトームを理解することは、生物の複雑さと多様性に関連する情報を提供しています。いくつかの方法は、タンパク質 - タンパク質相互作用を同定し、特徴付けるために記載されています。このような酵母ツーハイブリッド2、タンパク質断片相補アッセイ3、質量分析およびタンパク質microarraに結合されたアフィニティー精製4として置く方法による高異なりますYSは対話5,6を識別するために使用されます。識別されると、それを検証するために必要であり、これはケースバイケースで変動し得ます。典型的には、これらの実験は、タンパク質の一つの遺伝子の欠失または過剰発現により、例えば 、相互作用ペアの個々のメンバーのレベルの相互作用自体を破壊し、その後で他のメンバーの性質又は機能の変化を探し含みます細胞レベル。その後、生物物理学的技術7は、分子レベルでのタンパク質-タンパク質相互作用を特徴付けるために使用されます。熱量測定及び蛍光分光法を定量的及び機械的にそれらを記述するために使用されるこの目的のために、タンパク質複合体の構造は、X線結晶学、核磁気共鳴及び低温電子顕微鏡によって決定されます。

本研究では、蛍光異方性は、GTPアーゼEFL1とSBDとの間の相互作用を特徴づけるための手法として使用しましたSタンパク質。これらのタンパク質は、60Sリボソームサブユニット8の表面から真核生物の開始因子6のリリースを促進することによってリボソームの合成に参加しています。 SBDSタンパク質はShwachmanダイヤモンド症候群9として知られている疾患で変異し、EFL1がグアノシン二リン酸10,11との親和性を減少させるためのグアニンヌクレオチド交換因子として作用します。 SBDSにおける疾患変異はEFL1との相互作用を廃止し、したがって、その活性化を防ぎます。

蛍光異方性は、一般的に、タンパク質 - ペプチド又はタンパク質 - 核酸相互作用を研究するために、生物学的用途で使用されます。これは、フルオロフォアは、部分的に偏光放射の偏光の結果で励起という原理に基づいています。蛍光異方性は、式1で定義されています。

figure-introduction-1

I VVと私VHがある場所サンプルが垂直偏光12で励起されたときに、水平垂直（VV）及び（VH）の蛍光強度は、放射を偏光。蛍光異方性は、フルオロフォアの回転拡散の速度に影響を与える要因に敏感であり、したがって、温度、溶液の粘度およびフルオロフォアのみかけの分子サイズに依存します。それは他のタンパク質とそのような変化と相互作用するとき、フルオロフォア増加を含むタンパク質の見かけの大きさは、その後、異方性の変化として評価することができます。具体的には、その蛍光寿命を解決に相対ゆっくりと回転するフルオロフォアは、大きなI VV値と小さなI VHの値を持つことになりますので、比較的大きな異方性を示すであろう。急速に蛍光寿命を基準に転落蛍光団のために、私VVと私VHは同様であろうとその異方性値が小さい12になります（ 図1）。また、ノイズ測定に優れた異方性信号のために、目的の分子の回転相関時間と同様の蛍光寿命を有する蛍光団を有することが必要です。そうでなければ、正確に遊離タンパク質との複合体中のそれとの間の異方性の差を記録することは不可能です。例えば、100ダの低分子量化合物に結合し、フルオレセインやローダミンなどの4ナノ秒に近い寿命を持つ蛍光プローブの異方性が0.05です。 160キロダルトンの分子に結合すると、0.29にその異方性値が増加します。正確に測定することができる差。これとは対照的に、その増加分子の大きさで変化する65〜1000キロダルトンへの結合反応に関与し、同じ蛍光プローブは正確に測定するには小さすぎるです0.3から0.28の異方性の変化、になります。このシナリオでは、400ナノ秒の寿命を有するプローブは、12より適切であろう。

figure-introduction-2
蛍光異方性と手続きを測定するために使用される装置の1概略図。蛍光異方性を測定し、タンパク質-タンパク質相互作用の実験を行うために用いられる装置の概略図。相互作用パートナーに結合すると増加し、高速表示、小さな異方性をタンブルフルオロフォア。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

蛍光用途が研究分子のいずれかでフルオロフォアの存在を必要とします。フルオロフォアの三種類があるタンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために：1）タンパク質中に存在するトリプトファン残基、2）、緑色蛍光タンパク質（GFP）およびそのderivaように化学的に結合フルオロフォアおよび3）、蛍光融合パートナーティブ。ほとんどのタンパク質は、その構造上のトリプトファン残基を有し、従って、相互作用を測定する最も簡単な方法は、対応する蛍光スペクトルの変化を監視することにより、またはトリプトファン残基の蛍光強度の変化を監視することによってです。しかし、トリプトファン残基の分析を複雑に両方のタンパク質中に存在してもよいです。フルオロフォアによる相互作用、その蛍光特性を変化する一方、または結合部位の近くに位置する必要があり、それが相互作用自体を妨害する可能性があります。 GFPなどのかさばるフルオロフォアを使用する場合に特別な注意が必要です。これらの蛍光体のいずれもが結合研究のために使用できない場合には、その後、関連するタンパク質の一つに外因性蛍光団を導入することが必要です。多くの化学的に合成されたフルオロフォアが存在し、共有結合、アミン基（リジンまたはN末端の側鎖）およびシステイン中のチオール基のようなそれらの反応基を介してタンパク質に結合させることができます。 Fヨードアセトアミドおよびマレイミドは、チオール反応性基13でありながら、イソチオシアネートおよびスクシンイミジルエステルとluorophore誘導体は、アミド基と反応します。蛍光用途で使用される最も一般的な色素は、フルオレセインの誘導体およびローダミングリーン色素、クマリン、BODIPYフルオロフォアおよびアレクサフルオロ色素です。市販のフルオロフォアおよびその使用の詳細なリストは、参考文献14,15に記載されています。成功した標識のために、反応性基は、タンパク質の表面に露出する必要がありますが、原因のポリペプチドに典型的に存在する反応性官能基の数が多いため、部位特異的修飾を得ることは非常に困難です。本研究における目的のタンパク質は、SBDS、複数のサイトの標識をもたらすことができる5遊離システインと33のリジンが含まれています。不均一な標識は、結合に影響を与えることができ、異なるフルオロフォア分子が結合時に異なる蛍光強度信号を引き出すことができるようにデータ解析を複雑にします。 OVEするにはこの問題をrcome、我々はサイトの直接ラベルに、SBDSタンパク質を4 '、5'-ビス（1,3,2- dithioarsolan -2-イル）フルオレセインをフラッシュフルオロフォアを使用していました。これは、フラッシュタグは、Xは、システイン16,17以外の任意のアミノ酸である配列CCXXCCからなるとしても知らモチーフの4つの離間したシステインに対して高い親和性を有するarsenoxide色素です。このテトラシステインモチーフは、タンパク質の全体的な折り畳みの破壊を防止するために一緒に適切なリンカーとN末端または遺伝子工学によるタンパク質のC末端に付加されています。フラッシュ染料とフラッシュタグのペアは、もともと生細胞17に、サイト固有のラベルタンパク質に設計されていたが、それはここで例示されているとして、また、 インビトロで精製されたタンパク質を標識するために使用することができます。また、酵素の戦略はまた、タンパク質18の部位特異的官能化を可能にするために開発されてきました。

本稿では、我々は、蛍光異方性aの有用性を説明しますタンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのSAツール。定量的情報は、実験データのフィットから得られることができるが、結合は、結合曲線の形状の単純な検査によって評価することができます。

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プロトコル

1. SBDS-FLASHタグタンパク質の発現および精製

注：異方性実験のために、フラッシュタグのCysが-のCys-Proの-Glyを-のCys-CysををPCRによってコード配列人間SBDSのC末端に付加された配列に対応します。この構築物は、発現ベクターをpRSET-Aにサブクローニングし、N末端ヘキサヒスチジンタグ（Hisタグ）をコードするタンパク質を発現する大腸菌 C41細胞に形質転換した、配列およびC末端フラッシュタグ10を符号化ヒトSBDS。

  1. SBDSフラッシュタンパク質発現
    1. コンピテントE.トランスフォーム標準的な熱ショックプロトコル19を用いてプラスミドをpRSET-HisSBDS-Flashで大腸菌 C41細胞。プレートを100μg/ mlアンピシリンを補足した固体ルリア - ベルターニ（LB）培地中の細胞。 LB固体培地組成物10、G 1 Lボリューム用のNaCl、5gの酵母エキス、10gのトリプトン、および20gの寒天から成ります。
    2. 37℃で培養形質転換された細菌まで600nmの（600）での吸光度を、100μg/ mlのアンピシリンを添加したLB液体培地1リットル中に0.5から0.7に達します。
    3. 培養液に0.5 mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドを添加することにより、タンパク質発現を誘導し、さらに5時間のインキュベーションを続けます。
    4. 4℃で10分間、3800×gで遠心分離することによって細菌懸濁液を収集します。上清を取り除きます。この時点で、-20℃で細胞ペレットを保存するいずれか、またはタンパク質精製のためにすぐに使用しています。
  2. SBDSフラッシュタンパク質精製
    注：すべてのクロマトグラフィー工程は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）システムまたは蠕動ポンプを使用して実行されます。 Ni 2+ -アフィニティークロマトグラフィーは、5ミリリットルFast Flowカラムを使用しています。アニオン交換クロマトグラフィーは、5ミリリットル強いスルホプロピル陽イオン交換カラムを使用しています。 3 mlと流量/分のすべてのクロマトグラフィー工程に使用しました。
    1. SBDS溶解Bの35ミリリットル中に細胞を再懸濁uffer 4分OFF 10秒オン、30秒のサイクルを用いて合計時間の超音波処理によって、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）および溶解を補充した（50 mMリン酸緩衝液pH 7.5、300mMのNaCl、20mMのイミダゾール）、4時°C。
    2. 4℃で50分間、9000×gでサンプルを遠心。
    3. 上清を保持し、細胞破片を除去するために、ペレットを捨てます。
    4. SBDS溶解緩衝液の3カラム容量（CV）のNi 2+アフィニティーカラムを平衡化し、カラムに上清を明らかに全体をご紹介します。
    5. SBDS溶解緩衝液の3 CVで洗浄して未結合タンパク質を除去し、SBDS溶出バッファーの3 CV（50 mMリン酸緩衝液pH 7.5、300mMのNaCl、250mMのイミダゾール）で溶出します。
    6. 50 mMリン酸緩衝液pH 6.5で溶出したタンパク質を6倍に希釈し、0.22μmのセルロース膜を通して濾過することによって可能な凝集体を除去。
    7. 低塩S列の3 CVとスルホプロピル陽イオン交換カラムを平衡化バッファー（50 mMリン酸緩衝液pH 6.5、50mMのNaCl）と、前のステップからのタンパク質サンプルを紹介します。
    8. 洗浄結合していない低塩Sカラムバッファーの3 CVを有する材料及び50mMリン酸緩衝液pH 6.5、1 M NaClで一段階でタンパク質を溶出させます。
    9. 50mMリン酸緩衝液pH 6.5で溶出した蛋白質3.3倍に希釈します。 15分間、3800×gで遠心分離することによって限外濾過装置を有するタンパク質を濃縮します。フラッシュは、液体窒素中でタンパク質を凍結し、さらに使用するまで-80℃で保管します。
    10. SDS-PAGE分析およびクマシー染色20によってタンパク質の純度を確認してください。

2. EFL1タンパク質の発現および精製

注：EFL1は、ベクターpRS426でギャル1/10発散プロモーター21およびサッカロマイセス・セレビシエMAT A 3'UTRの制御下で発現させました。組換えタンパク質は、タバコエッチウイルスプロテアーゼに融合したヒトEFL1アイソフォーム1（エンコードTEV）認識部位およびC末端にヘキサヒスチジンタグ。

  1. EFL1タンパク質発現
    1. S.トランスフォーム標準的な酢酸リチウムプロトコル22を用いてプラスミドpRS426-EFL1TevHisとセレビシエ BCY123細胞。プレートウラシルを含まない培地て合成ドロップ内のすべての形質転換された細胞（SD-URA）が、2％（w / v）のグルコースを補充しました。 SD-URA培地の組成、8グラムの酵母窒素塩基アミノ酸なしで11グラムのカザミノ酸、55mgのアデニン硫酸塩、55mgのチロシン、60mgのロイシンと1 Lボリュームの60mgのトリプトファンから成ります。
    2. 600 0.5％（w / v）のグルコースを補充したSD-URA培地の1.8 1 Lに達するまで培養物を30℃で酵母を形質転換しました。
    3. 培養し、ガラクトース（w / v）の2.8％を添加することによってタンパク質の発現を誘導し、30℃でさらに18時間インキュベーションを続けます。
    4. 4℃で10分間、3800×gで遠心分離することによって酵母懸濁液を収集します。上清を取り除きます。この時点で、-20℃で細胞ペレットを保存するいずれか、またはタンパク質精製のためにすぐに使用しています。
  2. EFL1タンパク質精製
    注：すべてのクロマトグラフィーステップはFPLCシステムまたは蠕動ポンプを使用して実行されます。 Ni 2+ -アフィニティークロマトグラフィー/分3ミリリットルの流量で5ミリリットルFast Flowカラムを使用しています。サイズ排除クロマトグラフィーを125 mLのカラムを1ml /分の流速でのSuperdex 200樹脂で予め充填を使用します。
    1. 1mMのPMSFおよび1mMベンズアミジンを補充EFL1溶解緩衝液（50mMのトリス-HCl pHが8、300mMのNaCl、20mMのイミダゾール、5mMのMgCl 2、10％グリセロール）50mlに細胞を再懸濁によって細胞を破壊4℃で、ON 2分および15分OFFのサイクルを使用して6分の合計時間を、ガラスビーズ（φ= 0.5 mm）を使用して、ビーズビーターの摩擦。
    2. 4℃で50分間、9000×gでサンプルを遠心。
    3. 上清を保持し、細胞破片を除去するために、ペレットを捨てます。
    4. EFL1溶解緩衝液の3 CVでのNi 2+アフィニティーカラムを平衡化し、カラムにすべて明らかにした上清を紹介。
    5. EFL1溶解緩衝液の3 CVで洗浄することにより未結合タンパク質を除去し、3 EFL1溶出バッファーのCV（50 mMトリス-塩酸pHが8、300mMのNaCl、250mMイミダゾール、5mMのMgCl 2、10％グリセロール）で溶出します。
    6. 異方性緩衝液（50mMのTris-HCl pH7.5で、300mMのNaCl、5mMのMgCl 2、10％グリセロール、5mMのβメルカプトエタノール）1.5 CVを有するサイズ排除カラムを平衡化します。
    7. 所望の体積に3800×gで遠心分離することによって限外濾過装置のNi 2+アフィニティーカラムから溶出された1ミリリットルEFL1タンパク質に集中します。サイズ排除カラム上のサンプルをご紹介します。
    8. 溶出したタンパク質を収集し、約30μMの最終濃度に限外濾過によって濃縮します。 Flashは、さらに使用するまで-80℃で液体窒素とストア内のタンパク質を凍結します。目を確認してくださいSDS-PAGE分析およびクマシー染色20によるタンパク質の電子純度。

FlAsH蛍光色素4 '、5'-ビス（1,3,2- dithioarsolan -2-イル）フルオレセインでSBDSフラッシュの3ラベリング

  1. 異方性バッファー5μlの容量で4 '、5'-ビス（1,3,2- dithioarsolan -2-イル）フルオレセイン色素の3ナノモルでSBDSフラッシュタンパク質の3ナノモルを混ぜます。
  2. 反応は4℃で8時間進行してみましょう。遊離色素を除去するために一晩異方性バッファーに対してサンプルを透析。
  3. 標識タンパク質の％を定量化するためにランベルト・ベールの法則を使用してください。 280 nmおよび適切な量の石英キュベットを使用して分光光度計で508 nmの吸光度を測定します。注：以下のモル吸光係数（M -1センチ-1）考えてみましょう：
    figure-protocol-1
  4. 式2を用いて標識SBDSフラッシュタンパク質の濃度を計算します。
    figure-protocol-2
  5. 前のステップから計算されたC SBDS-FLASHを代入して式（3）を用いて全SBDSタンパク質の濃度を計算します。
    figure-protocol-3
  6. 式4を用いて、標識されたタンパク質の割合を計算します。
    figure-protocol-4

4.蛍光異方性実験

注：異方性実験は、分極ツールボックスとデータ収集は、機器のソフトウェアに設けられた異方性のプログラムを用いて行った装備分光蛍光光度計で行いました。励起波長は、8ナノメートルのスペクトル帯域幅と494 nmに設定し、発光を530±25nmのバンドパスフィルタを用いて記録しました。測定は、5mmの経路長10を有する200μlのキュベット中、25℃で行いました。

  1. 蛍光キュベットでは、異方性バッファに30 nMのSBDS-FLASHの200μLを配置し、30μMEFL1の2μLを滴定します。完全に混合し、反応が異方性値を測定する前に、3分間放置しました。
  2. EFL140μlの総容量になるまで繰り返しステップ4.1が追加されました。

5.データ解析

  1. 非線形最小二乗回帰アルゴリズムを用いて、適切な結合モデルにデータをフィット。最も一般的な結合モデルの式は、表1に示されています。
  2. フィット23の残差を検査することにより、タンパク質間の相互作用を説明する最良のモデルを評価します。追加の実験で選択されたモデルをサポートしています。

表1.一般的なタンパク質間相互作用の結合モデルとそれらを記述する数式。0 / 54640table1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
figure-protocol-5

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結果

種の混合物の観察された異方性は式（5）で表されるので、任意の異方性の実験を行うためには、フルオロフォアの蛍光強度の大きな変化を排除することが重要です。

figure-results-1

F iは 、各コンポーネントとrの端数蛍光を表し、ここで、iは、対応する異方性です。各成分の分別蛍光は、両方に依存する式6によって定義され、その濃度と相対蛍光。

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ディスカッション

タンパク質のほとんどの生化学的実験に関係なく使用される技術の、純粋なタンパク質だけでなく、それらの大量ではないだけを必要とします。それは、ここで提示する場合であったように、この理由のために、実験のこのタイプのために使用されるタンパク質は、異種発現によって得られます。蛍光分光法が研究され、分子内にフルオロフォアの存在を必要とします。芳香族残基は、それらがほとんどのタンパク質に一般的であり、両方とも、受容体タンパク質およびリガンド中に存在するので、タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために、それらの信号を使用して分析を複雑に、タンパク質の固有の蛍光団を構成しています。さらに、トリプトファンの寿命は蛍光異方性実験のためには短すぎます。このため、研究したタンパク質のいずれかに外因性のフルオロフォアを添加することが一般的です。この目的のために、フルオロフォア、色素4 '、5'-ビス（1,3,2- dithioarsolan -2-イル）fとの配位結合を介しSBDSのC末端に付加しました。遺伝子工学によるタンパク質に導入されたテトラモチーフにしたluorescein。蛍光団をむくタンパク質を選択すると、ランダムな問題ではあり...

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開示事項

著者らは開示するものは何もなく、競合する金銭的利益もありません。

謝辞

著者は、CONACyTプロジェクト番号167359と177138、およびDGAPA-UNAMプロジェクト番号IN201615からの財政的支援に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5 mm ガラスBiospec 製品11079105
Tris BaseFormediumTRIS01超高純度
グリセロールSigma-AldrichG5516
染料 4',5'-ビス(1,3,2 ジチオアルソラン-2-イル) フルオレセインThermoFischer ScientificLC6090このキットには、FlAsHタグAmpicilineをラベルするための色素が含まれています
IBI Shelton Scientific, IncIB02040
D(+)-グルコース無水FormediumGLU03
D(+)-ガラクトースFormediumGAL03
L-ロイシンFormediumDOC0157
L-トリプトファン FormediumDOC0189
Bezamidine 塩酸塩Sigma-AldrichB6506-5G
PMSFGold Biotechnology, IncP-470-25フェニルメチルスルホニルフッ化物
NaClFormediumNAC02塩化ナトリウム 
グリセロールTecsiquim、SAのCVGT1980-6
MgCl2Merck Millipore Corporation1725711000塩化マグネシウム
イミダゾールSigma-AldrichI2399-500G
2-メルカプトエタノールSigma-AldrichM6250-100ML
K2HPO4Sigma-AldrichP3786-500Gリン酸カリウム二塩基性
NaH2PO4Sigma-AldrichS3139-500Gリン酸ナトリウム 一塩
酵母 アミノ酸なし窒素塩基フォーメディウムCYN0410
抽出物フォーメディウムYEM03マイクロ粒状
L-チロワネフォーメディウムDOC0193
アデニン硫酸塩FormediumDOC0230
Casamino acidsFormediumCAS03
TryptoneIBI Shelton Scientific, IncIB49182
IPTGFormediumIPTG025
Filtration unitsMerck MilliporeCorporation UFC901096Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa
メンブレンフィルターMerck Millipore CorporationGSWP04700メンブレンフィルター、混合セルロースエステル、親水性、0.22 &マイクロ;メートル、47 mm、白、プレーン
Ni2+ アフィニティーカラムQIAGEN30760カートリッジ 5 ml Ni-NTA Superflow
強スルホプロピルカチオン交換カラムGE Healthcare Life Science17-5157-01HiTrap SP Sepharose FF 5 ml
サイズ排除カラムGE Healthcare Life Science28989335HiLoad 16/600 Superdex 200 PG
蛍光細胞Hellma Analytics111-057-40
分光光度計Agilent TechnologiesG6860AACary 60 UV-Vis
シェーカーThermoFischer ScientificSHKA4000-7MaxQ 4000 ベンチトップ温度範囲 周囲-15°Cから60°C;C
遠心分離機ThermoFischer Scientific75004271Heraeus Megafuge 16R
FPLCPharmacia Biotech生産終了FPLCシステム 導電率 UV-MM II モニター P500 ポンプ分画
分光蛍光光度計Olis該当なしOlis DM 45 with Polarization Toolbox
ビーズ 基性酵母

参考文献

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