タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのツールとしての蛍光異方性

サマリー

タンパク質相互作用は、細胞の機能の中心にあります。熱量分光技術は、一般に、それらを特徴付けるために使用されます。ここでは、Shwachman-ダイヤモンド症候群（SBDS）で変異タンパク質と伸長因子様1 GTPアーゼ（EFL1）間の相互作用を研究するためのツールとして蛍光異方性を説明します。

要約

タンパク質 - タンパク質相互作用は、生体の機能において重要な役割を果たす。相互作用が同定され、検証された後には、構造的および機構的レベルでそれを特徴付けることが必要です。いくつかの生化学的および生物物理学的方法は、そのような目的のために存在します。中でも、蛍光異方性は、フルオロフォアで標識されたタンパク質の蛍光強度は、タンパク質 - タンパク質相互作用の際に一定のままである場合に特に使用される強力な技術です。この技術では、フルオロフォアで標識されたタンパク質は、選択的に入射ビームとの相対的な向きに応じて蛍光体のサブセットを励起する適切な波長の垂直偏光で励起されます。得られた発光はまた、関係垂直方向と水平方向の面で次のように異方性（r）を定義して方向性があります：私は_VVとI R =（I _VV -I _VH）を /（I _VV + 2I _VH）、

概要

細胞は常に互いに相互作用の生体高分子の多くが含まれています。この関連付けは、シグナル伝達、遺伝子発現、およびとりわけ、細胞遊走の調節におけるそれらの機能を担当する細胞経路に関与する複合体を生じさせます。細胞内で発生するすべてのタンパク質 - タンパク質相互作用は、インタラクトームと呼ばれるネットワークを含みます。 サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）におけるそのタンパク質の70％以上は、相互作用パートナー^1を有すること^が示されています。セルとその機能のインタラクトームを理解することは、生物の複雑さと多様性に関連する情報を提供しています。いくつかの方法は、タンパク質 - タンパク質相互作用を同定し、特徴付けるために記載されています。このような酵母ツーハイブリッド^2、タンパク質断片相補アッセイ^3、質量分析およびタンパク質microarraに結合されたアフィニティー精製⁴として置く方法による高異なりますYSは対話^5,6を識別するために使用されます。識別されると、それを検証するために必要であり、これはケースバイケースで変動し得ます。典型的には、これらの実験は、タンパク質の一つの遺伝子の欠失または過剰発現により、例えば 、相互作用ペアの個々のメンバーのレベルの相互作用自体を破壊し、その後で他のメンバーの性質又は機能の変化を探し含みます....

プロトコル

1. SBDS-FLASHタグタンパク質の発現および精製

注：異方性実験のために、フラッシュタグのCysが-のCys-Proの-Glyを-のCys-CysををPCRによってコード配列人間SBDSのC末端に付加された配列に対応します。この構築物は、発現ベクターをpRSET-Aにサブクローニングし、N末端ヘキサヒスチジンタグ（Hisタグ）をコードするタンパク質を発現する大腸菌 C41細胞に形質転換した、配列およびC末端フラッシュタグ^10を符号化ヒトSBDS。

1. SBDSフラッシュタンパク質発現
   1. コンピテントE.トランスフォーム標準的な熱ショックプロトコル^19を用いてプラスミドをpRSET-HisSBDS-Flashで大腸菌 C41細胞。プレートを100μg/ mlアンピシリンを補足した固体ルリア - ベルターニ（LB）培地中の細胞。 LB固体培地組成物10、G 1 Lボリューム用のNaCl、5gの酵母エキス、10gのトリプトン、および20gの寒天から成ります。
   2. 37℃で培養形質転換された細菌まで600nmの_（600）での吸光度を、100μg/ mlのアンピシリンを添加したLB液体培地1リットル中に0.5から0.7に達します。
   3. 培養液に0.5 mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドを添....

結果

種の混合物の観察された異方性は式（5）で表されるので、任意の異方性の実験を行うためには、フルオロフォアの蛍光強度の大きな変化を排除することが重要です。

F _iは 、各コンポーネントとrの端数蛍光を表し、ここで_、iは、対応する異方性です。各成分の分別蛍光は、両方に依存する式6によって定義され、その濃度と相対蛍光。

ディスカッション

タンパク質のほとんどの生化学的実験に関係なく使用される技術の、純粋なタンパク質だけでなく、それらの大量ではないだけを必要とします。それは、ここで提示する場合であったように、この理由のために、実験のこのタイプのために使用されるタンパク質は、異種発現によって得られます。蛍光分光法が研究され、分子内にフルオロフォアの存在を必要とします。芳香族残基は、それらがほとんどのタンパク質に一般的であり、両方とも、受容体タンパク質およびリガンド中に存在するので、タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために、それらの信号を使用して分析を複雑に、タンパク質の固有の蛍光団を構成しています。さらに、トリプトファンの寿命は蛍光異方性実験のためには短すぎます。このため、研究したタンパク質のいずれかに外因性のフルオロフォアを添加することが一般的です。この目的のために、フルオロフォア、色素4 '、5'-ビス（1,3,2- dithioarsolan -2-イル）fとの配位結合を介しSBDSのC末端に付加しました。遺伝子工学によるタンパク質に導入されたテトラモチーフにしたluorescein。蛍光団をむくタンパク質を選択すると、ランダムな問題ではあり.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.5 mm ガラス	Biospec 製品	11079105
Tris Base	Formedium	TRIS01	超高純度
グリセロール	Sigma-Aldrich	G5516
染料 4',5'-ビス(1,3,2 ジチオアルソラン-2-イル) フルオレセイン	ThermoFischer Scientific	LC6090	このキットには、FlAsHタグAmpicilineをラベルするための色素が含まれています
	IBI Shelton Scientific, Inc	IB02040
D(+)-グルコース無水	Formedium	GLU03
D(+)-ガラクトース	Formedium	GAL03
L-ロイシン	Formedium	DOC0157
L-トリプトファン	Formedium	DOC0189
Bezamidine 塩酸塩	Sigma-Aldrich	B6506-5G
PMSF	Gold Biotechnology, Inc	P-470-25	フェニルメチルスルホニルフッ化物
NaCl	Formedium	NAC02	塩化ナトリウム
グリセロール	Tecsiquim、SAのCV	GT1980-6
MgCl2	Merck Millipore Corporation	1725711000	塩化マグネシウム
イミダゾール	Sigma-Aldrich	I2399-500G
2-メルカプトエタノール	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P3786-500G	リン酸カリウム二塩基性
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S3139-500G	リン酸ナトリウム 一塩
酵母 アミノ酸なし窒素塩基	フォーメディウム	CYN0410
抽出物	フォーメディウム	YEM03	マイクロ粒状
L-チロワネ	フォーメディウム	DOC0193
アデニン硫酸塩	Formedium	DOC0230
Casamino acids	Formedium	CAS03
Tryptone	IBI Shelton Scientific, Inc	IB49182
IPTG	Formedium	IPTG025
Filtration units	Merck Millipore	Corporation UFC901096	Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa
メンブレンフィルター	Merck Millipore Corporation	GSWP04700	メンブレンフィルター、混合セルロースエステル、親水性、0.22 &マイクロ;メートル、47 mm、白、プレーン
Ni2+ アフィニティーカラム	QIAGEN	30760	カートリッジ 5 ml Ni-NTA Superflow
強スルホプロピルカチオン交換カラム	GE Healthcare Life Science	17-5157-01	HiTrap SP Sepharose FF 5 ml
サイズ排除カラム	GE Healthcare Life Science	28989335	HiLoad 16/600 Superdex 200 PG
蛍光細胞	Hellma Analytics	111-057-40
分光光度計	Agilent Technologies	G6860AA	Cary 60 UV-Vis
シェーカー	ThermoFischer Scientific	SHKA4000-7	MaxQ 4000 ベンチトップ温度範囲 周囲-15°Cから60°C;C
遠心分離機	ThermoFischer Scientific	75004271	Heraeus Megafuge 16R
FPLC	Pharmacia Biotech	生産終了	FPLCシステム 導電率 UV-MM II モニター P500 ポンプ分画
分光蛍光光度計	Olis	該当なし	Olis DM 45 with Polarization Toolbox

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