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方法論記事

食作用の初期段階の可視化

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DOI:

10.3791/54646

⸱

2017年2月3日

 ,  , 
1Department of Molecular Microbiology & Immunology, Oregon Health & Science University, 2Ragon Institute of MGH, MIT and Harvard

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、真菌、カンジダ・アルビカンス、およびザイモサンやIgGコーティングビーズを含む0.5μmを超える微粒子などの病原体の食作用中の初期のカスケードを視覚化し、定量化するための顕微鏡ベースの技術について説明します。

要約

哺乳動物の体は、病原体の侵入から身を守るために役立つメカニズムの様々な層が装備されています。このような好中球、樹状細胞、およびマクロファージなど- -免疫系のプロフェッショナル食細胞が検出され、食作用1を介して、このような病原体の侵入をクリアする生得的な能力を保持します。食作用は、細胞表面2、3における膜の再編成とアクチンリモデリングの振り付けイベントを伴います。食細胞が正常に内在し、食作用のすべての段階が満たされた場合にのみ、外来分子を根絶します。これらのステップは、認識し、細胞表面に存在するパターン認識受容体（PRR）によって病原体の結合は、粒子を取り囲むようにアクチンに富む膜状の突起（偽足）を介して貪食カップの形成、およびファゴソームの切断がファゴリソソームの成熟が続くことが含まれますで結果病原体3、4の殺害。

食作用の様々な段階のイメージングと定量化は、この細胞過程の分子機構を解明するためのインストゥルメンタルです。本原稿は、食作用の異なる段階を研究するための方法を報告します。私たちは、結合、貪食カップ形成を可視化し、定量化するための顕微鏡ベースのアプローチを説明し、食細胞によって微粒子の内部。食作用が起こると食細胞上の生得的な受容体が0.5μmよりも大きい標的粒子上のリガンドに遭遇したとき、私たちはここに提示アッセイは、病原性真菌カンジダ・アルビカンスなどザイモサンなどの他の粒子とのIgG被覆ビーズの使用を含みます。

概要

例えば、細菌、ウイルス、真菌などの病原体への連続暴露にもかかわらず、私たちの体はよく感染に対する保護を提供する免疫機構が装備されています。自然免疫系は、侵入する病原体に対する防御の第一線であると認識し、外国人のターゲットを内在食細胞に主に依存しています。

食作用は、0.5ミクロンより大きく、不要な粒子の飲み込みを含む進化的に保存された細胞プロセスです。食細胞は、飲み込み3の前に、病原体上に存在する病原体関連分子パターン（PAMP）を認識することを可能にする細胞表面に（また、パターン認識受容体のPRRとして知られる）は、免疫受容体の広い範囲を表します。結合病原体は、細胞表面での受容体のクラスター化が続き、食作用カップの形成をトリガします。これは、周りに突出しているアクチン駆動膜リモデリングをもたらしますターゲットは、最終的にそれを包むとピンチオフする離散ファゴソーム液胞2,5を形成します。ファゴソームは、その後成熟し、ファゴリソソーム6を形成後期エンドソームとリソソームとのその後の融合によって酸性化。

食作用は、受容体媒介とアクチン駆動型のイベントとして記載されているが、このプロセスはまた、ホスホイノシチド（主任研究者）とスフィンゴ脂質7、8などのプラズマ膜を構成する脂質の空間的・時間の変更に依存しています。アクチン重合を貪食カップの基部にホスホイノシトール-4,5-二リン酸（PI（4,5）P 2）の局所的蓄積によって決定されているが、アクチン脱重合は、（PI（4,5）Pの変換に依存します2にするホスホイノシトール3,4,5-をビホスフェート（PI（3,4,5）P 3）3、9。両方の修正ターゲットの周りの偽足の成功延長前者リードとして不可欠であり、後者は、食細胞10の細胞質ゾル中の粒子の沈降を可能にします。

貪食する能力を有する細胞は、マクロファージ/単球、顆粒球/好中球のような専門の貪食細胞、および繊維芽細胞および上皮細胞11として樹状細胞（DC）またはノンプロ食細胞、のいずれかです。プロの食細胞によって行われる食作用は病原体に対する自然免疫と適応免疫応答の調整を担当している間、すべての食細胞によって行われる食作用は、組織維持およびリモデリングにおいて中心的な役割を果たしています。プロフェッショナル食細胞は、適応免疫系のリンパ系細胞にも存在する抗原を巻き込むと病原体を殺すが、ありません。従って、これは、につながる、炎症性サイトカインの放出およびリンパ系細胞の係合に寄与します感染12の成功封鎖。

従来の生化学的手法は、このような翻訳後修飾とタンパク質との間の様々な高親和性の関連付けなどの食作用中に異なる細胞過程の分子機構に関する知識を得るに尽力してきました。しかし、従来の生化学的方法を用いて、食作用事象の空間的および時間的動態に関する情報を得ることは困難です。ライブセルイメージングだけでなく、私たちは時間に敏感な方法で細胞イベントを監視することができますだけでなく、単一細胞レベルでの情報を得るために私達を可能にします。ここでは、食作用の異なる段階を調査するため、並びに、共焦点顕微鏡を使用して時空間的に全体のプロセスを分析する方法を記載します。

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プロトコル

DC2.4およびRAW 264.7細胞株の作製

注：マクロファージ様細胞株RAW 264.7及び樹状細胞株DC2.4両マウス起源であり、以下の条件が細胞を増殖するために使用しました。

  1. 5％CO 2の加湿インキュベーター中で37℃、10％不活性化ウシ胎児血清（FBS）を添加したDMEM（ダルベッコ最小イーグル培地）でRAW 264.7細胞を増殖させます。
  2. L-グルタミンの代わりにDMEMを補っ使用RPMI（ロズウェルパーク記念研究所）培地を除き、RAW 264.7細胞のものと同様の条件でDC2.4細胞を成長させます。

2.蛍光共役微粒子の調製： カンジダ・アルビカンス 、ザイモサン、IgGをコーティングしたビーズ

  1. カンジダ・アルビカンスの成長
    1. ウリ（2％バクトペプトン、1％を補充したYPD 25mlに凍結グリセロールストックからC.アルビカンス株 SC5314に接種酵母エキス、2％グルコース、一晩30℃で80 / mlのウリジン）。
      注：OD 12の600よりも多くのカンジダ培養物を増殖することは避けてください。
    2. カンジダ・アルビカンスの1ミリリットルを取り、室温で5分間、2000×gでスピンダウン。
    3. 上清を吸引除去し、1mlのPBSでペレットを再懸濁。
    4. 室温で5分間、2000×gで遠心分離することによってペレットを収集します。
    5. 手順を繰り返し2.1.4。
    6. 食細胞の数との関係でカンジダ・アルビカンスの感染多重度（MOI）を計算し、1の部3アンOD 600で説明したように、食作用アッセイを続行すると、1ミリリットル当たり2.5×10 7 カンジダ・アルビカンスと同等です。
      注：カンジダ-BFPの生成は文献13に記載されています。
  2. ザイモサンおよびIgGでコーティングされたビーズの調製
    注：ザイモサンは、βグルカン含有されていますサッカロマイセス・セレビシエ由来の真菌炭水化物微粒子製剤。ザイモサンは、マクロファージおよび樹状細胞における炎症性シグナルを誘発することが知られ、それは13食作用の研究に広く用いられている14、15。
    1. 簡単に言うと、微粒子が含まれているチューブをボルテックスし、1.5mlチューブに実験のための十分な量を分取。
      注：一般的に、我々は（1セルのために、10ザイモサン粒子またはIgGでコーティングしたビーズを追加）1:10を使用します。
    2. 氷冷PBSの1ミリリットルを加え、10,000×gで1分間遠心分離して粒子を収集します。
    3. 上清を吸引し、1mlの氷冷PBSでペレットを再懸濁。
    4. 手順を繰り返します2.2.2-2.2.3
      注：2.2.5ステップまたは使用するまで4℃でチューブを格納するために進んでください。
    5. 回避するために、超音波浴超音波処理器（120 V、50〜60 kHzの）中で10秒間微粒子を超音波処理NYの粒子凝集。

3.食作用

注：食作用は、粒子の表面上のリガンドとのPRRの相互作用を介して食細胞の細胞表面上の粒子の結合から始まる複雑なプロセスです。結合は、アクチンのアセンブリとの接触部位でその関連タンパク質、および貪食カップの形成が続いています。その後のアクチン解体はファゴソームで発生し、粒状の完全な貪食になります。私たちは食作用のさまざまな段階を説明し、以下に。

  1. 結合分析
    注記：この実験の目的は、標的粒子上のリガンドおよび貪食細胞上の受容体との相互作用を伴う食作用の第一段階を監視することです。
    1. それらは、実験時に60〜70％コンフルエントになるように、チャンバースライド中で約5×10 4個の細胞を播種します。 Alternatively、カバースリップ（24または12ウェル形式）またはガラス底の96ウェルプレート上にプレート細胞。 5％CO 2で37℃の加湿インキュベーターで一晩細胞をインキュベートします。
      注：細胞は、血球計または同様の技術を用いて計数することができます。
    2. 10分間10℃のチャンバースライド（またはプレート）を配置します。
    3. 優しくピペットまたはアスピレーターを用いて、各ウェルから培地を除去します。
      注意：チャンバーカバーガラスシステムの各ウェルが小さい慎重にこの手順を実行します。ピペットの先端またはアスピレータの強い気流で細胞を乱すことは容易です。
    4. 細胞培養培地を用いて、蛍光標識された粒子を混合する（上記のように調製しました）。細胞に、（10のMOIで）、蛍光共役ザイモサンまたはラテックスビーズウサギIgG-FITC（1細胞当たり10粒子） カンジダ -BFPを追加します。すべてのセルがカバーされることを保証するためにも1室のために200μlの培地の最終容量を使用してください。
    5. 277でチャンバースライドをスピンダウン10℃で3分間XG。
      注：この遠心分離工程は、微粒子と細胞の間の接触を増加させるのに役立ち、これは、結合プロセスを同期させます。
    6. すぐに5分間、5％CO 2で37℃の加湿インキュベーターにチャンバースライドを転送します。
    7. インキュベーターからチャンバースライドを削除し、メディアを吸引除去します。
    8. 細胞を氷冷PBSで3回洗浄します。
      注：光学顕微鏡で結合していない粒子の存在を確認し、必要に応じてPBSで複数回洗浄します。分析中にバックグラウンドノイズを最小限に抑えるために井戸から結合していない粒子を除去することが不可欠です。
    9. 室温で30分間インキュベートすることにより、PBSで希釈した500μlの4％パラホルムアルデヒド（PFA）を加えることにより細胞を固定。
      注意：このステップは非常に、毒性、腐食性、および潜在的な発がん性物質である4％PFAを使用する必要があります。この液体を使用する際に適切な注意が取られるべきです。また、光からサンプルを保護します。
    10. チャンバー内に500μlのPBSを加えることによって、細胞を洗浄し、溶液を穏やかに吸引除去します。
    11. 二回3.1.9手順を繰り返します。
      注：このステップでは、直前のPBSを除去した後、各バイアルを補充します。
    12. 10分間、PBS中の50mMのNH 4 Clを500μlとインキュベートすることにより固定を停止します。
    13. ステップ3.1.10で説明したように、PBSで細胞を2回洗浄します。
    14. 室温で30分間（PBS中0.1％サポニン、0.2％BSA）結合緩衝液250μLを添加することにより細胞を透過性。
    15. 蛍光共役ファロイジン（：結合緩衝液中で1：500に希釈）を添加することにより染色F-アクチン。室温で1時間細胞をインキュベートします。
    16. ステップ3.1.10で説明したようにPBSで細胞を3回洗浄します。
    17. 共焦点顕微鏡（63X対物レンズ、および402 nmおよび488 nmレーザー）を使用して画像をキャプチャし、ImageJの16を使用して画像を分析。
      注：結合に成功粒子は、食のCuの存在によって特徴付けられます粒子状の接触食細胞（ 図1）サイトのp。ステップ3.2.5を参照してください。
  2. 貪食取り込みアッセイ
    注記：この実験は、共焦点顕微鏡（ 図2）を用いて食細胞による蛍光標識された粒子の完全な内在化を監視するように設計されています。
    1. それらは、実験時に60〜70％コンフルエントになるように、チャンバースライド中で約5×10 4個の細胞を播種します。代替的に、カバースリップ上にプレート細胞またはガラス底の96ウェルプレート（24-または12-ウェル形式）。 5％CO 2で37℃の加湿インキュベーターで一晩細胞をインキュベートします。
      注：細胞は、血球計または同様の技術を用いて計数することができます。
    2. 10分間10℃のチャンバースライド（またはプレート）を保管してください。
      注：冷却はエンドサイトーシスをブロックするためだけでなく、不要な食作用に必要であり、その後同期食作用を有すること。
    3. PERF3.1.3から3.1.5へのORMのステップ
    4. 5％CO 2で37℃の加湿インキュベーターにチャンバースライドを転送し、そして異なる時点インキュベート。 30、60および90分後の感染後に細胞を固定。 C.アルビカンスは、60分後の感染に菌糸を形成し始める観察します。食細胞は、90分8後の細胞死（pyroptosis）を示し始めます。
      注：これは推奨され、最適化は、細胞の種類や粒子状に応じて必要不可欠です。
    5. 3.1.7から3.1.15までの手順を実行します。 ImageJの16を使用して画像を分析します。
      注：成功した取り込みは食細胞の細胞質内部の微粒子を完全に内在化することを特徴とする（ 図2）。このようなファロイジン等の細胞表面マーカーで食細胞を染色すると、細胞の輪郭を描くのに役立ちます。粒子が細胞表面またはCOMPLに結合しているかどうかを決定するために、Zスタックを実行するためにも不可欠ですetely内在化。
  3. 貪食のライブイメージング
    注：このプロトコルでは、我々は、蛍光共役ザイモサンを用いて、食作用の異なる段階を捕捉するために、共焦点顕微鏡の使用を記載しています。我々は安定してmCherryをタグ付きF-アクチン8を発現する樹状細胞株DC2.4、生きた細胞内の繊維状アクチンの分布を示しているバイオセンサーを使用しています。食作用は、アクチン駆動プロセスであるので、このセル内のライブイメージングは、F-アクチンネットワークの動きとダイナミクスをキャプチャするだけでなく、生きた細胞（ 図3、映画1）内の異なる食細胞のイベントを可視化することを可能にするだけでなく。
    1. それらは、実験時に60〜70％コンフルエントになるように、濃度のチャンバースライド中で約5×10 4個の細胞を播種します。 5％CO 2で37℃の加湿インキュベーターで一晩細胞をインキュベートします。
      注：細胞は、血球計数器または使用してカウントすることができます同様の技術。
    2. 10分間氷上でチャンバースライドにしてください。
      注：冷却は望ましくない取り込みをブロックするために必要であり、同期食作用を有すること。
    3. 3.1.3から3.1.5への手順を実行します
    4. 37℃に顕微鏡ステージを予め加温し、5％CO 2を用いてチャンバを平衡化。撮影を開始する前に安定させるために、温度およびCO 2のために30から45分を待ちます。
      注：CO 2と温度レベルは食作用のために重要であるので、環境室を平衡化するために、実験前に、顕微鏡用ヒータをオンにすることが重要です。
    5. 37℃、5％CO 2で平衡化した顕微鏡インキュベーターエンクロージャ内の細胞を含むチャンバースライドを置きます。
    6. ライブイメージング17、18を実行します 。
      注：レーザパワーの設定（ゲイン、ピンホールなど ）番目の種類に応じて変えることができます電子顕微鏡と蛍光プローブを使用します。したがって、我々はあなたのライブイメージング17,18のための最適条件のための顕微鏡のマニュアルに相談することをお勧めします。
      1. ライブイメージングのための共焦点レーザー走査顕微鏡（および関連するソフトウェア）を使用します。 1から1.1エアリーユニットのピンホールで63X 1.4NA油の目的を使用してください。
      2. 撮影を開始するには、チャンバースライド上の代表的な地域を見つけるために、明視野を使用していました。次に、ソフトウェア上の位置のオプションをクリックしてフィールドを選択します。 488と582 nmの間の波長を検出するために、582 nmでのビームスプリッタを用いて488 nmレーザーのフィルタセットを使用トラック1にGFPを検出します。
      3. トラック2にmCherryを（RFP）は578 nmでビームスプリッタを使用し、578〜600nmの波長を検出するための最適なフィルタセットを選択します。 50％のレーザー出力と600から700のゲイン出力と488 nmおよび578 nmのレーザーを使用してください。 90分の合計のための画像を30秒ごとに取得します。

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結果

食作用の様々な段階を監視するための顕微鏡ベースの方法が提供されます。 DC2.4細胞による様々な蛍光粒子の貪食中に異なるイベントが示されています。ここに記載された技術を用いて、我々は、食作用の初期段階においてスフィンゴ脂質の役割を調べました。この目的のために、Sptlc2、スフィンゴ脂質生合成経路における第一及び律速段階を触媒する酵素で遺伝的に欠損DC2.4樹状細胞を用いました。野生型細胞と比較して、Sptlc2は- / - DC2.4細胞が有意にセラミド、スフィンゴミエリン及びグルコ8を含むスフィンゴ脂質のレベルが減少しています。 Sptlc2 - / - DC2.4細胞が結合において、ならびにカンジダ・アルビカンス 、ザイモサンおよびIgGのラテックスビーズ8の取り込みに欠陥があります。 図1では、DC2.4細胞における結合の蛍光共役ザイモサン粒子が示されている（切断面を見ますnは詳細については3.1）。 Sptlc2 - / -

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ディスカッション

例えば、マクロファージや樹状細胞などのプロフェッショナル食細胞、飲み込みため、侵入病原体宿主防御システムの重要なコンポーネント食作用を作る排除。このプロセスの間に食細胞は、その細胞表面8、19、20で大規模な膜の再編成および細胞骨格再配列を受けます。よりよいこのダイナミックなプロセスを理解するには、食作用の異なる段階の可視化が不可欠です。ここでは、食作用の様々なステップを監視するために使用された顕微鏡ベースの方法を記載しています。

ライブイメージング技術の主な重要性は、それが分子レベルで、宿主 - 病原体のインタフェースを監視するために顕著な能力を提供することです。微生物感染の重要なステップの可視化を可能にすることにより、ライブイメージングは​​、免疫応答の基本的な性質に重要な洞察を提供します病原体

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開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

私たちは、イメージングのためのMITのホワイトヘッド研究所でウェンディサーモンとケック施設のニッキー・ワトソンに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
&β;-メルカプトエタノールAppliChemA1108
ウシ血清アルブミン(BSA)細胞シグナル伝達技術 9998
DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、乳酸)サーモフィッシャーD3571
メチルスルホキシド(DMSO)サーモフィッシャーBP-231-1
DMEM(ダルベッコ'のミニマルイーグル」Gibco11965
PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline)Corning cellgro21-031-CV
Fetal Bovine serumSigma Aldrich12003C
FITC-coupled IgG-coated latex beadsCayman500290
L-Glutamine 200 mM (100x)ThermoFisher25030081
パラホルムアルデヒド溶液 (PBS中4%))Affymetrix19943 1 LT
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/ml)ThermoFisher15-140-122
Phalloidin-Alexa Fluor 488ThermoFisherA12379
RAW 264.7 cellsATCCTIB-71
RPMI (ロズウェル パーク メモリアル インスティテュート)Gibco61870
SaponinSigma AldrichS7900
トリパン ブルー溶液 (0.4% (w/v) in PBS)Corning cellgroMT25900CI
Trypsin-EDTA (1x) (0.05%)ThermoFisher25300054
Tween 20 Surfact-Amps 洗剤溶液ThermoFisher 85114
Zymosan-Alexa Fluor 594ThermoFisherZ23374
チャンバー付き 1.0 ホウケイ酸カバーガラス システム (8 チャンバー)ThermoFisher155361
Glasstic スライド 10 グリッド付きHycor87144
ジ

参考文献

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