センダイウイルスや遠心分離を用いて血液細胞から誘導多能性幹細胞の生成

サマリー

末梢血単核細胞(PBMC)を人工多能性幹細胞(iPSC)に再プログラミングするためのプロトコルを提案します。形質導入した血液細胞をマトリックスコーティングプレートに遠心分離で播種することにより、浮遊細胞からiPS細胞を成功裏に誘導します。この技術は、PBMCやCBMCなどの細胞に対するシンプルで効果的なリプログラミングプロトコルを示唆しています。

要約

人間の人工多能性幹細胞（hiPSCs）の最近の開発は成熟した体細胞が未分化多能性の状態に戻ることができることを証明しました。 などケラチノサイト、尿細胞、線維芽細胞、初期の実験は、通常、皮膚線維芽細胞を用いて行った：今、再プログラミングは、成体の体細胞の様々なタイプを使用して行われます。しかしながら、これは、患者からの線維芽細胞を得るために侵襲的な外科的処置を必要としました。したがって、そのような血液および尿細胞などの懸濁細胞を、なぜなら一次細胞を得るための利便性の再プログラミングのために理想的と考えられました。ここでは、末梢血単核細胞（PBMC）からのIPSCを生成するための効率的なプロトコルを報告します。遠心分離を使用して、新しい、マトリックスでコーティングされたプレートにシリアルに形質導入したPBMCをメッキすることにより、このプロトコルは、簡単にIPSCのコロニーを提供することができます。この方法はまた、臍帯血単核細胞（CBMCs）にも適用可能です。この研究は、シンプルかつ効率的PROTを提示しますPBMCおよびCBMCsの再プログラミングのためのocol。

概要

幹細胞は、過去数十年の¹のための臨床治療の中で最も魅力的な材料の一つとなっています。幹細胞の魅力的な特性は、多分化能と自己再生する能力です。 1981年、第一の胚性幹細胞（ESC）は、マウス胚²から単離しました。技術は、ヒト胚に適用した場合しかし、それはいくつかの倫理的な問題に直面しました。

博士は山中と彼のチームは、マウスの体細胞から最初の多能性細胞を再プログラムするとき、2006年に、幹細胞のフィールドは、その可能性を取り戻し、関心が^3が再燃^しました。いくつかの定義された因子を送達することによって、多能性幹細胞は、成体体細胞から「誘導され」、したがって、命名された成功した「人工多能性幹細胞（iPS細胞）」を2007年には、この技術は、ESCの正確な特徴を有する細胞を得、ヒト細胞⁴に適用されたが、倫理的な議論のどれも。理論的には、のiPSCsは、任意の個体または患者から得られる任意の細胞型から生成することができます。患者特異的iPS細胞は、疾患の表現型および個々の患者のエピジェネティックな条件をシミュレートすることができます潜在的なツールとして上昇しています。遺伝子編集または病原性の状態を逆にすることができ、他の方法を使用して、患者特異的iPS細胞はまた、オーダーメイド医療⁵で使用することができます。彼らはドナーと同じ免疫アイデンティティを持っているので、また、性IPSCは少ない⁶自動移植より現実作り、免疫拒絶と関連しています。したがって、性IPSCは、疾患のモデリング、薬剤スクリーニング、および再生治療で最も有望なプラットフォームとなっています。これらの利点を考慮すると、最小の細胞源から最短の時間でより純粋な、より高い収率を与えることができる改良されたプロトコルが開発中で常にあります。将来のアプリケーションのための最も効率的なプロトコルを見つけることの1つの主要な考慮事項は、主要な細胞型です。早期IPSC生成プロトの大半colsのは、元のIPSCラインが皮膚線維芽細胞⁴から誘導されたので、接着細胞用に最適化されています。しかし、これらの細胞の単離および調製は、労働集約的です。また、皮膚線維芽細胞の単離は、より広範なアプリケーションのための主要な欠点になることができます侵襲性外科手術手順が含まれています。

したがって、iPS細胞をさらなる使用のために、便利な収集を有する細胞源が必要とされます。それはむしろ低侵襲手順^7-9を介して取得されるので、血液は、理想的な細胞源とみなされます。本研究では、末梢血単核細胞（PBMC）からhiPSCs生成プロトコルに簡単な変更を開発しました。そのようなCD34 +細胞のような特定の細胞型の困難な膨張処理なしで、全血細胞またはPBMCを連続山中因子を含むセンダイウイルスで形質導入した後、遠心分離によりマトリックスでコーティングされたプレート上にプレーティングしました。この方法は、に必要な時間を減少しました形質導入浮遊細胞の付着とは、自分で取り付けることができませんでした再プログラミングされた細胞の損失を減少させました。

プロトコル

倫理に関する声明：本研究プロトコルは、カトリック大学校（KC12TISI0861）の施設内倫理委員会によって承認されました。

血からの単球細胞の1の単離

1. 単球細胞の単離（日-5）
   1. 細胞調製チューブ（CPT）に採血から新鮮な血液の少なくとも10ミリリットルを取得します。
   2. 新しい50mlのコニカルチューブに血液を移し、1で滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でそれを希釈：4の比率。
      注：希釈の比率が高いが、より高純度のために使用することができます。
   3. 新しい50 mlのコニカルチューブに密度勾配媒体の10ミリリットルを追加し、慎重に密度勾配媒体の上に希釈した血液をレイヤー。遠心ブレーキなしで室温（RT）で30分間、750×gで遠心分離します。
   4. 慎重に、新しい50 mlのコニカルチューブにバフィー層を転送管にPBSの30ミリリットルを追加し、細胞を洗浄。
   5. 室温で5分間、515×gで細胞を遠心
   6. PBSを捨て、血液細胞培地の0.5ミリリットルで細胞を懸濁します。
   7. 細胞をカウントし、24ウェルプレートのウェルあたり1×10 ⁶個^の細胞をプレート。蒸発を防ぐために、周囲のウェルにPBSを追加します。
   8. 形質導入の前に5％CO ₂中、37℃で5日間、細胞を安定化させます。細胞を乱すことなく、日3-4に新鮮な血液細胞のメディアの追加0.5ミリリットルを追加します。

センダイウイルス2.伝達

1. トランスダクション（0日目）
   1. 収集し、15mlのコニカルチューブに血液細胞を転送し、血球計数器を使用してそれらを数えます。
   2. 伝達あたり3×10 ⁵細胞を調製し、室温で5分間、515×gで細胞を遠心します。
   3. 吸引により上清を捨て、血液細胞培地の0.5ミリリットルで細胞を再懸濁します。
   4. 非コーティングした24ウェルプレートのウェルに細胞を移します。
   5. 氷の中にセンダイウイルスの混合物を解凍し、suコマンドに追加spended細胞。メーカーの推奨に基づいて細胞にセンダイウイルスを追加します。
   6. 封止フィルムでプレートを密封し、30℃で30分間1,150×gで、それを遠心。
   7. 遠心分離後、5％CO ₂で一晩（O / N）で37℃で細胞をインキュベートします。
2. フィーダーマトリックスへの細胞移動（1日目）
   1. 翌日、コートビトロネクチンとの24ウェルプレート。最終5μg/ mlの濃度のために、PBS中のビトロネクチン液を希釈します。 24ウェルプレートのウェルにビトロネクチンの1ミリリットルを追加し、少なくとも1時間、室温で静置します。使用前にコーティング溶液を除去します。コーティングしたプレートを3日間室温で保存することができます。
   2. コーティングしたウェルに細胞やウイルスを含むすべてのメディアを転送します。
   3. 新鮮な血液細胞のメディアの追加0.5ミリリットルと残りの細胞を収集し、細胞含有ウェルにそれを追加します。
   4. 35℃で10分間、1150×gでプレートを遠心。
   5. セント後rifugation、上清を除去しIPSCメディアの1ミリリットルを追加し、5％CO _2、O / Nで、37℃で細胞を維持します。
3. 第二の細胞移動（2日目）
   1. コートステップ2.2.1で説明したように5μg/ mlのビトロネクチンとの新しい24ウェルプレートのウェル、。各形質導入のためのプレートの1つのウェルを使用してください。
   2. 新たにコーティングされたビトロネクチンプレートに第一プレートから細胞懸濁液を転送します。
      注：必要でない場合、懸濁細胞を廃棄することができます。ステップ2.3に記載の手順では、懸濁細胞を2~3回繰り返すことができます。手順が繰り返される場合は、細胞を採取します。
   3. また、メンテナンスのため、第一プレートのウェルにIPSCメディアの1ミリリットルを追加し、5％CO _2、O / Nで37℃で静置します。
   4. 37℃で付着した細胞を維持し、5％CO _2、新鮮なIPSCメディアを毎日培地交換を行います。コロニーは形質導入後の日14-21に表示されます。
   5. Centrifug10分間1,150×gで35℃で懸濁細胞を含む電子新たにコーティングされたプレート。
   6. 遠心分離後、5％CO _2、O / N中37℃で細胞をインキュベートします。
   7. 翌日、上清を除去し、新鮮なIPSCメディアと交換してください。
      注：ステップ2.3に記載の手順では、懸濁細胞を2~3回繰り返すことができます。ステップが繰り返される場合は、上清中の細胞を採取し、ステップ2.3を繰り返します。
   8. 80％の密集度に到達するまで毎日メディアの変化と付着した細胞を維持します。

3.再プログラムされた細胞のメンテナンス

1. 24ウェルプレートの培養後の早期のメンテナンス
   1. 細胞がコンフルエントとしたら7-10日形質導入後、ビトロネクチンでコーティングされ、60-mmディッシュを準備します。最終5μg/ mlの濃度PBS中のビトロネクチン液を希釈します。皿にビトロネクチンの1ミリリットルを追加し、少なくとも1時間、室温で静置します。
   2. 洗いますPBSで細胞と細胞を剥離するために、PBS / 1mMのEDTAの1ミリリットルを追加します。
   3. 37℃でそれらをインキュベートし、2分間、5％CO _2。
   4. 細胞を採取し、2分間250×gで、室温でそれらを遠心分離します。上清を除去し、新鮮なIPSC培地3mlに細胞を再懸濁。
   5. プレートは、すべて新たにコーティングされた60-mmディッシュに細胞を再懸濁しました。
   6. 細胞が80％コンフルエントになるまで、5％CO ₂中37℃でそれらを細胞に10mMのRhoキナーゼ阻害剤を追加して維持します。
2. コロニーの外観のためのスプリット（サブクローニング調製）
   1. ステップ3.1.2で説明したように、ビトロネクチンでコーティングされた、100-mmディッシュを準備します。
   2. PBSで細胞を洗浄し、細胞を剥離するために、PBS / 1mMのEDTAの1ミリリットルを追加します。
   3. 37℃でそれらをインキュベートし、2分間、5％CO _2。
   4. 細胞を採取し、2分間250×gで、室温でそれらを遠心分離します。
   5. 血球計数器を用いて細胞をカウントし、ディッシュあたり1×10 ⁴細胞を調製。
   6. 250×gで細胞を遠心分離し、室温で2分間。
   7. IPSCメディアの6ミリリットル、再懸濁1×10 ⁴個^の細胞は、コーティングされた100-mmディッシュにそれらをめっきし、メディアに10mMのRhoキナーゼ阻害剤を追加します。
   8. 大きなコロニーが現れるまで一週間、37℃、5％CO ₂で細胞をインキュベートします。
      注：サブクローニングのためのコロニーを維持し、展開します。サブクローニングは、通常、5継代の下で行われています。
3. ソリューションを外すIPSCのコロニーを使用してピッキングコロニー
   1. コロニーピッキング、種子ステップ3.2.7で述べたようにビトロネクチンでコーティングされた、100-mmディッシュで1×10 ⁴細胞、前の週。
   2. ビトロネクチン溶液2mlを添加し、少なくとも1時間室温でインキュベートすることにより、ビトロネクチンでコーティングされ、60-mmディッシュを準備します。
   3. 顕微鏡（40Xまたは100X倍率）を介して観察することにより、マーカーペンを使用して、明確な境界を有するコロニーをマーク。ステップ3.3.2で行われた新しいプレートからビトロネクチン溶液を除去し、6ミリリットルを追加します。IPSCのメディアは、10 mMのRhoキナーゼを補充しました。
   4. 細胞から培養培地を除去し、PBSの3ミリリットルでそれらを洗ってください。
   5. IPSCコロニー取り外し溶液1mlを加え、室温で30秒のためにそれらをインキュベートします。
   6. プレートから溶液を除去し、さらに30秒間、室温で静置します。
   7. P200のピペットを用いて、プレートから200μlの培地を描き、ピペッティングによって標的コロニーを切り離します。新しい100-mmディッシュに飛散コロニーを転送します。
   8. インキュベートし、5％CO ₂中37℃で細胞を維持します_。
      注：これらは10の特徴付けが、少なくとも10継代後に行われた通路に到達するまで、純粋なIPSCのコロニーを得た後、細胞を維持しました。抗体希釈プライマー情報を表1及び2に示されています。

結果

このプロトコルは、血液から単離したPBMCを再プログラムするための簡単な方法を提示します。シリアルめっきおよび遠心分離の組み合わせを使用して、iPS細胞が正常に生成されました。この方法では、性IPSCは、特定の細胞型を単離するか、拡大することなく、全血細胞の少量生成することができます。我々は成功し、小細胞培養プレートにのみ1×10 ⁴個^の細胞からiPS細胞を生成しました。

再プログラミングの前に、血液細胞は、密度勾配培地を用いて単離しました。血液細胞を5日間単離後に形質導入しました。 図1Aは、懸濁細胞のための再プログラミング法のスキームを示します。単離後、PBMCをよく非コートに山中因子を含むセンダイウイルスで形質導入しました。翌日、懸濁細胞は、遠心分離を用いてビトロネクチンでコーティングしたプレート上に採取し、播種した細胞ATT一方非コーティングされたウェルに痛んだが廃棄...

ディスカッション

胚性幹細胞（ESC）は、いくつかの欠点を示しているので、代替ツールの必要性が必要とされました。したがって、山中によって誘導多能性幹細胞（iPS細胞）の開発が国際的なスポットライトの下に来ました。山中は、多能性成体体細胞にのみ4つの遺伝子を添加することによって誘導することができることを発見して以来、約10年間でした。 iPS細胞は、成熟した体細胞から「誘導され」ているので、彼らはかつてのESCに関連する懸念されていた倫理的な問題を回避することができます。 ESCは異なり、性IPSCは、各個体から生成することができます。したがって、それらは、パーソナライズされた医学研究、薬物スクリーニング、疾患モデル、または再生薬のような他の研究において使用され得ます。

最初のヒトのIPSCが正常にこの細胞型の再プログラミング2007の様々なグループに皮膚線維芽細胞から生成されたが、侵襲的な外科的処置は、この一次電池を得ることが必要でした。したがって、それは考えではありませんでした様々な疾患iPS細胞を生成するか、再生医療を設計するためのリットルソース。代替的かつ容易に得られる細胞型は、ケラチノサイト...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Plasticware
100 mmディッシュ	TPP	93100
6 ウェル プレート	TPP	92006
50 ml コーニカル チューブ	SPL	50050
15 ml コーニカル チューブ	SPL	50015
10 ml 使い捨てピペット	ファルコン	7551
5 ml 使い捨てピペット	ファルコン	7543
12 ウェル プレート	TPP	92012
24ウェルプレート	TPP	92024
PBMC Isolation Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03
StemSpan	STEMCELL Technologies	9805	血球培地
CC110	STEMCELL Technologies	8697	血液細胞培地サプリメント (100倍)
iPSC 創製・培養材料
CytoTune-iPSC 仙台リプログラミングキット	ライフテクノロジー	ズ A16518
TeSR-E8 培地	STEMCELL Technologies	5940	iPSC 培地
ビトロネクチン	ライフテクノロジー	ズ A14700
ROCK 阻害剤	Sigma Aldrich	Y0503
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	コロニー剥離液
品質管理 材料
>18 mm カバーガラス	スーペリア	HSU-0111580
4% パラホルムアルジヒド	Tech &イノベーション	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
ウシ血清アルブミン	ベクターラボ	SP-5050
抗SSEA4抗体	ミリポア	MAB4304
抗Oct4抗体	Santa Cruz	SC9081
抗TRA-1-60抗体	ミリポア	MAB4360
抗SOX2抗体	バイオレジェンド	630801
抗TRA-1-81抗体	ミリポア	MAB4381
抗KLF4抗体	アブカム	ab151733
Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG (H+L) 抗体	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) 抗体	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
スライドガラス コーティング	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
クロロホルム	Sigma Aldrich	366919
イソプリピルアルコール	ミリポア	109634
エタノール	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA ポリメラーゼ	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10X TBE バッファー	Life Technologies	15581-044
ローディングスター	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1kb (+) DNAラダーマーカー	Enzynomics	DM003
アルカリホスファターゼ	ミリポア	SCR004
トリスベース	フィッシャーサイエンティフィック	BP152-1	リンスバッファー
塩化ナトリウム	Duchefa Biochemie	S0520.1000	リンス バッファー
Tween-20	BIOSESANG	T1027	リンス バッファー
塩酸	Duksan	1129	リンス バッファー