マウスで輪部幹細胞欠損を作成するための単純な機械的手順

Summary

次の記事では効果的に輪部幹細胞欠損（LSCD）の持続可能なマウスモデルを作成する簡単な、再現可能な技術を提供します。この動物モデルで試験し、輪部幹細胞疾患の治療の有効性を比較するのに有用です。

Abstract

輪部幹細胞欠損（LSCD）は、角膜上皮が結膜に置換された後輪部上皮幹細胞の機能不全または損失の状態です。患者は、再発性角膜欠陥、痛み、炎症、および視力の喪失に苦しみます。

以前は、LSCDのマウスモデルを説明し、2他のモデルと比較しました。目標は、両方の模倣、ヒトにおける表現型とは、疾患の病態生理を研究し、新しい治療法を評価することを可能にするのに十分長く続くLSCDの一貫性のマウスモデルを生成することでした。ここでは、技術は、より詳細に説明します。

回転バリでの電動工具は、角膜表面から錆リングを除去するために、または患者における翼状片のベッドを滑らかにするために設計されています。所望LSCDモデルを作成するのに適した装置です。それはのように、小さな目での作業のために、それが適切になる細かいチップで容易に入手できる、使いやすいツールですマウスインチそのアプリケーションは、眼への不必要な外傷を防止し、多くの場合、化学的損傷モデルの場合と同様に、それは、不要な怪我にはなりません。鈍スクレーパとは対照的に、基底膜と上皮を除去します。このプロトコルでは、輪部領域は2回擦過した後、全体の角膜上皮は、角膜縁から角膜縁に剃毛しました。間質損傷を避けるために、注意が上皮は既に削除された後に角膜表面を磨くしないように注意しました。

Introduction

角膜上皮は角膜の透明性および完全性を維持するために必要とされます。それは、常に角膜や結膜の接合部に輪部の狭いゾーンに存在する上皮幹細胞によって生涯を通じて更新されます。これらの自己再生輪部幹細胞が両方正常および損傷後、角膜上皮の再生に重要な役割を果たしています。これらの幹細胞の部分的または完全な枯渇は、再発性角膜びらん、疼痛、角膜の瘢痕化および血管新生において杯細胞の出現をもたらし、未処理の、角膜失明を残した場合であろう。この条件は、輪部幹細胞欠損（LSCD）として知られており、特発性であり得ます。遺伝性;または起因する化学的または熱的傷害、長期的なコンタクトレンズは着用し、慢性炎症^1-6に取得しました。

LSCDに関する研究は、適切な動物モデルを必要とするだけでなく、模倣、ヒトにおける疾患は、しかし、少なくともで、再現性と持続可能です他の角膜および眼の構造への損傷のマウント。このモデルは、治療を評価し、分子および細胞レベルでの疾患のメカニズムを解明することが必要です。 ¹前に説明したように、回転するバリを使用して、人は簡単上述の利点があり、少なくとも3ヶ月間持続するLSCDのマウスモデルを開発することができます。本研究の目的はLSCDの、簡単な再現性、持続可能なマウスモデルを提示することです。

回転バリが均等に根本的な間質^1を傷つけることなく、上皮を除....

Protocol

動物で行わすべての手順は、視覚研究における動物の使用のためのビジョンと眼科文での研究のための協会に準拠しています。 6ヶ月齢のオス/メスC57BL / 6J野生型マウスへフォーティーン四を使用した：10損傷モデルのためのマウスと対照動物として4（無傷角膜を）。

1.動物の準備

1. 100mg / kgのケタミンおよび5mg / kgのキシラジン混合物の腹腔内注射でマウスを麻酔。麻酔が反映された後、麻酔の深さを確認するためにつま先をつまみます。動物が反応してはなりません。
2. 以前の角膜損傷がないことを確認するために実験を行う前に、スリットランプの下で目を点検します。
3. 眼に1％塩酸テトラカインの低下を植え付けます。 60後 - 90秒、感覚がないことを確認するために、角膜反射をテストします。プロパラカイン塩酸塩0.5％を代わりに使用することができます。
4. 角膜感覚の損失がある場合特定の、静かに目にし、目の周りの毛に5％ポビドンヨードのドロップを置きます。 1分後にドロップを拭き取るか、ツールチップに干渉から髪を防止するために、目の周りの毛の上に広げました。

2.角膜上皮擦過

1. 手術用手袋とガウンを着用してください。無菌回転バリと滅菌ピンセット：必要なツールを準備します。より良い制御のために、曲がったピンセットを使用しています。....

Results

この技術を実行した後ヶ月以内に、角膜の100％が（ 図1A。写真は、明視野下でのスリットランプとコバルトブルーフィルターに接続されたカメラで撮影された）表面的な血管新生を開発しました。目の18/20（90％）において、血管新生は、全角膜表面（ 図1A）が関与します。 2/20（10％）で、血管新生が3 4の角膜の象限で観察されたが、それはまだ、角膜中央に達しました。

LSCDの発展を検証するために、ホールマウント免疫染色は^、1を行いました。このステップは、プロトコルの一部ではなく、目標や興味に応じて変更することができます。 3つのバリエーションはLSCDの指標として考えられていたサイトケラチン（CK）の欠如12、正常な角膜上皮細胞^17、18に特有の中間径フィラメント。 CK8の外観、単純な上皮マーカー 2.......

Discussion

この記事では、LSCDのマウスモデルを作成するための再現性と比較的単純な技術が記載されています。注目に値するこのモデルのいくつかの重要な側面があります。まず、化学物質^11を使用^する機種^、12とは異なり、損傷は主に表面上皮（と基底膜）を含み、下層の角膜実質にまたは他の眼内構造への最小限のダメージで。従って、手順を複雑にし、それがより困難輪部幹細胞を目的とした任意の介入の結果を評価するために行うことができ、どちらも限られた炎症および瘢痕化があります。 Li らによって面白い最近の研究。外科的及び化学的処理の異なる組み合わせで、回転バリの使用を比較^10は 、また、バリがウサギにおいてLSCDを作成するより安全でより効果的であることがわかりました。第二に、モデルは、少なくとも最大3ヶ月間¹安定であると思われます。このモデルを作成するの使用を含みます回転バリ、角膜と連携臨床医に、だけでなく、マウスの創傷研究を行う者によく知られている楽器。鈍いスパチュラを使用して以上、その利点は、傷害がより均一で再現性の.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
回転バリ:AlgerBrush II錆リングリムーバー	Rumex International Co, Clearwater, FL	16-141	0.5 mm バリ他社からも販売可能です。
手術顕微鏡	Wild Heerbrugg, Switzerland	Wild M691
デジタルカメラ	ニコン, タイ
ニコン FS-2 スリットランプ	ニコン, 日本
ポリクローナル抗CK12抗体	Santa Cruz Blotechnology, CA,SC-17101		1:100 濃度
モノクローナル抗CK8抗体	TROMA-I-s, アイオワシティ, アイオワ州	AB_531826	1:50 集中