方法論記事

ナノ粒子神経毒性を決定するために、代理バイオセンサーとしてミクログリア

DOI：

10.3791/54662

⸱

2016年10月25日

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1Minneapolis Veterans Affairs Health Care System, 2Department of Food Science and Nutrition, University of Minnesota, 3Biomedical Informatics and Computational Biology Program, University of Minnesota, 4Minnesota Obesity Center, University of Minnesota

この記事について

サマリー

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Microglia(脳の免疫細胞)は、ナノ粒子が神経毒性にどのように影響するかを決定するための代理バイオセンサーとして使用されます。ナノ粒子に対するミクログリアの応答と、活性化されたミクログリアからの上清への視床下部ニューロンの曝露をアッセイして神経毒性を決定するために設計された一連の実験について説明します。

要約

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大気汚染物質に含まれる

ナノ粒子は、神経伝達物質のプロファイルを変化させ、神経炎症を増加させ、脳機能を変化させることができます。したがって、ここで説明するアッセイは、神経炎症および神経変性疾患におけるミクログリアの役割を解明するのに役立ちます。脳に常在する免疫細胞であるミクログリアを代理バイオセンサーとして使用することで、炎症反応が神経細胞の損傷をどのように媒介するかについての新たな洞察が得られます。ここでは、BV2と命名された不死化マウスミクログリア細胞株を利用し、銀ナノ粒子(AgNP)を標準としてナノ粒子を曝露する方法について説明します。視床下部細胞の生存を手段として、ミクログリアをナノ粒子に曝露する方法、上清からナノ粒子を除去する方法、活性化ミクログリアから上清を使用して毒性を決定する方法について説明します。AgNP曝露後、BV2ミクログリアの活性化は、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて検証されました。上清をろ過してAgNPを除去し、サイトカインおよびその他の分泌因子をコンディショニング培地に残しました。次に、視床下部細胞をAgNP活性化ミクログリアからの上清に曝露し、ニューロンの生存率をレサズリンベースの蛍光アッセイを使用して決定しました。この技術は、ミクログリアを神経炎症の代理バイオマーカーとして利用し、神経炎症が他の細胞種に及ぼす影響を決定するのに役立ちます。

概要

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環境汚染は、具体的には、これらのナノ粒子（NP）の範囲の（1から20 nmの直径）、肥満および血液脳関門1-3を通過する能力に起因する他の神経変性疾患にリンクされています。汚染への高められた曝露は視床下部1を含む中枢神経系の炎症を誘発することができます。これが発生した一つの潜在的メカニズムは、ミクログリア（脳の免疫細胞）4のナノ粒子誘導活性化を介して可能性があります。以前の研究は、時間がかかり、高価であり、脳の健康上のNPの効果を研究するためにin vivoモデルで使用されており、直接NPはミクログリアにどのように影響するかの質問に答えていません。ミクログリアは、脳の微小環境の維持と分泌因子およびサイトカインの放出を介して、周囲のニューロンとの通信などの中枢神経系における多面的な役割を、果たしています。刺激に応じて、ミクログリアは、M1の広報に活性化することができますO-炎症またはM2抗炎症状態。 M2は、インターロイキン-4（IL-4）を含むミク​​ログリア放出抗炎症性サイトカインを活性化しながら、例えば、M1は、ミクログリアは、腫瘍壊死因子α（TNF-α）などの炎症性サイトカインを放出する活性化しました。大気汚染物質の神経毒性を決定するためのインビトロのバイオセンサーにおける当社の代理を検証するために、我々は、20nmの銀ナノ粒子（AgNPs）へのミクログリアの応答を測定しました。この記事の目的は、in vitroミクログリア細胞株は、マウスミクログリアのNPに対応し、どのようにミクログリアの活性化は、視床下部の細胞に影響を与えるをテストするための代理バイオセンサーのマーカーとして使用する方法を説明することです。この検証モデルの長期的な意図されたアプリケーションは、脳の健康と神経変性疾患に実世界の汚染物質の影響をテストすることです。我々は、マイクの暴露後のミクログリア活性化および視床下部の細胞の生存を測定するためのインビトロの 96ウェルフォーマットアッセイの詳細な説明を提供します馴化培地をroglial。

ミクログリア活性化は、免疫吸着アッセイ（ELISA）結合されたTNF-αの酵素を用いAgNP暴露後測定しました。視床下部細胞上の活性化ミクログリアの効果を決定するために、AgNPsは濾過装置を用いて、ミクログリア上清（馴化培地）から削除されました。サイズに基づいてAgNPsを排除しながら濾過装置は、サイトカインを保持します。簡潔には、AgNPsの有無にかかわらず処理されたミクログリアからの上清を、収集し、フィルタに添加し、そして15分間、14,000×gで遠心分離しました。我々は、次に、視床下部の細胞生存率に対するミクログリア分泌されるサイトカインの影響を決定することができました。以前に5,6に記載されているように馴化培地（サイトカインを含む）への曝露後の細胞毒性はレサズリンベースのアッセイによって測定しました。代謝活性細胞はレザズリンを減少させ、生存細胞7の数に比例した蛍光シグナルを生成します。

NT ">（例えば、またはin vivo実験で共培養、トランスウェルのセットアップのような）他のものよりも、この技術を使用することのいくつかの利点がある。我々のモデルは、直接ミクログリアを活性化し、分泌された因子は、ニューロン8に毒性であるかどうかを決定する能力を提供します現在のプロトコルの使用は、BV2ミクログリアは、このプロトコルは、これらの特定の状況のために最適化されているが、方法があることができる。それに続く応答の決意9（mHypo-A1 / 2と命名）20 nmの直径のナノ粒子で刺激し、そしてマウスの視床下部の細胞を不死化し、不死化ミクログリア誘導細胞死の他のモデルにおいて、または一次ミクログリアおよびニューロンを含む他の細胞型で使用される改変されました。

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プロトコル

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1.ミクログリア細胞培養のメンテナンス

  1. 温かい細胞培地（ダルベッコ改変イーグル培地、DMEM）、37℃、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン/ネオマイシン（PSN）を補充しました。
  2. -80℃での貯蔵から25 - 通路18でBV2ミクログリア細胞の凍結ストックを入手します。急速に37℃の水浴中で細胞を解凍します。
  3. 穏やかに75cm 2のセルへの転送10mLの細胞培養培地を含有するフラスコをベント。
  4. 37℃、5％CO 2中でフラスコをインキュベートします。培地を吸引し、24時間後に、新鮮な培地と交換します。 80％の密集度 - 約70になるまで細胞を増殖させます。

2.カウントおよびめっきセル

  1. 37℃の水浴、暖かいDMEMおよび1×トリプシン-EDTA溶液です。
  2. 吸引細胞からの培地とトリプシンの500μlを添加します。 5分 - 2、37℃でインキュベートします。
  3. スクレーパーを使用して、フラスコから細胞を除去し、5ミリリットルに懸濁DMEMの。 50ミリリットルチューブに3回を70μmのストレーナーを介して細胞を渡します。
  4. 血球計数器を用いて細胞を計数し、10％FBSおよび1％PSNを補充した200μlのDMEMの最終容量で透明底板を壁/ウェル黒色に8,000細胞を播種します。 24時間、37℃で5％CO 2でプレートをインキュベートします。
  5. 古いDMEMを削除し、ミクログリアを餓死血清を1％PSNを補っ温めたDMEM200μlで交換してください。 24時間、37℃で5％CO 2でプレートをインキュベートします。

3.活性化ミクログリア

  1. 別々のチューブ、AgNPs（0.01、0.05または0.1μgの/ ml）を希釈し、車両/ニュートラル制御（クエン酸ナトリウム、0.04ミリモル）の最終作業濃度1％のPSNを補充した無血清DMEMインチ
  2. 各ウェルから培地100μlのを削除し、適切な治療化合物の100μlで交換してください。
  3. 24時間、37℃で5％CO 2でプレートをインキュベートします。

4. Fiの馴化培地をltering

  1. 各ウェルから培地上清の200μLを収集し、収集チューブ（1.5〜2ミリリットルの容量）とフィルタ（10キロダルトンの分子量カットオフ）に移します。
  2. 室温で15分間14,000×gで遠心分離します。
  3. フロースルー（粒子と上清）を捨て、新しいコレクションチューブにフィルター逆さまに置きます。
  4. 2分間室温で千×gで遠心分離します。
    注：得られた濾過媒体は、（分泌されたサイトカインを含む）6倍濃縮されています。
  5. 10％FBSおよび氷上で1％のPSNと店を補充した新鮮なDMEMで400μlに濃縮物の体積を持参。
    注：約390で特徴的なピークに基づいて、AgNPの濃度を生成し、残留AgNPsを濾過した培地から除去されるようにするには- 420 nmの10。 （ステップ3.1で説明したように0、0.01、0.025、0.05、0.1、および0.2μgの/ mlで）し、濾過簡単に説明すると、フィルタリングされていないAgNPsのアリコートを準備無血清DMEM中にビヒクル対照（クエン酸ナトリウム、0.04ミリモル）。黒に小分けし、ろ過サンプルおよび標準の50μlを透明底板を壁。分光光度計を使用して、390での吸光度を測定 - 410 nmおよびAgNPの濃度曲線に測定値を比較します。濾過したサンプルは、ビヒクルコントロールサンプルと同じ吸光度値を使用している場合、残留AgNPsが除去されると仮定することができます。
  6. 市販のキットからの指示に従って、TNF-αの分泌を決定するために濾過した培地の半分を使用してください。

5.視床下部細胞培養のメンテナンス

  1. 暖かいDMEM細胞培養培地は、37℃に10％FBSおよび1％PSNを補充しました。
  2. 80℃で保存された25 - 視床下部の凍結ストック（mHypo-A1 / 2）通路18の細胞を取得します。急速に37℃の水浴中で細胞を解凍します。
  3. 穏やかに75cm 2のセルへの転送10mLの細胞培養培地を含有するフラスコをベント。
  4. CO 2 5％でフラスコをインキュベート 37℃。培地を吸引し、24時間後に、新鮮な培地と交換します。 80％の密集度 - 約70になるまで細胞を増殖させます。

6.視床下部の細胞毒性を決定します

  1. 暖かいDMEMと37℃の水浴中で1×トリプシン-EDTA溶液。
  2. 視床下部細胞から培地を吸引し、トリプシンの500μlを添加します。 5分 - 2、37℃でインキュベートします。ステップ2で前述したようにスクレーパーを用いてフラスコから細胞を除去します。
  3. 血球計数器を用いて細胞を計数し、10％FBSおよび1％PSNを補充した200μlのDMEMの最終容量で透明底板を壁/ウェル黒色に5,000細胞で視床下部の細胞をプレートし、37℃で5％CO 2で一晩インキュベート。
  4. マルチチャンネルピペッターを使用して、古いメディアの100μlのを削除し、1倍の最終濃度になるように、濾過し、濃縮馴化培地を100μlを追加します。
  5. 24時間、37℃で5％CO 2でプレートをインキュベートします。
  6. 22を追加します。1;レサズリン試薬のリットル、37℃で5％CO 2で20分間静置します。
  7. マルチ分光光度計、記録蛍光（560nmのEX / 590 nmのEM）を使用して細胞生存率を測定しました。相対蛍光単位（RFU）として結果を報告します。

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結果

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私たちは、上記のプロトコルを使用してナノ粒子に脳の反応のための代理バイオセンサーとしてそのミクログリアの機能を示します。我々の結果は、下流の神経細胞死に対するミクログリアの活性化の毒性作用の測定を含む。 図1は、ミクログリアを活性化し、分泌されたサイトカインは、視床下部ニューロンの生存率を低下させるかどうかを判断するためのプロトコルのワークフローを示しています。 TNF-αの分泌が大幅にAgNP露出（ 図2）以下に増加しました。視床下部ニューロンはAgNP-活性化ミクログリアから馴化培地にさらされている場合には、細胞の生存率が有意（ 図3）が低減される。 図4 AgNPsがミクログリアを活性化し、視床下部細胞死に貢献する潜在的なメカニズムの概要を説明します。

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ディスカッション

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最近の研究では、環境への曝露が肥満やその他の神経変性疾患の一因となることが裏付けられています 11,12。ただし、以前の研究で使用された手法は時間と費用がかかります。経済的考慮事項、生理学的に関連する送達システム、 in vivo 動物モデルの広範な使用による倫理的問題、および調査結果を有意義な健康勧告に変換することの難しさは、NP誘発性神経毒性の研究の進歩を妨げている主要な課題の一部です 13。したがって、 in vitro ミクログリア代理バイオセンサーの使用は、神経毒への環境曝露に不可欠なツールとなっています 14。上記の方法では、AgNPなどのナノ粒子がミクログリアをどのように活性化し、神経毒性を誘発するかを決定する直接的な方法を提供します。細胞は固定または溶解されていないため、遺伝子発現やウェスタンブロットなどの他の下流アプリケーションをミクログリアまたはニューロンに対して実行できることに注意する必要があります。TNF-α ELISAの実行に加えて、上清を使用して、刺激されたミクログリアからの一連のサイトカインおよび分泌因子を...

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開示事項

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著者には開示すべき矛盾はありません。

謝辞

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この作業は、米国退役軍人省BLR&D IK2 BX001686(TAB)と、ミネソタ大学ヘルシーフーズ、ヘルシー・ライブズ・インスティテュート(CMD、JPN、TABへ)およびミネソタ退役軍人医学研究教育財団(TABへ)からの助成金を受けました。BV2細胞株を提供してくださったPhilippe Marambaud博士(Feinstein Institute for Medical Research、ニューヨーク州マンハセット)とWeihua Zhao博士(メソジスト病院、ヒューストン、テキサス州)に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
細胞/試薬
マウスミクログリア細胞株(BV2)Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy)ATL03001
成体マウス視床下部細胞株mHypoA-1/2 セルティオンズ・バイオシステムズ(株)CLU172
ダルベッコのモディファイドイーグル」s MediumInvitrogen10313-039
ウシ胎児血清 PAA LabsA15-751
ペニシリン/ストレプトマイシン/ネオマイシンサーモフィッシャーサイエンティフィック15640-055
トリプシン-EDTAサーモフィッシャーサイエンティフィック25200056
銀ナノ粒子 (20 nm)Sigma-Aldrich730793

PrestoBlue 細胞生存率試薬		InvitrogenA13262
マウス TNF-&アルファ;ELISA Max DeluxBiolegend430904
LipopolysaccharideSigma-AldrichL4391
クエン酸ナトリウムSigma-AldrichS4641
Name企業名カタログ番号Comments
>Equipment
96 W 光学ボトムプレート、ブラックポリスチレン、細胞培養処理済み、蓋付き、滅菌済みサーモフィッシャーサイエンティフィック165305
アミコン ウルトラ0.5 遠心フィルターユニット、ウルトラセル-10 メンブレン付きEMD ミリポアUFC501008
SpectraMax M5 マルチモードマイクロプレート分子デバイスM5
ファルコン 50 ml 円錐形遠心分離機チューブコーニング、Inc
14-432-22
ファルコンセルストレーナー70 μmCorning, Inc08-771-2
卓上遠心分離機 5430Eppendorf22620560

参考文献

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BV2 TNF ELISA

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