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方法論記事

固定における減数分裂Iのイメージング前中期および中期のための技術

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DOI:

10.3791/54666

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2016年10月31日

 , 
1Waksman Institute, Rutgers University, 2Department of Genetics, Rutgers University

この記事について

サマリー

成熟したショウジョウバエ卵子の収集、調製、イメージングのためのプロトコールを提示します。これらの方法により、減数分裂中の染色体の挙動と紡錘体の組み立てと機能の視覚化が可能になります。

要約

ヒト卵子における染色体分離はエラーを起こしやすく、流産や先天性欠損症の主な遺伝的原因である異数性を引き起こします。モデル生物由来の卵子における染色体挙動の研究は、ヒトの卵子の異数性に対する感受性の分子基盤を明らかにするために大いに有望です。ショウジョウバエ・メラノガスターは、100年以上にわたる研究、コミュニティ、技術開発により、遺伝子操作に適しています。しかし、ショウジョウバエの卵子における染色体の挙動と紡錘体の組み立てを可視化することは、主に抗体に侵入できない卵母細胞を取り巻く膜の存在により、特に課題を抱えています。ここでは、減数分裂I紡錘体アセンブリの収集、調製、およびイメージングのためのプロトコルとショウジョウバエ卵母細胞の染色体挙動について説明します。

概要

減数分裂の研究は時々「遺伝学の遺伝学」と表現されます。これは、染色体遺伝と独立した品揃えの基本的な特性が、配偶子産生中の染色体の分離を通じて行われるためです。遺伝の染色体理論の重要なデモンストレーションは、1916年にDrosophila melanogaster1のCalvin Bridgesの研究から来ました。ショウジョウバエに関するこの研究と他の古典的な遺伝学研究は、遺伝学の理解に大きく貢献しました。しかし、ショウジョウバエ卵母細胞の減数分裂染色体の細胞学的検査は困難でした。これは主に、紡錘体が集まり、染色体が分離に向けられる後期ショウジョウバエ卵子の免疫蛍光が、卵子を抗体に侵入できないようにする膜の存在によって妨げられ

るためです。 >jove_content<この課題にもかかわらず、ショウジョウバエの卵子は染色体の挙動と紡錘体の組み立てを研究するための魅力的なモデルであり続けています。これは、ショウジョウバエで利用可能な強力な遺伝ツールによるものですが、染色体が配向し、紡錘体が完全に形成される中期Iで卵母細胞が停止するためでもあります。これにより、細胞分裂のこの重要な段階での多数の卵子の収集と検査が容易になります。さらに、卵母細胞の染色体分配の研究のための遺伝子操作に適した単純なモデル生物は、ヒトのリプロダクティブヘルスの理解に重要な貢献をすることができます。染色体数のエラーは、ヒトの流産と先天性欠損症の主な遺伝的原因です2。これらのエラーの大部分は卵子に起因し、母親の年齢の増加と相関しています。米国では母親の平均年齢が上昇しており、公衆衛生上の大きな懸念事項となっています。

ここでは、ショウジョウバエの卵子の細胞学的検査の方法、および卵子膜の除去方法のデモンストレーションについて説明します。これらの方法は、TheurkaufおよびHawley3、Zouらによって最初に記述されたプロトコルの修正です。4、およびDernburgら。5. また、Gillilandらによって最初に記述されたプロトコルに基づいて、卵母細胞のさまざまな段階を濃縮する方法も含まれています。6.最後に、ショウジョウバエ卵母細胞の薬物治療のための指示を追加します。これらの方法を組み合わせることで、ショウジョウバエにおける卵母細胞の染色体分配と紡錘体の組み立ての細胞学的研究が可能になります。

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プロトコル

注：特に断りのない限り、手順は室温で行われます。温度制御インキュベータは、ハエの飼育のための温度を維持するために使用され、特に断りのない限り、交差しています。

1.準備

  1. ハエを準備します。
    1. 前中期に富む卵母細胞のコレクション。
      1. クリア大人は、健康な、若い株式またはクロス培養から飛びます。 25℃で2日間年齢ボトル。
        メモ：詳細は、いくつかのクロス文化のために必要とされるかもしれないが、一般的に2人の健康のボトルは、十分であろう。
      2. 2日後、ボトルから（この時点では0〜2日齢である）〜100〜300人の女性を集めます。女性が処女である必要はありません。バイアルの側に酵母ペーストのDABを追加し、yeastedバイアルに30人の女性と10〜15人の男性それぞれに配置します。 25℃で2日間年齢バイアル。
    2. 中期に富む卵母細胞のコレクション。
      1. 株式やクロスculturから約100〜300人の女性を集めますエス。バイアルの側に酵母ペーストのDABを追加し、yeastedバイアルに30人の女性（無添加の男性と）それぞれを配置します。 25℃で3〜5日間年齢バイアル。
  2. ソリューションを準備します。
    注：特に断りのない限り、溶液は、室温で無期限に保存してもよいです。
    1. 500mMのHEPES、500mMのスクロース、275 mM酢酸ナトリウム、200mMの酢酸カリウム、50mMのグルコース、6mMの塩化マグネシウム、および5mM塩化カルシウム：修飾ロブの緩衝液（5×）を調製します。 7.4にpHを水酸化カリウム：8水酸化ナトリウム：10 N 11を使用してください。濾過により滅菌します。オートクレーブはありません。 -20℃で保管してください。 〜1×ロブの卵母細胞あたりの準備を200mlを調製するために、必要に応じて解凍します。
    2. 固定ソリューション。
      1. オプション＃1：ホルムアルデヒド/ヘプタンの固定を準備します。 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を加えた150mMのスクロース：固定バッファを準備します。使用するには、687.5μlの固定バッファおよび312.5μlの16％ホルムアルデヒドで新鮮作ります卵母細胞の準備あたり。
        注意：ドラフト内でホルムアルデヒド溶液を使用しながら、手袋を着用してください。機関のガイドラインに従って廃棄処分してください。
      2. オプション＃2：ホルムアルデヒド/カコジル酸固定を準備します。修正ミックスを準備：250mMのスクロース、100mMの酢酸カリウム（pHは7.5）、25 mM酢酸ナトリウム（pH 7.0）、および25mM EGTA（pHは8.0）。使用するには、400μlの新鮮なミックスを修正行い、100μlのカリウムカコジル（1 M、pHは7.2）、および卵母細胞の準備あたり500μlの16％ホルムアルデヒド。
        注意：カリウムカコジルはヒ素が含まれています。
    3. 1×PBS + 1％または0.05％のトリトンX-100：PBS /トリトンX-100を準備します。 4℃で保存。
    4. 1×PBS、（w / v）の0.5％のBSA、および0.1％のTween-20：PBS-Tween 20で、ウシ血清アルブミン（BSA）（PTB）を準備します。一週間4℃で保存してもよいです。
    5. in situハイブリダイゼーション（FISH）ソリューションでは 、蛍光。
      1. 調製20X塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム（SSC）：3 M塩化ナトリウムおよび0.3 Mクエン酸ナトリウムを。
      2. 調製2×SSC、トゥイーン20（SSCT）：2×SSC + 0.1％のTween-20。卵母細胞の準備あたり新鮮な、〜20ミリリットルを加えます。
      3. 準備ホルムアミド溶液：2×SSC、0.1％Tween-20を加えホルムアミド。 1 mlの20％ホルムアミド0.5mlの40％ホルムアミド、および卵母細胞の準備につき2 50mlの％ホルムアミド、新鮮します。
        注意：ドラフト内でホルムアミド溶液を使用しながら、手袋を着用してください。機関のガイドラインに従って廃棄処分してください。
      4. （w / v）の2×SSC、50％ホルムアミド、10％硫酸デキストラン：ハイブリダイゼーション溶液を調製します。 4℃で保存。
    6. FISHプローブ。
      1. 注文HPLC精製を有するオリゴヌクレオチド（配列については表1を参照）、5 '蛍光修飾（ 例えば 、Cy3またはCy5の）を希望します。 50 ngの/μlのでトリスEDTA（TE）で再懸濁します。
        注：すべての回で、露光からオリゴを保護します。

後期ショウジョウバエ卵母細胞の2コレクション

  1. としてプラスチックやガラスに固執する、無傷の膜を有するショウジョウバエの卵母細胞、プレコート1 5ミリリットルチューブとPTBと卵母細胞の準備につき1パスツールピペットの内部。
  2. 二酸化炭素がすべて〜100〜300 yeastedハエを麻酔し、〜100ミリリットル1×ロブのバッファーを含むブレンダーに追加します。パルス3回（約1秒ずつ）。活性化を避けるために、<20分間ロブの中で卵母細胞を保管してください。
    注：別の方法として、卵母細胞が雌から手で解剖することができます。この方法の利点は、以下の女性を必要とすることです。しかし、ケアは、低酸素状態7に関連したアーチファクトを回避するためにわずか数分に二酸化炭素への曝露を制限するように注意する必要があります。
  3. 大きな身体の部分を除去するために、250ミリリットルのビーカーに大きなメッシュ（〜1500ミクロン）を通して濾過。多くの無傷の腹部には、追加のロブのバッファを使用して、メッシュ、再研削材上に残り、再びフィルタする場合。その後、できるだけ大きな体の部分の多くを取り除く、最上層を吸引する、〜2分の決済をしてみましょう。
  4. Fiの250ミリリットルのビーカーに小さなメッシュ（〜300ミクロン）を通してLTER。追加のロブのコーティングされたパスツールピペットを用いて、第1のビーカーのうち残りの卵母細胞を洗浄します。整が〜3分してみましょう。卵母細胞が沈降します。すべてしかし〜10ミリリットルを吸引除去。
  5. コーティングされた5ミリリットルのチューブに収まるように10ミリリットルの限りを注ぎます。 、落ち着く液体を除去し、残りは繰り返してみましょう。追加のロブのコーティングされたパスツールピペットを用いてビーカーのうち、残りの卵母細胞を洗浄します。 〜3-5分間5ミリリットルチューブに定住してみましょう。

3.薬品による治療（オプション）

  1. コート各卵母細胞の準備のためのPTBと第2の5 mlのチューブ。各卵母細胞分取（ 表2）のために1ミリリットルロブのそれぞれに適切な溶媒（対照）または薬剤を追加します。
  2. 第二のコーティングされた5ミリリットルチューブに分割した卵母細胞。沈降は、液体を除去し、1チューブ及び第二のチューブに1ミリリットルロブのプラス薬物に1ミリリットルロブのプラス溶剤を追加してみましょう。薬物治療（ 表2）のための適切な時間のために章動させます。 Lらが落ち着きます。

4.固定

  1. 吸引し、オフすべての液体とすぐに1ミリリットル修正を加えます。
  2. オプション＃1：ホルムアルデヒド/ヘプタン固定（固定緩衝液+ 5％ホルムアルデヒド）。
    1. ニューテーター上で2.5分間固定してください。 1ミリリットルのヘプタン及びボルテックス1分を追加します。 〜1分で沈降してみましょう。
    2. すべての液体を除去し、その後PBS 1X 1ミリリットルを追加します。ボルテックス30秒。 〜1分で沈降してみましょう。
    3. すべての液体を除去し、次いで1×PBSでチューブを埋めます。
      注：卵母細胞は、直ちに使用するか、または室温で数時間ニューテーター上で維持することができます。
  3. オプション＃2：ホルムアルデヒド/カコジル固定（ミックスプラス8％のホルムアルデヒド及び100mMのカコジルを修正）。
    1. ニューテーター上で6分間固定してください。 2分の決済をしてみましょう。液体を除去し、次いで1×PBSでチューブを埋めます。
      注：卵母細胞は、直ちに使用するか、または室温で数時間ニューテーター上で維持することができます。

5.取り外し膜（「ローリング」）

  1. コーティングされたパスツールピペットを用いて、スライドガラスのつや消し（サンドブラスト）部分に〜500〜1,000卵母細胞を追加します。鉗子を使用して、すべてのボディパーツや異物を取り除きます。卵母細胞を乾燥させないでください。必要に応じて1×PBSを追加します。
  2. すべての膜が除去されるまで（卵母細胞全体にカバースリップの端をドラッグすると、最も効果的に機能します。）卵母細胞およびそっと「ロール」卵母細胞の上にカバースリップを置き、定期的に必要に応じてより多くの1×PBSを追加し、顕微鏡下で進行状況を確認します。あまりにも多くの圧力が卵母細胞を破壊するように注意してください。
    注：唯一の免疫蛍光のために、（または免疫蛍光なし）FISHについては、ステップ6に進み、ステップ7に進みます。

ショウジョウバエ卵母細胞の6抗体染色

  1. 抽出とブロッキング
    1. 〜15ミリリットルのPBS / 1％トリトンX-100を含む15ミリリットルコニカルチューブに巻かれた卵母細胞を洗浄します。無未満1.5時間この溶液を超えない2時間で章動卵母細胞。このステップでは、抗体の浸透を可能にします。
    2. 卵母細胞は、〜2分に解決しましょう。 PBS / 0.05％トリトンX-100を追加し、できるだけ多くの膜と一緒に液体を削除します。
      注：膜は、圧延卵母細胞よりも遅いセトリングします。
    3. 卵母細胞は、〜2分に解決しましょう、その後、液体のすべてが、〜1ミリリットルを削除します。転送卵母細胞を1.5 mlチューブを卒業し、残りの液体を除去します。 1時間ブロッキングし、うなだれるのために1ミリリットルPTBを追加します。
  2. 抗体染色
    1. 胚に対する二次抗体の予備吸収。
      注：この手順は、ショウジョウバエのタンパク質との非特異的抗体相互作用からバックグラウンド染色を排除します。
      1. 典型的な手順8あたりのショウジョウバエの胚（〜25μl）を収集し、固定します。 -20℃のメタノール中で保管してください。
      2. 胚からメタノールを除去、800μlのメタノールを加えた200μlの1×PBSを追加し、15分間うなだれます。上清の500μLを削除し、500μlの1×PBSと交換。その後、15分間章動させます。 （洗浄の〜1時間の合計）を2回繰り返し、その後、PTBでフィニッシュ。
        注：胚はすぐに使用するか、または室温で数時間ニューテーター上で維持することができます。
      3. （最終容量は300μlのであろうことを念頭に置いて、ステップ7.4を参照してください。）、液体を除去卵母細胞プレップあたり200μlにPTBで記入し、適切な希釈で蛍光標識された二次抗体を追加章動4℃で一晩（望ましいです）または3〜4時間、室温で。
        注：前吸収抗体は、ステップ6.2.4で使用されます。
        注：蛍光抗体が追加された後、できるだけ多くの暗闇の中でサンプルを保管してください。
    2. 、卵母細胞から液体を除去する300μlにPTBで記入し、適切な希釈で一次抗体を追加します。 4℃での章動一晩（望ましい）または3〜4時間、室温で。
    3. 洗浄は、1ミリリットルPTBで15分間、4回ずつ卵母細胞。
    4. 削除します卵母細胞からの液体、胚（プレ吸収二次抗体）からの上清200μlを添加します。その後、300μlにPTBでいっぱい。 3〜4時間（好ましく）または4℃で一晩、室温で章動させます。
    5. 1ミリリットルPTBで15分間、一度卵母細胞を洗浄し、液体を除去。その後、7分間0.5μlのヘキスト33342と500μlのPTBとうなだれるを追加します。
    6. 1ミリリットルPTBで15分間ずつ二回卵母細胞を洗ってください。
      注：卵母細胞は直ちにスライド上に取り付けられてもよいし、撮像のための準備ができるまで4℃でPTBに格納されてもよいです。

7. FISH（上記の手順5から続けます）

  1. 〜15ミリリットル2倍SSCTを含む15ミリリットルコニカルチューブに巻かれた卵母細胞を洗浄します。卵母細胞は、〜2分に解決しましょう。できるだけ多くの膜と一緒に液体すべてが、〜0.5ミリリットルを削除します。
    注：膜は、圧延卵母細胞よりも遅いセトリングします。
  2. 転送は、0.5 mlチューブに卵母細胞および残りの液体を除去します。続いて500μlのを追加および削除20％、40％、および50％ホルムアミドの溶液を、各溶液中に10分間章動。
    注：卵母細胞は、ホルムアミドの割合が高いと遅く沈降します。
  3. 500μlの50％ホルムアミド溶液を加えた後、液体の削除、および1〜5時間、37℃でうなだれます。
    注：インキュベーション時間が長いほど、より良いプローブの浸透につながります。
  4. これ以上の100〜よりμlの卵母細胞を残して、液体を除去し、36μlのハイブリダイゼーション溶液を加えたプローブの2μlの（50 ngの/μL）と水の2μlあるいは2 番目のプローブ（ 表1）の2μlを添加します。
  5. 一晩37℃の水浴中でインキュベートし、続いて3分間（FISHのみ）または20分間（FISHプラス免疫蛍光法）のために80°C、91°Cでインキュベートします。
    注：これらの手順は、サーモサイクラーで行うことができます。
  6. 液体を除去しないでください。 500μlの1時間、37℃で50％ホルムアミド溶液と、うなだれるを追加します。
  7. 、液体を除去、沈降をしてみましょう500μlの50％ホルムアミド溶液を加え、1時間37℃でdはうなだれます。
  8. 落ち着くしましょう、液体を除去、500μlの20％ホルムアミド溶液を添加し、10分間室温でうなだれます。
  9. 500μlの2×SSCT（沈降が、その後、液体を追加し、数回転倒、繰り返しを削除しましょう。）が沈降してみましょう、液体を除去し、4時間500μlのPTBとうなだれるを追加で3クイック回の洗浄を行います。

8.抗体染色FISH後

  1. 、卵母細胞から液体を除去する300μlにPTBで記入し、FITCにコンジュゲート10μlの抗αチューブリン抗体を追加します。あるいは、他の抗体は、上記のプロトコルに従って、使用することができます。室温で一晩章動させます。
  2. その後、7分間0.5μlのヘキスト33342と500μlのPTBとうなだれるを追加し、液体を除去し、500μlのPTBとの15分間に一度卵母細胞を洗浄します。
  3. 500μlのPTBで15分間ずつ二回卵母細胞を洗ってください。
    注：卵母細胞は直ちにスライド上に取り付けられてもよいし、準備が整うまで4℃でPTBに格納することができますイメージング。暗闇の中で卵母細胞を蛍光抗体が追加された後、可能な限りにしてください。
繰り返し名前 染色体 オリゴ配列*
359 バツ GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC
AACAC 2 AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC
ドデカ 3 CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT
1.686 2 + 3 AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG
AATAT 4（+ Y） AATATAATATAATATAATATAATATAATAT
*エリック・ジョイス、パーソナル通信、サリバンらから他の配列から359の配列。8

表1： ショウジョウバエ 動原体繰り返し のためのFISHプローブ 。

ドラッグ 溶媒 ストック濃度 最終濃度 治療の時間 効果
コルヒチンエタノール 125 mMの 150μM 10分または30分非動原体（10分）9またはすべて（30分）微小管を不安定にします
パクリタキセル DMSO 10 mMの 10μM 10分マイクを安定させますrotubules
Binucleine 2 DMSO 25 mMの 25μM 20分オーロラBキナーゼ10を阻害

表2：薬物治療。

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結果

我々がここで説明している方法は、減数分裂の三段階を表す後期ショウジョウバエ卵母細胞の収集（ 図1）になります。前期中の卵母細胞はカリオソーム（ 図1A）を取り囲む領域におけるチューブリンシグナルの欠如によって可視である、核膜の存在によって区別されます。前中期は、核膜の崩壊時のスピンドル組み立て後の期間です。前中期の間、カリオソームは離れてメインカリオソーム質量（ 図1B）から4 番目の染色体に頻繁に細長くなって、独特の形状を想定しています。前中期は、 ショウジョウバエの卵母細胞が自然に排卵するまで逮捕れる、中期で締めくくり。中期卵母細胞では、カリオソームは丸い形状（ 図1C）に収納しています。

私たちはここメートル記述しますethodsは、前中期または中期のいず...

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ディスカッション

ショウジョウバエの卵母細胞ステージング

細長いカリオソームは、多くの場合、中期卵母細胞から前中期区別するためにカリオソーム形状を使用して、前中期卵母細胞に見られるが問題となる可能性があります。前中期の間、カリオソームは、丸い形状として始まり伸長し、その後卵母細胞が中期停止に近づくにつれて円形に後退します。これは、多くの前中期の卵母細胞は、細長いカリオソームを持っていないことを意味します。突然変異体または薬剤処理した卵母細胞が検討されている場合に加えて、カリオソーム形状は、卵母細胞を上演するために、このメソッドを使用して排除し、影響を受ける可能性があります。これらの段階を区別する他のマーカーは現在利用できませんので、我々は、卵母細胞前中期または中期のいずれかを濃縮するために、ショウジョウバエの雌の産卵の速度を操作するために上記の方法を使用します。理論的根拠は、卵母細胞は、前中期での特定の時間、および時間ARRの不確定金額を費やす場合ということです遅い産卵は中期のために豊かにする一方で、前中期卵母細胞のより高い割合...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

CENP-C抗体を提供してくださったChristian Lehner氏と、FISHに関する推薦をいただいたEric Joyce氏に感謝します。McKim研究室での研究は、NIH(GM101955)からの助成金によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15 mlコニカルチューブ各種
16%ホルムアルデヒドTed Pella、Inc.18505HAZARDOUS; 一度開けたら、1ヶ月後に廃棄する
250mlビーカー各種
5mlチューブ各種
活性ドライイースト各種と混ぜてペーストを作る ピーナッツバターの粘稠度
アンチアルファ;-チューブリン抗体 FITCシグマF2168クローンDM1A
ビヌクレイン2シグマB1186HAZARDOUS
ブレンダー各種
ウシ血清アルブミンSigmaA4161
塩化カルシウム各種
コルヒチンΣ C-9754HAZARDOUS
カバースリップVWR48366-227No. 1 1/2
デキストラン硫酸塩各種
DMSO各種
EGTA各種
エタノール各種
鉗子Ted Pella, Inc.5622モンピンセット高精度グレードスタイル5
ホルムアミドシグマ47670-250ML-F
ガラススライドVWR48312-003
グルコース
目盛り付き1.5mlチューブ各種
HEPESVWREM-5330ベンダーから入手可能
Hoechst 33342各種
塩化
メタノール
大型メッシュ(~1,500μ;m)VWRAA43657-NKのさまざまなフォーマットおよびその他のサプライヤー、12または14メッシュ
の小さなメッシュ(~300&マイクロ;m)スペクトラムラボ146 424さまざまなフォーマット、例えば、146 422または146 486
ニュータさまざまな
パスツールピペットさまざまな
酢酸カリウムさまざまな
カコジル酸シグマC0125危険; あるいは、カコジル酸ナトリウムはカリウムで置き換えることができます
水酸化物各種
酢酸ナトリウム各種
塩化ナトリウムク
エン酸ナトリウム各種
水酸化ナトリウムス
クロース各種
タキソール(パクリタキセル)シグマT1912危険
トリトン X-100フィッシャーPI-28314
トゥイーン 20フィッシャーPI-28320
ボルテックス各種
水に結合デュ各種いくつかのマグネシウム各種各種

参考文献

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