ショウジョウバエの幼虫の樹状樹枝状（DA）ニューロンを用いて、神経細胞の形態形成の研究は、免疫蛍光によって、神経や表皮タンパク質のその場可視化で恩恵を受ける。私たちは、幼虫の体壁から筋肉組織を除去することにより、ダニューロンと周囲の表皮細胞の免疫蛍光分析を向上させる手順を説明します。
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この記事について
サマリー
要約
ショウジョウバエの幼虫の樹状樹枝状（DA）ニューロンは、神経形態形成のメカニズムを調べるための人気モデルです。 DAニューロンは、彼らが免疫蛍光によってタンパク質を発現し、両方のneuronallyと表皮のその場可視化から支配するので、それらの分析の利点表皮細胞と通信して開発しています。免疫蛍光実験のための幼虫フィレットを製造する従来の方法は、ニューロンおよび表皮タンパク質を画像化するためにいくつかの課題を提示し、体壁の大部分をカバーする筋肉組織をそのまま残します。ここでは、 ショウジョウバエの幼虫の切り身から筋肉組織を除去する方法について説明します。このプロトコルは、他の方法で筋肉組織によって覆い隠されているタンパク質の画像化を可能にする信号対雑音比を改善し、DAニューロンの発達を研究するための超解像顕微鏡の使用を容易にします。
概要
ショウジョウバエの幼虫の樹状樹枝状（DA）ニューロンは、それらの遺伝子操作に従順し、それらが画像化することができる容易さに神経発達を研究するための貴重なモデルを提供します。これらの感覚ニューロンは、樹状突起の形態形成1-3を制御する多数の経路の同定に尽力してきました。
ダニューロンの4つのクラス（クラスI - IV）幼虫の表皮を支配します。これらのニューロンは、それらの樹状突起が大きく二次元アレイ4,5を形成することで、基底膜と表皮の間にあります。 4つのクラスのうち、クラスIV DAニューロンは、最も高度に分岐したアーバを持っていると、他の動物の感覚ニューロンのように、これらのアーバーの精緻化は、本質的な要因だけでなく、その開発6-9ため、隣接組織からの合図、特に表皮を、必要とします。
どのような神経細胞や余分な神経事実を決定するための研究ORS免疫蛍光法により、in situでタンパク質の発現を検出する能力の樹状突起の形態形成効果を制御します。幼虫の外側のキューティクルは、抗体に不可解ですが、この障害は、簡単に十分に確立された解剖法10,11を介して幼虫のフィレットの作成によって克服されます。しかし、基底膜のすぐ内側にある体壁筋肉組織は、DA神経細胞と表皮細胞の可視化に向けていくつかの課題を提示します。体壁のほとんどは、非常に神経または上皮組織から発せられる蛍光シグナルを不明瞭線まず、筋肉組織、。これは、実質的に、試料中の信号対雑音比を低下させます。第二に、多くの関連タンパク質は、筋肉組織ならびに神経細胞または表皮で発現させてもよいです。この筋肉由来の蛍光シグナルは、ニューロンまたは表皮からの蛍光シグナルのさらなる曖昧検出する可能性があります。最後に、無顕微鏡技術の進歩サブ回折分解能で試料のワット許可イメージングと神経細胞と周囲の上皮細胞12,13に発現されるタンパク質の局在を見分ける際に特に有用であろう。しかし、雑音比とカバースリップに、試料の近接に強い信号から超解像顕微鏡の利点を介してイメージング。信号対雑音比を減少させることに加えて、幼虫の体壁筋の距離それによって超解像顕微鏡法を用いて達成することができる改善された画像の解像度を制限するカバースリップからのDAニューロン。免疫蛍光分析のための課題に加えて、筋肉組織は、幼虫の体壁内の感覚ニューロンからの電気生理学的記録に対する障壁を提示します。その除去は、したがって、感覚ニューロン14の神経生理学的な操作に利益をもたらします。
ここでショウジョウバエ幼虫の筋肉組織を手動で除去するための方法が記載されています。私たちは、プロトコルPことを実証していますさもなければ筋肉組織によって覆い隠されているタンパク質のermits免疫蛍光イメージングは、クラスIV DAニューロンの可視化のための信号対雑音比を向上させ、より良いDAニューロンにおけるタンパク質及び細胞構造の空間的関係を判別する超解像顕微鏡法の使用を可能と表皮。
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プロトコル
注：筋肉を除去するための手順（ 図1）は、幼虫のフィレットを調製するための前述の方法の変形例です。先行すると筋肉の除去を以下の手順を簡単に概説されており、読者はより詳細な説明については、前の作業10、11と呼ばれています。
冷生理食塩水で1解剖幼虫
- 冷たいHL3.1生理食塩水15または低温のCa 2+を含まないHL3.1生理食塩水11（ 表1）の作業希釈を準備します。皿の底をカバーするだけの十分な冷生理食塩水とシリコーンエラストマー皿に幼虫を置きます。
注：生理食塩水の選択についての議論を参照してください。
| 1×HL3.1生理食塩水（pH7.2）で |
| 5 mMのHEPES |
| 70 mMのNaClを |
| 5のKCl |
| 1.5 mMのCaCl 2を（のCa 2+を含まない生理食塩水のために省略します） |
| 4のMgCl 2 |
| 10mMのNaHCO 3を |
| 5 mMのトレハロース |
| 115 mMのスクロース |
| 4℃でのフィルター滅菌し、店舗 |
| 注：組成を模倣昆虫血リンパ |
冷生理食塩水の表1の組成物。
- 腹側を上にして幼虫を置きます。幼虫の腹面は、前方から後方に実行されている主要な幼虫の気管チューブによって腹部denticalベルトと背側によって同定することができます。前後方向に幼虫を伸ばし、頭と尾をピン虫ピンを使用して皿を解剖シリコーンエラストマー。一方の端で始まり、他方に向かって進行し、腹側正中線に沿って切断するために微細な解剖ハサミを使用してください。
注：この向きはDAニューロンの一般的に研究背クラスタを保持します。 - 幼虫が切り開かれた後、本を開いたかのように解剖皿に四隅を固定します。 CNS、腸、気管などの内臓を取得し、削除するために鉗子を使用してください。フィレットがピンと張ったが、最大限に延伸されないように虫ピンを調整します。
注：筋肉セグメント境界で体壁に固定されています。筋肉は、体壁の大部分をカバーするが、これらは、背側正中線近くの狭い領域に存在しません。
2.筋肉の取り外し
- 筋肉組織が存在しない幼虫の背側正中線の位置を確認します。それは平坦可能向きで筋肉組織の下に挿入することができるように、単一の鉗子の突起を配置します。
- 始まります背側正中線は、セグメントの前方境界付近に、慎重に鉗子と表皮の間の接触を最小限に抑えるように注意しながら、筋肉と表皮の間に鉗子突起をスライドさせます。
- 1アンカーポイントで体壁に筋肉の付着を破壊するために上向きに鉗子を引き出します。関心の残りの半セグメント（複数可）のためにこのプロセスを繰り返します。
注：このプロトコルは、各ダニューロン樹状突起フィールドの後方の保存を最適化します。デンドライトフィールドの前部を維持するためには、各セグメントの後端に鉗子の突起を挿入するのが最善です。 - 幼虫フィレットを最大限にすべての方向に延伸されるように、虫ピンを再調整。
- それはまだ25分間、PBS中の寒い、新たに調製した4％ホルムアルデヒドを使用して、解剖皿に固定されている間にフィレットを修正しました。
- PBSで5回洗浄します。
- コンタを最小限に抑えるように注意しながら、慎重に残りのアンカーポイントから筋肉組織を離れて引っ張るために鉗子を使用して、表皮とCT。
- 固定を解除し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに解剖皿からフィレットを削除します。以前に11を説明したように、すべてのその後の洗浄、ブロッキング、および免疫蛍光染色の手順を実行します。
3.マウント幼虫フィレ
- まずできるだけサンプルは限り平坦にするために微細な解剖ハサミを使用して、頭と尾を削除します。カバーガラスに面したフィレットの内面と退色防止封入でカバースリップ上のフィレットをマウントします。
- カバースリップ上の顕微鏡スライドを配置し、封入剤を分散させるために軽く押してください。以上の顕微鏡スライドを裏返して、マニキュアを使用して、スライド上にカバーガラスをシール。スライドは、少なくとも1ヶ月間-20℃で保存することができます。
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結果
私たちは一緒に膜マーカーで標識されたクラスIV DAニューロンと中隔結合タンパク質網代舟（コーラ）とディスク大（DLG）の同時可視化するために、免疫蛍光実験で信号対雑音比を改善するための筋肉の取り外し手順の有用性を実証しているCD4 - tdTomato。
コーラは、以前に、DAニューロンの樹状突起は、表皮細胞によって囲まれており、DAニューロンの形態形成および機能に関連して研究されてきた多くの識別された表皮の要因の一つは4,6-9,16の樹状突起れるトラクトを特定するために使用されています。ニューロン（赤）を検出するために、抗DsRedを用いた免疫染色および抗コーラ抗体（緑）は、筋肉削除（筋肉オフ）で、筋肉無傷の（筋肉オン）と幼虫の切り身で実施しました。各条件については、クラスIV DAニューロンの樹状突起の後方視野を、レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて画像化しました。画像は、IDを使用して得られました両方の条件のためのentical撮像パラメータ。我々はさらに、筋肉の筋組織からの干渉を補償す...
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ディスカッション
ここでは、プロトコルは、ショウジョウバエの幼虫の切り身から筋肉組織を手動で除去するために記載されています。このプロトコルは、以前幼虫の解剖技術10,11を説明し修正します。幼虫は、シリコーンエラストマー皿に切開した後、背側正中線が配置されています。単一鉗子プロングは、その平坦可能な向きに、慎重に背側正中線近くに、筋組織と表皮との間に挿入されます。鉗子を穏やかに関心のある各幼虫のセグメントに1アンカーポイントから筋肉組織を分離するために上向きに引っ張られます。幼虫のフィレットは、その後、鉗子は、残りのアンカーポイントから筋肉を引き離すために再び使用された後、冷ホルムアルデヒド中で固定されています。
筋肉の除去手順の後固定の全体を実行するために魅力的ですが、私たちは、延伸筋肉は、一度固定し、レンダリング、平坦化されたままと密接にさえアンカーポイントから剥離した後、表皮に並置することを見つけますそれは困難な下にある組織を損傷することなく操作します。さらに、我々の経験では、固定された筋肉組織は脆く、体壁からの完全な除去を防止し、簡単に涙。対照的に、筋...
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開示事項
著者らは、開示することは何もありません。
謝辞
私たちは顕微鏡上で有用な議論のためのゲイリーLaevskyに感謝します。 NIHによって資金を供給されたこの作品は、ERGにR01GM061107とR01GM067758を付与します
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| デュモン#5ピンセット | 電子顕微鏡科学 | 72701-D | |
| マイクロはさみ、8 cm、ストレート、5 mmブレード、0.1 mmチップ | ワールド精密機器 | 14003 | |
| シルガード184シリコーンエラストマーキット | ダウコーニング | 3097358-1004 | 解剖プレート |
| 用 アウステルリッツ昆虫ピン、0.1 mm | ファインサイエンスツール | 26002-10 | |
| Fostec 8375 光源 | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield 退色防止封入剤 | Vector Laboratories | H-1000 | 共焦点顕微鏡用 |
| Prolong Diamond 色あせ防止封入剤 | Life Technologies | P36970 | 構造化照明顕微鏡用 |
| マイクロカバーガラス、22 x 22mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus 顕微鏡スライド, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| マウス抗コラクル抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | 上清, 希釈 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | 上清, 希釈 1:50 |
| ウサギ抗dsRed抗体 | Clontech | 632496 | 希釈 1:1,000 |
| ヤギ抗ウサギ抗体, Alexa Fluor 568 標識サー | モフィッシャーサイエンティフィック | A-11011 | 希釈 1:1,000 |
| ヤギ抗マウス抗体, Alexa Fluor 488 標識 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A-11001 | 希釈 1:500 |
参考文献
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