網膜ミクログリアの貪食機能を評価しますインビボフローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました

Summary

組織の恒常性と不十分な食細胞機能の維持が病態に関与しているためにミクログリアの貪食作用が重要です。しかしながら、 インビボでのミクログリアの機能を評価することは技術的に困難です。私たちは、正確に監視し、生理的な環境の中でミクログリアの貪食の可能性を定量化するためのシンプルでありながら堅牢な技術を開発しました。

Abstract

ミクログリアは、中枢神経系(CNS)の組織に常在するマクロファージであり、損傷したシナプスや細胞、破片、および/または侵入する病原体の食作用を含む、CNS恒常性をサポートするさまざまな機能を果たします。食作用機能障害は、アルツハイマー病や加齢性黄斑変性症などの疾患の病因に関与しており、それぞれアミロイドβプラークとドルーゼンが蓄積します。その重要性にもかかわらず、ミクログリア食作用はin vivoでの評価が困難でした。ここでは、レチナールミクログリアのin vivo食作用の可能性を正確にモニタリングおよび定量化するための、シンプルでありながら堅牢な手法について説明します。以前の方法は、免疫組織化学的染色およびイメージング技術に依存していました。私たちの方法は、フローサイトメトリーを使用して、生きたげっ歯類の眼への硝子体内送達後の蛍光標識粒子のミクログリア取り込みを測定します。この方法は、面倒な組織切片作製、免疫染色、イメージングを伴う従来の方法に取って代わるもので、わずか6時間未満でミクログリアの食作用機能をより正確に定量化することができます。この手順は、さまざまな化合物が生理学的環境でミクログリア食作用をどのように変化させるかをテストするためにも適応できます。この技術は目で開発されましたが、その使用は視覚研究に限定されません。

Introduction

この方法の全体的な目標を正確に評価し、 生体内ミクログリア食作用に定量化することです。ミクログリアは、中枢神経系（CNS）の組織常在性マクロファージです。彼らは、組織恒常性の維持を確実にするために様々な機能を実行します。これらは、免疫監視機構、神経栄養因子の分泌と、極めて重要で、貪食^1が含まれます。ミクログリアの貪食は、無関係なシナプス（シナプス剪定）の食作用およびアポトーシスニューロン^2-4の除去などの脳や網膜の開発中に、いくつかの重要なイベント、内のキーです。また、損傷を受けたまたはアポトーシスニューロンのミクログリア食作用、細胞の破片、および侵入微生物が成人期⁵を介して中枢神経系の恒常性を維持するために必須であることが示されています。最後に、ミクログリア食作用は、アルツハイマー病、年齢関連を含むいくつかの神経変性疾患の病因に関与しています不良または不十分な貪食能は、アミロイドβ（Aβ）斑とドルーゼン、それぞれ^6,7のビルドアップに寄与し得ることが示唆されている黄斑変性症、。

ミクログリア機能はしっかり特に、腫瘍増殖因子β、または細胞 - 細胞相互作用などの可溶性因子によって、それらの微小環境によって調節されます。ミクログリアは、排他的にそれぞれの受容体CD200RとCX3CR1を表現しながら、ニューロンは恒常的に、このようなCD200およびCX3CL1などのいくつかの細胞表面リガンドを発現します。これらの受容体は、それらの細胞内部分に、免疫レセプターチロシンベース阻害モチーフ（のITIM）を含有します。これらの受容体は、神経炎症に寄与することができる、ミクログリアの過剰刺激を防止するために重要である阻害剤。したがって、通常の生理学的条件下で、ニューロンとミクログリアの間の細胞間相互作用は、休止状態にミクログリアを保ちます。組織損傷の間、ただし、ニューロンは、EXPをダウンレギュレートすることができこれらのリガンドのression、ミクログリアの活性化に対する阻害効果を除去します。 （食作用を含む）ミクログリアの機能は、このようにしっかりとその微小環境⁸に連結されています。それにもかかわらず、現在までに、生理的な文脈で、または完全にそのCNS微小環境を複製する方法で、ミクログリアの貪食作用を研究するための標準化アッセイはありません。

いくつかのアッセイは、初代ミクログリアまたはミクログリア細胞株は、標的細胞（ 例えば 、アポトーシスのニューロン）または蛍光標識されたビーズで培養し、インビトロでミクログリアの食作用活性を測定するために開発されてきました。標的取り込みはその後、蛍光イメージング顕微鏡を用いて評価またはサイトメトリー^9-12フローです。これらのアッセイは、薬理学的または遺伝的操作が有益ながら、完全に生体内環境での複合体を複製するために失敗し、ミクログリア食作用に影響を与えることができるかのテストを可能にします。ミクログリア食作用を調べるための間接的な方法in vivoで報告されている。これらは、食作用に関与すると考えられ、分子の染色によって達成されている（ 例えば、CD68）、（ 例えば 、妥協ニューロンまたはシナプス要素）食作用のためにミクログリアとターゲットの物理的な近接性を評価する、または食作用の免疫組織化学的検出によって、ミクログリア細胞内標的（ 例えば^{、Aβ）13-17。}二つの研究は、 生体内でミクログリアの貪食作用を評価するために、より直接的なアプローチを使用してきました。ヒューズらは、頭蓋内経路¹⁸を介して配信ビーズのミクログリアの取り込みを測定するためのイメージング技術を使用しています。シエラらは、定量的に複雑なイメージング技術^4を用いて^、アポトーシス細胞のミクログリア食作用を評価するための洗練された方法を開発しました。しかしながら、これらの方法は、組織標本、セクショニング、画像化、および分析のための複雑なプロトコルを含みます。我々は以前外感光体の食作用を評価するためにフローサイトメトリー分析を使用しています文化¹⁹における網膜色素上皮（RPE）細胞による小胞体セグメント。ここでは、急速にin vivoでのミクログリアの貪食作用の定量的尺度として網膜ミクログリアにより、蛍光標識された粒子の取り込みを評価するためのプロトコルについて説明します。

蛍光標識された粒子の（1）硝子体内の配信、（2）収穫と網膜組織の準備、および（3）流量：私たちはここで説明するプロトコルは、信頼性が高く、定量的な3つの重要なステップですぐ下に6時間で網膜ミクログリア食作用の測定を可能にしますサイトメトリー分析。我々が開発した方法は網膜におけるミクログリア食作用を評価するための堅牢な方法であり、正常に種々の化合物または遺伝子操作は、生理学的設定でこのキーミクログリアの機能を変化させる方法をテストするために使用することができます。 CNSの専門分野として、網膜ミクログリア機能^20を研究するため^の簡単にアクセスできるモデル系です。この方法は、トンで開発されたが彼の目、我々はそれがミクログリアの貪食機能を調査するすべての神経科学者のために役立つことができると信じています。

Protocol

全ての動物は、スクリップス研究所によって確立された倫理ガイドラインに従って処理しました。

注射用材料の調製

1. 33 G針と注射器を滅菌^：C.ο115で分解し、オートクレーブ滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に上昇することによって、注射用の針を準備します。
2. 10分 - 5室温で蛍光標識された粒子を解凍します。 Ca ²⁺ / Mgの²⁺との無菌PBS中に50mg / mlの溶液に再構成することによって、注射用粒子溶液を準備します。
   注：食作用アッセイのために検証された真菌由来のAF488標識粒子は、このプロトコル^21-23で使用されています。最適な取り込みのために、新鮮な、すぐに注射の前に粒子を作製。
   注2：粒子濃度は、それぞれの特定の実験のために最適化することができます。

ビーズ溶液の2硝子体内注射

注：2つのPeopleは、注入を行う人は、マウスを保持し、他の人がロードされた注射器を通過し、プランジャーを押している間は、眼球に焦点を維持できるように、注入を実行するために必要とされます。

1. 20μL/体重10gの用量では100mg / mlのケタミンおよび10mg / mlのキシラジンの腹腔内注射により齧歯類をAnaesthetize。注射の前に、麻酔のレベルを評価するためにつま先のピンチを使用します。
   注：イソフルランは、骨髄細胞の機能に重大な影響を与え、したがって、このアッセイを通して、その使用は^24,25を避けるべきです。
2. 0.5μlに蛍光標識した粒子溶液と負荷針。
3. 手術用顕微鏡（ 図1A-B）の下で横にマウスを置きます。マウスのより良い位置決め用軟質材料、 例えば、ゲルパックを使用します。目はまだ開いていないである、若いマウスの場合は、そっとfissuを作成することにより^、O 45細かい角度を付け鉗子の助けを借りて、まぶたを開きますまぶたが最終的に開きます。そこからスリットに沿って再。
   1. 眼球がソケットから少し持ち上がるように角度をつけ^O 45細かい鉗子の助けを借りて、慎重に、まぶたの周りに圧力をかけます。ちょうど耳の上とその顎によって2本の指で頭を押さえ、静かにソケットから少し目を維持するためにまぶたに並列に皮膚を伸ばします。喉（ 図1B）に近すぎる把握しないように注意してください。
4. 眼球を穿刺するために、（角膜と強膜接続）角膜輪部での注射器の針を挿入します。これは、着色されたマウスでは灰色の円として表示されます。硝子体液の小容積を追放し、その後注入するために、わずかに針を撤回。注射を行う人はそっと片手でマウスや他の針を保持する必要があります。二人はゆっくりプランジャーを押す必要があります。
5. ゆっくりと注射器を後退させます。適用目の保湿は、水和目を維持するためにドロップされます。
6. 齧歯類は、熱パッドの上にケージに回復し、動物を監視するために続けましょう。子犬を扱う場合、それは呼吸と自発的な移動が可能されるまで、他のアラート動物とのケージに動物を返しません。大人で作業している場合、それは胸骨横臥を回復するまで、他のアラート動物とのケージにげっ歯類を返しません。

網膜組織の3収穫

注：蛍光標識された粒子を注射していない目から網膜組織は、フローサイトメトリー分析のためのコントロールとして収集する必要があります。アッセイは、単一の網膜を使用して行うことができますが、最高のパフォーマンスを得るために、2網膜を一緒にプールする必要があります。

1. 蛍光標識された粒子の硝子体内注射後の網膜組織3時間を収集します。
   注：粒子溶液の注射後の時間は、各特定の実験のために最適化することができるが、我々は、3時間の注入後、粒子の取り込みは、O最も層を通して見ることができることを見出しました網膜（ 図1C-D）は、f。
2. 頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。
3. 優しく眼球をproptoseする罰金45 ^O傾斜した鉗子の助けを借りて、まぶたを押圧することにより、眼球を収集します。眼球とプルの後ろに鉗子を置きます。
4. 解剖顕微鏡下で網膜を解剖。 Ca ²⁺ / Mgの²⁺と少量のPBSを含むペトリ皿に眼球を転送します。ペトリ皿の乾燥した場所では、超微細鉗子の先端で角膜輪部に眼球を穿孔。
5. ^O 45細かい角度を付け鉗子の助けを借りて、眼球を持ち、角膜輪部の円周の約半分が切断されるまで、角膜輪部の周りにカットする春のはさみを使用しています。
6. 罰金45 ^O傾斜してピンセットで眼球を持ち、PBSに眼球をもたらします。罰金45 ^O角度を付け鉗子の第二の対と離れて角膜と強膜を引き裂きます。レンズや網膜は私が出てきますntact。
7. レンズや網膜を分離します。網膜を収集およびCa ²⁺ / Mgの²⁺を含むPBSの2ミリリットルを含む5.4ミリリットルポリスチレン試験管に移します。

4.単一細胞懸濁液を準備

1. 製造元の指示にマイナーな修正を加えた神経組織解離キットを使用して、単一細胞懸濁液を準備します。簡単に言えば、ピペッティングP1000ピペットで振とうせずに^37°Cの時に酵素消化を行うことにより、粉砕物網膜。

フローサイトメトリー解析のための5染色単一細胞懸濁液

1. 染色緩衝液200μl中に細胞を再懸濁し（0.2％ウシ血清アルブミン（BSA）及び0.09％アジ化ナトリウムを含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水）とU底96ウェルプレートに移します。 130×gで5分間遠心分離します。
   注：アジ化ナトリウムは、人間や環境に有害です。適切な個人保護具aを使用しますndは、地域の条例に従って廃棄物を捨てます。
2. 上清を廃棄し、シンクの上にプレートを反転。 Fc受容体は、ウェルあたりの抗マウスCD16 / CD32抗体5μgの/ mlを含む染色緩衝液25μl中に再懸濁細胞をブロックします。室温で5分間インキュベートします。
3. 抗マウスLy6C-APC-Cy7を0.5μgの/ mlの、抗マウスLy6G-PE-Cy7ののを0.5μg/ mlの抗マウスのCD11b-AF6502.5μgの/ mlを含有する染色用緩衝液25μlのを追加します。暗所で室温で15分間インキュベートします。
4. 130×gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、プレートを反転。染色緩衝液200μl中に細胞を再懸濁することにより洗浄します。
5. 130×gで5分間遠心分離します。ヨウ化プロピジウム（PI）の0.5μg/ mlを含む染色緩衝液200μlで再懸濁。 1.2ミリリットルマイクロチューブに移します。
6. の前の200μlのPIとプールの0.5μg/ mlを含む染色緩衝液の追加を100μlでウェルを洗浄1.2ミリリットルマイクロチューブ。染色された細胞を300μlの全容積が得られます。

6.フローサイトメトリー分析

1. 従来の3つのレーザ（紫、青、赤のレーザー）を使用して、PE、PerCPを-Cy5.5を、BV510、と非常に明るい蛍光AF488-粒子からの重要な波及によるPI染料を避けます。それは（代わりにPerCPを-のCy5.5チャネルのmCherryをチャネルに）PE標識抗体とPIを可能にするように（ 図2）を使用するように、このアッセイを最適化するために、第四（黄色）のレーザーを使用してください。
   注：黄色のレーザーが利用できない場合、別のチャンネルで死細胞排除染料を使用しています。
2. PI陰性細胞（PI-）上のゲートは、死細胞（ 図2B）を除外します。
3. 、のCD11b陽性細胞（のCD11b ^+）の上にゲートを死細胞を除いた後、これはすべての骨髄細胞（ 図2C）が含まれます。
4. / Ly6G ^{- -}除外するためのCD11b ^+集団 、Ly6C上のゲート内好中球（のCD11b ⁺ / Ly6G ^+）および単球（のCD11b ⁺ / Ly6C ^+; 図2D）。ミクログリア（ ^- / Ly6G ^-ここでのCD11b ⁺ / Ly6Cとして定義されて簡単にするため）にゲーティングした後、2明確な集団が表示されるはずです。負の1と蛍光標識された粒子のための肯定的な1。食細胞は、粒子を取り、したがって、AF488 ^+（ 図2E）であることになります。
   注：Ly6C正またはLy6G陽性の集団は、この染色手法を使用して、粒子の取り込みを測定するために分析することができます。貪食のCD11b ⁺細胞の割合は、食細胞ミクログリアの割合（ 図2F）とよく相関します。これは食細胞、好中球や単球、ならびにミクログリアが含まれますにもかかわらず、フローサイトメトリーの経験のない研究者のために、単独でのCD11b染色で簡単な分析を行うことができます。こののCD11b ⁺ / Ly6C内^- / Ly6G ^{- <}/ SUP>人口、マーカーF4 / 80とCX3CR1で染色することによって判断されるように、これらの細胞は> 99％のミクログリアです。これらのマーカーが追加されますが、私たちの手の中に必要とされないことができます。

Results

ここでは、この方法は、以下の貪食能の化合物および/または遺伝子操作の効果を試験するために適合させることができる（ 図2）を迅速かつ確実に、フローサイトメトリー分析を用いて、生理学的設定において食網膜ミクログリアの数を定量化する方法を記載しますミクログリア（ 図3A、3B）。 （ - 20日生後10）又は成体マウス（ 図3C）、また、若いに使用することができます。リポ多糖（LPS）の様々な用量を腹腔内投与しました。 24時間LPSチャレンジ後、ここに説明されたプロトコルは、網膜ミクログリア食作用機能（ 図3A）を評価しました。 LPSの1.42ミリグラム/ kgの用量は^、26予想されるように、ビヒクル対照（ 図3B）と比較食ミクログリアの割合の統計的に有意な増加を誘導しました。

Discussion

この方法では3つの重要なステップがあります：蛍光標識された粒子の（1）硝子体内注射; （2）収穫および網膜組織の調製。 （3）フローサイトメトリー分析。私たちは、研究者は、我々がここで紹介する方法を実行する前に硝子体内注射を練習することをお勧めします。アルビノマウス（ 例えば 、BALB / c）および着色した溶液（ 例えば、蛍光標識された粒子）が針と注入した溶液を簡単に可視化するために使用することができます。硝子体内注射は挑戦的であり、正しく行われていない場合はバイアスされ、変数の結果につながります。貧しい注入技術に関連した共通の問題は、レンズおよび/または出血や炎症を引き起こすことがあり、網膜の損傷の穿孔です。眼への外傷のリスクを最小限に抑えるために、齧歯類は、最小限の頭の動きと安定した位置にあるべきです。眼球に浸透するには、注射器は、ゆっくりとしませ挿入打撃を避けるために、あまりにも遠くにプッシュする必要がありますレンズ。別の一般的な合併症は、眼の外に注入された材料の逆流です。これを避けるために、プランジャーをゆっくりと押し下げされるべきであり、注射後に、眼球は眼窩の中に後退させるために許される...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
実体顕微鏡	ニコン	生産終了
ハミルトン シリンジ、600 シリーズ	Sigma	26702
33 ゲージ、スモールハブ RN NDL、0.5 インチ、ポイントスタイル 4 - 12o	Hamilton	7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 コンジュゲート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	Z-23373	注射直前に準備
DPBS	コーニング	21-030-CV
デュモン #5/45 鉗子	ファインサイエンスツール	11251-35	2
デュモン #5SF 鉗子	ファインサイエンスツール	11252-00
バンナススプリングハサミ - 3 mm カッティングエッジ	ファインサイエンスツール	15000-10	湾曲
神経組織解離キット –出生後ニューロン	Miltenyi Biotec	130-094-802
5 ml ポリスチレン丸底チューブ	ファルコン	352054
96 ウェル U 底プレート	ファルコン	353077
ステイン バッファー (BSA)	BD バイオサイエンス	554657
CD11b-BV650 抗体	BioLegend	101259
Ly6C-APC-Cy7	BioLegend
Ly6G-PE-Cy7	BioLegend	127617
ヨウ化プロピジウム	BD Biosciences	556463
精製抗マウスCD16/32抗体	BioLegend	101301