ツールは、Helix歪曲、部位特異的DNA鎖間架橋の処理に建築タンパク質HMGB1の役割を研究するために

サマリー

標的DNA損傷は、DNA損傷剤を三重形成オリゴヌクレオチド(TFO)にテザリングすることで達成できます。改変TFOを使用すると、DNA損傷特異的タンパク質会合、およびDNAトポロジー改変は、本明細書に記載の改変クロマチン免疫沈降アッセイおよびDNAスーパーコイリングアッセイの利用により、ヒト細胞で研究することができる。

要約

高移動度グループボックス1（HMGB1）タンパク質は、転写、DNA複製、DNA修復などのゲノム中の多くの重要な機能を調節することに関与する非ヒストン建築タンパク質です。 HMGB1は、標準的なB-DNAへのより高い親和性を有する構造的に歪んだDNAに結合します。例えば、我々は、HMGB1がDNAに結合することがわかった共有結合、DNAの2本鎖をリンクらせんの歪みを引き起こし、未修復のままの場合は細胞死を引き起こす可能性が架橋（のICL）を、インター。それらの細胞毒性ポテンシャルを、いくつかのICL誘導剤は、現在臨床での化学療法剤として使用されます。 ICL形成剤は、特定の塩基配列の環境（ 例えば、5'-TA-3 'ソラレンのための好ましい架橋部位である）を示すが、それらは主に無差別様式でDNA損傷を誘発します。しかし、共有結合的に配列特異的にDNAに結合する三重鎖形成オリゴヌクレオチド（TFO）、にICL誘導剤を結合することにより、方法は、標的DNAの損傷を達成することができます。ここでは、ツールとして使用するために変異レポータープラスミド上のサイト固有のICLを生成するために、共有結合、8トリメチルソラレン（HMT）ソラレン5 '、4'-ヒドロキシメチル-4,5-へ'末端に結合させTFOを使用しますアーキテクチャの変更、処理、およびヒト細胞におけるHMGB1による複雑なDNA損傷の修復を研究します。私たちは、レポータープラスミドにTFO指向のICLを調製するための、およびクロマチン免疫沈降アッセイを用いて、細胞の状況にTFO指向のICLとHMGB1の関連を調べるために実験技術について説明します。また、我々はHMGB1によってソラレン架橋プラスミドに導入超らせん巻きの量を測定することにより、損傷を受けたDNAの特定の建築変更を評価するために、DNAの超らせんのアッセイが記載されています。これらの技術は、TFO指向のICLまたは目的の任意の細胞株における他の標的DNA損傷処理および修復に関与する他のタンパク質の役割を研究するために使用することができます。

概要

三重らせん構造^1-5を形成するため^のトリプレックス形成オリゴヌクレオチドフーグスティーン水素結合を介した配列特異的様式で（のTFO）結合二本鎖DNA。三重技術は、転写、DNA損傷修復、ならびに遺伝子ターゲティング（参考文献^6-8に概説）などの生体分子メカニズムの多様を調べるために使用されています。 TFOは、レポータープラスミド^9,10-の部位特異的な損傷を誘導するために広く使用されています。私たちの研究室などは以前に、プラスミドpSupFG1 ^5,10-12にsupF遺伝子に部位特異的なDNAの間架橋（のICL）を誘導するためにソラレン分子につながTFO、AG30を、使用しています。これらの病変は、共有結合で2本のDNA鎖を架橋として、および未修復のままの場合のICLは、遺伝子の転写を阻止し、DNA複製機構^13,14を妨げることができ、非常に細胞毒性です。なぜなら、それらの細胞毒性ポテンシャルを、ICL誘導剤は、治療において化学療法剤として使用されています癌やその他の病気¹⁵の。しかしながら、ヒト細胞中でのICLの加工及び修復は十分に理解されていません。したがって、ヒト細胞中のICLの処理に関与するメカニズムのより良い理解は、ICLベースの化学療法レジメンの有効性を改善するのに役立ち得ます。 TFO誘発性のICLとその修復中間体は、DNAヘリックスに有意な構造的歪みを引き起こす可能性を持っています。このような歪みは、標準的なB型二重鎖DNA ^16-20よりも高い親和性で歪んだDNAに結合建築タンパク質、その考えられる標的です。ここでは、クロマチン免疫沈降（チップ）ソラレン架橋のプラスミド上のアッセイによって、ヒト細胞中でのICLと非常に豊富な建築タンパク質の結合、HMGB1を学び、ヒトにおいてソラレン架橋プラスミドDNAのトポロジーを調節することでHMGB1の役割を同定し癌細胞溶解物。

HMGB1は非常に豊富かつ普遍的に発現された非彼損傷したDNAに結合するトーン建築タンパク質および標準的なB型DNA ^17-20よりも高い親和性を持つ代わりに構造化されたDNA基質。 HMGB1は、転写、DNA複製、DNA修復^16,21-23などのいくつかのDNA代謝過程に関与しています。我々は以前HMGB1は高親和性²⁰でインビトロで TFO指向のICLに結合することを実証しています。さらに、我々は、HMGB1の欠如はTFO指向のICLの変異原処理を増加し、ヌクレオチド除去修復（NER）補因子^23,24としてHMGB1を同定していることを実証しました。最近、我々は、HMGB1がヒト細胞においてTFO向けのICLに関連付けられており、このような病変への募集はNERタンパク質、XPA ¹⁶に依存していることを発見しました。 DNAの負の超らせんをNER ²⁵によりDNA損傷の効率的な除去を促進することが示されており、我々は、HMGB1はTFO指向ICL含有のPLAに優先的に負の超らせん形成を誘導することを発見しました（非損傷プラスミド基質に対して）、中間基板^16、NER補因子としてHMGB1の潜在的な役割（複数可）のより良い理解を提供します。 ICLの処理は、完全ヒト細胞では理解されていません。このように、本明細書中に記載の分子ツールに基づいて開発された技術およびアッセイは、順番に、がん化学療法レジメンの有効性を改善するために利用することができる薬理学的標的として役立つ可能性がある、ICL修復に関与する追加のタンパク質の同定につながる可能性があります。

ここでは、アガロースゲル電気泳動を変性させることによって、プラスミドDNAでTFO指向ICL形成の効率を評価するための効果的なアプローチが検討されています。さらに、TFO指向のICLを含むプラスミドを用いて、修飾のChIPアッセイを用いて細胞の文脈でICL損傷プラスミドでHMGB1の結合を決定するための技術が記載されています。また、容易な方法は、番目によって導入されたトポロジカル修正を研究します特にヒト細胞溶解物中のICL損傷プラスミド基板上の電子建築タンパク質HMGB1は、二次元のアガロースゲル電気泳動を介して、スーパーコイルアッセイを実施することによって決定されています。説明される技術は、ヒト細胞中でのプラスミドの標的DNA損傷の処理において、DNA修復および建築タンパク質の関与の理解を促進するために使用することができます。

我々は、プラスミドDNA、及びその後のプラスミドチップそれぞれ、DNAのトポロジーを改変病変と会合するタンパク質、およびタンパク質を同定するためのアッセイをスーパーコイルのTFO-部位特異的ソラレンのICLを形成するための詳細なプロトコルを記述する。これらのアッセイは、他のDNA損傷剤、のTFO、プラスミド基質、および目的の哺乳動物細胞株を使用して実行するように変更することができます。実際に、我々はヒトゲノム²⁶内のすべての注釈付き遺伝子内の少なくとも一つの潜在的な固有かつ高親和性のTFO結合部位が存在することを示しています。どうやって我々はムカジー＆バスケス、2016年¹⁶で利用してきたように、これまで、分かりやすくするために、我々は人間のU2OS細胞に特異的な変異レポータープラスミド（pSupFG1）上の特定のソラレン共役TFO（pAG30）を使用するためにこれらの技術を説明しました。

プロトコル

プラスミド基板上TFO指向のICLの調製

1. ^10,11 DNA三重結合緩衝液[50％グリセロール、10mMトリス（pHは7.6）、10 mMの塩化マグネシウムの8μlのソラレン共役TFO AG30と（5μgのプラスミドDNAが良い出発点である）プラスミドpSupFG1の等モル量をインキュベート_2]とのdH ₂ O琥珀色のチューブで40μlの最終体積に。ピペッティングにより完全に混和します。 12時間37℃の水浴で反応をインキュベートします。
2. フルパワー出力を確保するために、UVAランプをウォームアップ。パラフィンフィルム上の三重反応を置き、UVA（365 nM）をランプの下で氷の上にパラフィンフィルムを配置します。ランプと反応の間にマイラーフィルタを配置します。
3. UVAは1.8 J / cm ²の総線量のために照射します。さらなる使用のために4℃でサンプルを保管してください。
   注意：UVA照射との適切な保護メガネや服を着用してください。
4. 再で上記で調製したプラスミド200ngの線形化メーカーを使用して20μlの総容量で締め付け酵素エコ R1は10倍のバッファを供給しました。熱は65℃で20分間、酵素を変性させます。万×gで10分間サンプルをスピンし、4℃で保存します。
5. 50倍のアルカリ性緩衝液[1.5 MのNaOH、50mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）]を準備します。 50ミリリットルのdH ₂ Oにアガロースの0.5 mgの追加アガロースを溶解し、50℃の水浴中に配置する沸騰。
6. 溶解したアガロースの温度がダウンして50℃にした後、50倍のアルカリ性緩衝液1mlを追加し、それを混合し、次いでゲルトレイにゲルを注ぎます。ゲルは使用前に室温で固化するための時間を許可します。
7. 線形化DNAサンプルの20μlに0.5 M EDTAの4μlを添加して、室温で10分間インキュベートします。
8. サンプルに1 kbのDNAラダーに6倍のアルカリ性ゲルローディングバッファー（300mMのNaOHを、6 mMのEDTA、18％（ _の dH ₂ Oでv）の高分子量の多糖類、0.06％ブロモクレゾールグリーン/ワット）を追加します。
   注：これは、6倍のアルカリ性ゲルローディング緩衝液を使用することが重要である、議論を参照してください。
9. ロード低温室でゲル上にサンプルおよびセンチあたり3.2ボルトで一晩、1×アルカリ性緩衝液（12-16時間）で実行します。サンプルがゲルを入力したら、浮動からそれを防ぐために、ゲルの上にガラス板を配置します。
10. 室温で45分間中和緩衝液にゲルを浸漬することにより、サンプルを中和する[1 Mトリス-Cl（pHは7.6）、1.5 MのNaCl、3 M酢酸ナトリウム（pH5.2）]。
11. 室温で1時間、50 mlの水に1％のエチジウムブロマイド（EtBrを）4μlのDNAのためのゲルを染色します。 15分間水で脱色。イメージングシステムを使用してDNAを可視化します。
    注意：EtBrをが強力な変異原であり、皮膚から吸収することができます。 EtBrをとの直接の接触を避けます。

ヒト細胞におけるTFO指向ICL含有プラスミドの2トランスフェクションおよび免疫沈降

1. プレート40万哺乳動物細胞（ 例えば、U2OS Oダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中の60 mmディッシュ当たりsteosarcoma細胞）を24時間トランスフェクションの前に、抗生物質を含まない、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充しました。 5％CO ₂で37℃で一晩細胞をインキュベートします。
2. 水浴中で37℃にトランスフェクション、暖かい増殖培地、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の前に。室温へのトランスフェクション試薬を温めます。
3. で10分間丸底チューブ個別の14ミリリットルで1倍の増殖培地（ミックス1）500μlの1倍速の増殖培地（ミックス2）500μlの中でTFO指向ICL-含むプラスミド2μgのトランスフェクション試薬30μlのインキュベート室温。
4. 上下にピペッティングによりよく混ぜ、2を混合するミックス1を追加します。室温で25-30分間インキュベートします。
5. 温かいPBSで細胞を2回洗浄します。細胞のプレート全体に均等に分配する滴下方式でトランスフェクションミックスを追加します。プレートに増殖培地の1ミリリットルを追加し、2ミリリットルの最終容量をもたらします。私たちを混ぜますLL。 4時間、5％CO ₂で37℃インキュベーターで培養プレートを置きます。
6. 10％FBSを添加し3ミリリットルの成長培地で培地を交換し、16時間さらにインキュベートします。抗生物質を使用しないでください。
7. 約1％の最終濃度になるように、プレート当たり37％の新鮮なホルムアルデヒドの80μlの細胞を処理し、光の不存在下で、室温で10分間インキュベートします。
   注意：ホルムアルデヒドは有毒であり、その安全上の指示に従って処理してください。ホルムアルデヒド暴露は皮膚、眼、気道に害を引き起こす可能性があります。
8. プレートあたり（市販のキットに付属）チルドグリシンの300μLを添加し、5分間インキュベートすることによりホルムアルデヒド架橋をクエンチしました。メディアを取り出し、冷却PBSで2回洗浄し、その後マイクロ遠心チューブにチルド（4°C）PBS 1ml中でこすることによって細胞を収集します。すべての回で氷上でサンプルを保管してください。
9. 5分Aに対して、4℃で遠心分離して細胞ペレットを準備卓上冷却遠心機を使用して13,400×gでのtは。ピペットで上清アウトし、氷上で細胞ペレットを配置します。
10. 均一に1ミリリットル冷蔵（4°C）緩衝液A（市販のキットに付属）にペレットを再懸濁し、氷上で10分間インキュベートします。チューブを反転させて時折混ぜます。細胞をペレット化前と同じように（上記のステップ2.9を参照してください）。
11. 均一に1ミリリットル冷蔵（4°C）緩衝液B（市販のキットに付属）にペレットを再懸濁し、反転させることにより、時々混ぜながら10分間氷上でインキュベートします。以前のように遠心分離により細胞をペレット化（上記のステップ2.9を参照してください）。
12. チルド緩衝液Bは、ミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）の2μlを添加して、10分間室温でインキュベート200μl中、再び細胞を再懸濁。チューブをフリックすることによって時折反応を混ぜます。チューブを氷上に置き、40mMのEDTAを添加することにより、MNase反応を停止します。細胞をペレット化前と同じように（上記のステップ2.9を参照してください）。
13. 100μlの1×クロマチンimmunoprで細胞を再懸濁しプロテアーゼ阻害剤カクテルを補充しecipitationバッファ（チップ）のバッファ（市販のキットに付属）。
14. 薄壁マイクロチューブに再懸濁した細胞を置きます。氷上で20秒間インキュベートした20秒間水浴超音波処理装置上に浮遊させることによって、サンプルを超音波処理します。繰り返し超音波処理は〜800-1,200 bpの断片を生成するために、9回を繰り返します。
    1. 超音波処理したサンプルの20μlにボルテックスでよく3μlの5 M NaClおよび1μlのRNase A.ミックスを追加し、37℃で30分間インキュベートします。続いて、2μlのプロテ​​イナーゼKを追加し、65℃で2時間インキュベートします。 PCR精製キットを用いてサンプルを精製します。 1％アガロースゲル上でサンプルを実行し、EtBrで可視化することができます。
       注：得られたDNAの最大強度は千塩基対で、またはの下でなければなりません。
15. 3つの別々のチューブでは、予め冷却シリコーン処理チューブ内の溶解液の30μlを添加し、その後追加されたプロテアーゼ阻害剤で冷やした1×チップバッファの70μlを添加します。 1μを追加各チューブに、抗免疫グロブリンG（IgG）（陽性対照として）、抗ヒストンH3、または抗HMGB1抗体のG。連続回転と低温室で一晩インキュベートします。
16. 寒い部屋に均一に再懸濁プロテインGビーズ。チューブあたりプロテインGビーズの4μlを添加して、回転と寒い部屋で別の2〜4時間インキュベートします。
17. 磁気ラックを使用して、ビーズをペレット化し、上清を除去します。ペレットにプロテアーゼ阻害剤カクテルと混合し、200μlの1×チップバッファを追加し、回転と寒い部屋で5分間洗浄します。二回洗浄を繰り返します。
18. 高塩1×チップバッファ（70mMのNaClを含む）で一つの追加の洗浄を行います。
19. （市販のキットで供給される）160μlの溶出緩衝液でペレットを再懸濁し、30分間回転させながら37℃でインキュベートします。
20. ビーズをペレット化し、新しいチューブに上清を収集します。 5 M NaClを6μlのプロテ​​イナーゼKの2μLを追加し、65で一晩インキュベート°C。
21. PCR産物精製キットを用いてDNAを精製し、50μlののdH ₂ Oを用いてDNAを溶出
22. 関心領域にプライマーセットを用いてPCR反応を^16（s）を行い、EtBrで染色した1％アガロースゲル上で製品を解決します。

3.超らせんアッセイおよび2次元アガロースゲル電気泳動

1. DNA修復合成バッファを準備します（45 mMのヘペス-KOH、pHが7.8; 70のKCl、7.4のMgCl _2、0.9mMのDTT、0.4mMのEDTA、2mMのATP、20μMのdNTP、3.4％グリセロール及び18μgのウシ血清アルブミン） 。 -80℃で保管してください。氷上で解凍し、40mMのクレアチンリン酸と2.5μgのクレアチンホスホキナーゼを追加し、使用前に。
2. 10倍の超らせんバッファー[500 mMトリス（pHは8.0）、500mMのNaCl、25mMのMgCl ₂を、1 mMのEDTA]を用意し、常温で保存。
3. 完全に1倍で1μlのワクシニアトポイソメラーゼI（5-15 U /μl）を使用して、スーパーコイルプラスミドpSupFG1 DNAの300 ngのを線形化10μlの反応における超らせんバッファー。 37℃で1時間混合物をインキュベートします。
4. HeLa細胞を含まない抽出物^24は、氷上で解凍します。完全にリラックスしたプラスミドに、25μlのHeLa細胞を含まない抽出物とDNA修復合成バッファを追加します。よく混ぜます。ミックスにワクシニアトポイソメラーゼIの追加の1μl加え、37℃で1時間インキュベートします。
5. ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）（1％最終濃度）およびプロテイナーゼK（0.25ミリグラム/ mlの最終濃度）を加えることにより反応を終了させます。 2時間65℃でインキュベートします。
6. 1×トリスホウ酸EDTA（TBE）緩衝液を用いて1％アガロースゲルをキャストします。 DNAローディング色素を追加し、少なくとも4レーン離れてゲル上に直接反応をロードします。トポイソマーを解決するために、室温で1×TBE中の2 V / cmの（次元1）で8-10時間のためのゲルを実行します。
   注：トリス塩基の54グラムを追加することによって、のdH ₂ Oの1 Lで5倍TBEストック溶液を準備します。ホウ酸の27.5グラムと0.5 M EDTA（pH8.0）を20ミリリットル。
7. 1×2リットルを準備3 / mlのクロロキンリン酸とTBE。 20分間この溶液200mlにゲルを浸します。アルミホイルでゲルトレイをカバーしています。
8. 二次元でゲルを電気泳動するために、時計回りにゲル90°回転し、正と負の超らせんを解決するために、1×TBEを含むクロロキンで2 V / cmので4-6時間のためにそれを実行します。
9. ロッカー上で1時間、EtBrでゲルを染色。 15分間_の dH ₂ Oを用いてゲルを脱色し、その後イメージャーを使用してトポイソマーの熱分布を可視化します。

結果

TFO指向ICLの形成はヒト細胞でICL処理の建築タンパク質の役割を調べるために使用されているプラ​​スミドに基づくアッセイ、のために重要です。変性アガロースゲル電気泳動は、TFO指向ICL形成の効率を決定するための容易な方法です。非架橋対照プラスミド（ 図1A、レーン2）と比較した場合TFO指向のICLを保有するプラスミドをアガロースゲルマトリックス（ 図1A、レーン3）を介して、より遅い移動度で移動します。レーン2および3のバンドの濃度定量化（ 図1A）は 、プラスミド人口の約70％がこれらのプラスミド上にTFO指向ICLの形成を示す、（黒い矢印によって識別される）緩徐移動性ゲルを通って移動明らかにする。

人間のU2OS細胞TRからの抽出物に対して行わクロマチン免疫沈降アッセイ対照プラスミド（P）または抗HMGB1抗体で免疫制御（P）領域、（ <...

ディスカッション

そのターゲットに依存TFOの結合親和性に応じて、その標的DNA基質（とまず、適切な緩衝成分（ 例えば 、 _塩化マグネシウム）とTFOのインキュベーション時間：TFO指向のICLの効率的な形成は、二つの重要な要因に依存していますデュプレックス、および使用される濃度）。第二、UVA（365 nm）の照射の適切な用量は、効率的にソラレン架橋を形成します。最適な三重らせん形成は、HPLCまたはゲル精製のTFOを使用することによって達成することができます。 TFOを汚染不純物は、さらに実験結果を複雑にすることができ、不要な架橋生成物、につながる可能性があります。 TFOの複数の凍結融解は、オリゴヌクレオチドの分解をもたらし得るような共有結合5'-HMTのソラレンに添付のTFOの安定性を高めるために、のTFOは、-80℃でアリコートで保存する必要があります。三重鎖形成後の特定の部位（ 例えば、5'-TA-3 'および5'-AT-3'にソラレンをターゲットに事前あり移しソラレン架橋部位を）、ソラレンICL形成は、UVAを照射する必要があります。 1.8 ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5'HMT Psoralen-AG30	Midland Certified Reagent Co., Midland, TX	カスタムオーダー	HPLC (またはゲル) 精製
Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit	Cell signaling Inc.	9003	メーカー推奨のプロトコールは、プラスミドIPではなくクロマチンIPに最適化されています。コントロールIgG抗体とH3抗体、Protein Gビーズとミクロコッカスヌクレアーゼは、メーカーから供給されています。
GoTaq グリーン	プロメガ	M7122	PCR マスターミックス
HMGB1 抗体	アブカム	Ab18256
ウィザードゲルと PCR クリーンアップキット	プロメガ	A9281
クロロキン二リン酸塩	シグマ	C6628-50G	二次元アガロースゲル電気泳動用
EcoRI	ニューイングランド バイオラボ	R0101S
GenePORTER トランスフェクション試薬	Genlantis	T201015
Vaccinia Topoisomerase I	Invitrogen	38042-024
Blak-Ray 長波紫外線ランプ	Upland, CA	B 100 AP	UVA ランプ
EpiSonic 多機能バイオプロセッサー 1100	Epigentek	EQC-1100	ウォーターバス ソニケーター
マイラーフィルター	GE ヘルスケア ライフサイエンス
アガロース	Sigma-Aldrich	A6111
BIO-RAD Chemidoc	BIO-RAD	XRS+ システム	DNA イメージング システム
Glycine	Fisher Scientific	BP381-500
37% ホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	F8775-25ML	架橋に使用
プロテイナーゼK	ニューイングランドバイオラボ	P8107S
DMEM	サーモフィッシャー	11965092	細胞培養培地
PBS	サーモフィッシャー	70013073	細胞培養
トリプシン-EDTA	サーモフィッシャー	25200056	細胞培養
ブロモクレゾールグリーン	シグマ-アルドリッチ	114-359	DNAローディング色素
シリコンチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	02-681-320	低保持マイクロフュージチューブ
トリスベース	フィッシャーサイエンティフィック	BP152-1
ホウ酸	フィッシャーサイエンティフィック	A74-1
EDTA	フィッシャーサイエンティフィック	BP24731
光度計	インターナショナルライトテクノロジー	ズ ILT1400-A	UVA線量測定
<ストロング>細胞株
ヒトU2OS骨肉腫	ATCC	ATCC HTB-96	によると培養の推奨事項
ヒト子宮頸部腺癌 HeLa	ATCC	ATCC-CCL-2	サプライヤーに応じて培養sの推奨事項近
位フォワードプライ	マー5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
近位リバースプライマー5	′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
位フォワードプライマー5	′-aat acc cca cat agc ag 遠
位リバースプライ	マー5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc