方法論記事

過敏性腸症候群におけるmiRNA循環の摂動は多重化ハイスループット遺伝子発現プラットフォームを使用して検出します

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DOI：

10.3791/54693

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2016年11月30日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Digestive Disorders Unit, National Institute of Nursing Research, National Institutes of Health, DHHS, 2National Institutes of Health Research Scholar, Howard Hughes Medical Institute, 3Internal Medicine, Medical School, University of Michigan

この記事について

サマリー

私たちは、増幅を必要とせずに生物学的基質中の分子をバーコード化し、カウントすることにより遺伝子発現を定量化するマルチプレックスハイスループット遺伝子発現プラットフォームの使用について説明します。このプラットフォームを使用して、過敏性腸症候群の有無にかかわらず、全血中のマイクロRNA(miRNA)発現を定量しました。

要約

遺伝子発現プラットフォームアッセイは、単一の反応で最大800の転写産物（mRNAまたはmiRNAの）の発現の堅牢性と再現性の高い定量を可能にします。 miRNAのアッセイは、直接イメージング、デジタル色分けされた蛍光バーコードプローブセット（レポータープローブおよび捕捉プローブ）で標識されたmiRNA分子をカウントすることにより、転写産物をカウントします。バーコードは3 '末端にユニークなオリゴヌクレオチドタグ（miRtag）を連結することによって伸長された成熟miRNAに直接ハイブリダイズされます。逆転写および転写産物の増幅が必要とされていません。レポータープローブは、4つの蛍光色の組み合わせを使用して移入6色位置の配列を含みます。 6箇所以上4色遺伝子特異カラー​​バーコード配列を構築するために使用されます。ハイブリダイゼーション後の処理は、ロボットプレップステーションに自動化されています。ハイブリダイゼーション後、過剰のプローブは洗い流され、三者構造が（プロ捕獲されています被miRNAのレポータープローブ）は、ビオチン標識捕捉プローブを介して、ストレプトアビジン被覆スライドに固定されています。イメージングとバーコード計数は、デジタルアナライザを使用して行われます。固定化されたバーコードのmiRNAを可視化し、顕微鏡やカメラを用いて画像化し、ユニークなバーコードがデコードされ、カウントされています。データの品質管理（QC）、正規化、および分析が分析ソフトウェアに付随するカスタム設計のデータ処理及び解析ソフトウェアによって促進されます。アッセイは、表現の広い範囲だけでなく、高感度で高い直線性を示しています。サンプルおよびアッセイ準備は酵素反応、逆転写、または増幅を伴いません。いくつかの手順があります。そして、主に研究者の影響を低減し、高い一貫性と技術的な再現性が得られ、自動化されています。ここでは、過敏性腸症候群で循環のmiRNA摂動を同定するためのこの技術の応用を説明します。

概要

過敏性腸症候群（IBS）10苦しめている、消化器の中で最も一般的な外来患者の診断である - 一般人口の15％をし、保健サービスに多大な負担を表します。 IBSのために現在、一般的にそこに受け入れられません診断バイオマーカー（すなわち、診断は臨床症状に基づいており、このようなGI悪性腫瘍、炎症性腸疾患、および胃腸（GI）感染症などの他の有機障害を排除されています）。このようなIBS、高感度および精度（再現性）などの不顕性組織病理学と共通の条件、における遺伝子発現プロファイルを研究すると遺伝子発現プロファイルにおける摂動は、しばしば1-3微妙であるため、必要とされています。 miRNAは、IBS 4,5の両方の診断および機能の標的として同定されている、と我々はIBS-関連する生物学的摂動の3,4,6,7のバイオマーカーを循環としての使用を評価する上で特に興味を持っています。 circulaの臨床活用ティンバイオマーカーが原因使いやすさと、患者からのバイオマーカー」のソース（ 例えば、末梢血）のコレクションの最小侵襲性の性質のために、現在の関心事です。

なぜなら彼らのユニークな化学および合理化され、大部分が自動化されたワークフローの遺伝子発現プラットフォームアッセイは、（単一の反応で800ターゲット）ワイドおよびカスタマイズ可能なカバレッジを提供マイクロアレイプラットフォームを提供ターゲット発見のためのトランスクリプトームの。彼らはまた、トランスクリプトーム標的の定量化における発現レベルの広い範囲にわたって高精度と直線性をもたらします。アッセイは、RNAの逆転写、cDNAまたは他の酵素反応の結果として生じるの増幅を必要としません。このように、少量またはまれなスプライスバリアントを持つRNA種からの増幅の高サイクル数によって導入された潜在的なエラーは、デジタルカウントのプロセスによって低減されています。これは、精製されたトータルとしての試料タイプの様々な手段RNA（ 例えば、mRNAの+のmiRNA）、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）標本、ならびに原油組織および細胞溶解物からのRNAは、アッセイで使用することができます。

関心対象のRNAをそれぞれが標的RNAに対応する領域を認識する標的特異的配列を含む、プローブ（捕捉及びレポータープローブ）のペアを使用して検出されます。短いRNA（ 例えば、miRNAの）の検出を確実にするためには、成熟miRNA配列は、分子の3 '末端にユニークなオリゴヌクレオチドタグ（miRtag）をアニールすることによって伸長されます。成熟した標的miRNAおよびmiRNA特異的miRtag両方の部分に相補的なブリッジングオリゴヌクレオチドは、配列特異性を確実にするために使用されます。キャプチャおよびレポータープローブは、それぞれ、成熟miRNA-miRtag複合体の3 'および5'末端に連結。捕捉プローブは、それらは、ストレプトアビジンでコーティングされたスライドガラスの表面に付着することを可能にする3 '末端にビオチン標識を有し、fixiスライドへの捕捉プローブのmiRNA-miRtag - レポータープローブ複合体をngの。電流は、次に、5 '末端にレポータープローブによって運ばれる蛍光バーコードは、顕微鏡および電荷結合素子（CCD）カメラを用いて可視化できるように、スライド表面上に複合体を向けるために使用されます。バーコードは、特定の標的miRNAの数を得、計数し、復号化されます。蛍光バーコードは、4,000以上のカラーバーコードの組み合わせを構築するために使用できる4つの蛍光色の、特定のRNAのための各コードが使用できる6つの位置から成ります。

サンプル調製（ すなわち、RNA精製または細胞/組織溶解液の準備）、ならびに捕捉およびレポータープローブのハイブリダイゼーションは、ベンチで行われています。十二標本は、単一のスライド上で多重化することができます。一晩のハイブリダイゼーション後、すべてのさらなる試料調製は、ロボット・プレップステーションによって実行されます。ロードされたスライドは、広告に転送されますイメージング、計数、復号、及びデータ処理のためのigitalアナライザ。得られたデータを、それらがさらにユーザ制御の高度で処理される添付ソフトウェアにインポートされます。ユニークな化学、簡単な準備、自動化された自然、単純なデータ型（カウント）、およびアッセイの全体的な合理化されたワークフローは、そのような機能的な条件で循環するmiRNA発現プロファイルと署名を研究する上で有用なツールとなって、高精度な遺伝子発現の定量化を促進しますIBS。

プロトコル

ここで説明する研究は、国立衛生研究所の施設内倫理委員会（Clinicaltrial.gov＃NCT00824941）によって承認されました。

全血サンプルの1コレクション

  1. （長期保存を可能にする）、RNA安定化溶液を含む採血管中に静脈穿刺を介して、研究参加者から全血サンプル（2.5 ml）を採取し、RNA精製まで-80℃で保存します。

2.トータルRNA精製

  1. 解凍し、2時間の血液チューブをインキュベートし、その後5000のx gで10分間、スイングアウトローターを使用してそれらを遠心分離します。ペレットを乱さないように注意しながら、慎重に廃液チューブに注ぐか、またはそれをピペットで上清を取り除きます。
  2. ペレットは目に見えて溶解するまで、RNaseフリー水4mlを添加することにより、ペレットを洗浄し、しっかりとキャップを交換し、渦。 10分、再ために5000×gで、スイングバケットローターを用いて、遠心分離ステップ2.1で説明したように、上清を移動します。
  3. ペレットにBM1バッファ（提供）の350μlのを追加します。それは目に見えて溶解するまで、ペレットをボルテックスし、自動化された全RNA抽出のための2-mlの処理チューブに移します。
  4. ロボットRNA抽出システムで自動化することができる市販のRNA抽出キットを用いて全血から、miRNAを含む細胞内RNAの自動化精製を行います。
    注：私たちは一度に12サンプルを処理することができます使用され、それが完了するのRNA精製プロトコルの3時間を要し、自動化ロボットシステム。
    1. ロボットRNA抽出システムにRNA精製キットに付属事前ロードされたピペットチップ、遠心分離管、緩衝液、および試薬をロードします。
    2. プロトコルの選択メニューから「血液のmiRNAパートA」プロトコルを選択し、実行を開始します。
      注：自動化された手順の説明については、補足資料を参照してください。
    3. ロボットが共存していたら、自動化されたmiRNA精製プロトコルのmpletedパートA、廃棄物の容器を空にし、ロボットシステムから使用されるプラスチックおよび試薬容器を削除します。
    4. 溶出したRNAを含む全てのマイクロ遠心管に蓋を閉じ、シェーカーアダプタに配置します。 5分間65°Cの時のサンプルをインキュベートするプロトコル選択メニューから「血液のmiRNAパートB」を選択します。
    5. ロボットがmiRNA精製プロトコールのパートBの実行が完了したら、すぐにサンプルを除去し、氷の上に冷やします。
  5. 定量および分光光度計を用いて精製されたRNAの品質を評価します。
    注：miRNAのアッセイのためのプロトコルの推奨事項を1として、33 ngの/μlでの最小濃度が必要とされ、全てのサンプルが存在しないことを確実にするために1.9の280/260比1.8の最小260/230比を満たしているか、超えなければなりません重要な有機汚染の、​​アッセイ性能に影響を与える可能性がある（17リファレンスを参照してください）。
  6. C. O -80でサンプルを保管してください

3. miRNAのサンプル調製

  1. 33 ngの/ヌクレアーゼを含まない水を使用してμlに12 RNAサンプルを正規化します。
  2. ヌクレアーゼフリー水を用いたアッセイキットに付属のmiRNAコントロールの1：500希釈を準備します。氷の上に保管してください。
  3. アニーリングマスターミックスを調製する：10-、20-μlのピペットを使用して（ステップ3.2で調製した）アニーリングバッファー（提供）の13μlを、miRtag試薬（提供）の26μlを、およびmiRNAコントロールの6.5μLを兼ね備えています。
  4. 10μlのピペットを用いて、12 0.2-mlのストリップチューブのそれぞれにアニールマスターミックスの3.5μlのとRNAサンプル（ すなわち 、100 ngの）の3μlを添加します。 、ミックス卓上ミニマイクロ遠心（2000×gで）を使用してスピンダウンし、場所サーモサイクラーにするフリック（10分間94°Cの 1分間、65°Cのを2分間、および45°Cの 、48°Cの時に保持） 。
  5. 3μを組み合わせることにより、ライゲーションマスターミックスを調製します20μlのピペットを用いて、連結緩衝液（提供）とポリエチレングリコール（PEG提供）の19.5マイクロリットルのリットル。 10μlのピペットを用いて、ステップ3.4からストリップチューブのそれぞれにライゲーションマスターミックスの2.5μLを加えます。
    1. 、穏やかに混合する卓上型ミニ微量（2000 XG）を使用してスピンダウンし、5分間48°Cのでサーモに戻ります。 O 5分後、10μlのピペットを用いて、3分間サーマルサイクラーに各チューブに直接リガーゼの1μlを添加し、3分間48°Cのでそれらをインキュベート、47°Cの 、46°Cの 3分間、45 5分間のC、および65°Cの 10分。 4 O℃で保持
  6. （提供）サーモサイクラーからチューブを外し、静かにそれらを混ぜ、卓上ミニマイクロ遠心（2000×gで）を使用して、それらをスピンダウン、および連結クリーンアップ酵素の1μlを添加します。サーモサイクラーにチューブをインキュベート（37°Cの 10分間、1時間および70°Cのために、4 Oで開催 C）まで。 10μlのピペットを使用してください。
  7. チューブを外し、、100μlのピペットを用いて、ヌクレアーゼフリー水40μlを添加、混合し、卓上ミニマイクロ遠心（2000×gで）を使用してスピンダウン。

4. miRNAのハイブリダイゼーション

  1. 氷上で記者と（提供）キャプチャープローブセットを解凍し、卓上ミニマイクロ遠心（2000×gで）を使用して、それらをスピンダウン。
  2. 200μlのピペットを用いて、ハイブリダイゼーションマスターミックスを作成するために、レポーターコードセットチューブ（130μL）にハイブリダイゼーション緩衝液130μlを添加します。混合し、卓上ミニマイクロ遠心（2000×gで）を使用してスピンダウン。
    注：Reporterと捉えプローブがパネルに含まれる各miRNAのための具体的かつ標準的なものです。カスタムパネルとユーザ設計捕捉およびプローブセットを設計することができます。
  3. 12新しい0.2 mlのストリップチューブでは、20μlのピペットを用いてハイブリダイゼーションマスターミックス20μlを添加します。
  4. 85°Cの FOでステップ3.7からのmiRNAサンプルを変性R 5分間、氷上にそれらを冷却します。 10μlのピペットを用いて、ステップ4.3から管のそれぞれに5μLを加えます。
  5. プログラム永遠時30μlのボリューム算出された温度と加熱蓋で65°Cのにサーモサイクラーは、（実行の終了時に4°Cのにランプダウンするためにそれをプログラムしません）を設定します。
  6. 10μlのピペットを用いて、各チューブにセット捕捉プローブの5μlを添加、混合し、卓上ミニマイクロ遠心（2000×gで）を使用してスピンダウンし、すぐに65℃。でサーモに置きます無未満12時間とせいぜい30時間インキュベートします。

5.準備駅、デジタル・アナライザ

  1. プレップステーションをロードします。
    1. ステーションのドアを開け、試薬プレートをロードする（提供）、カートリッジ（提供）、ピペットチップ（提供）12 0.2-mlのストリップチューブ、および12空の0.2 mlのストリップチューブ中（提供）、調製されたサンプル。ストリップチューブキャップと試薬プレートカバーを取り外します。プレップステーションを閉じますドアとは、コントロールパネルから適切なアッセイを実行します。
      注：ハイブリダイゼーション後の処理にかかわらず、アッセイされるランの、同じです。すべての試薬およびプラスチック用品は、あらかじめパッケージ化され、室温にそれらをもたらす、2分間2000×gで試薬を含む96ウェルプレートをスピンダウン以外の調製を必要としません。すべてのコンポーネントは、準備ステーションで明確に定義された位置にロードされます。自動化された手順の説明については、補足資料を参照してください。
  2. 視覚化し、固定化された配向三者複合体のバーコードを数えます。
    1. 、準備ステーションからカートリッジを取り外して設けられたカバースリップでそれを封印し、カメラの光学上記スロット内のデジタルアナライザに配置します。
    2. アッセイキットに記載されている適切なアッセイ（miRNAのパネルアッセイ）およびアッセイのバージョンを選択して、プログラムを実行します。
      注：デジタルアナライザは、各サンプルの位置aのためのビュー画像のフィールドを取ります4励起波長T、蛍光バーコードを読み取り、デコードすることを可能にします。特定のmiRNAに対応する具体的なバーコードは、カウントされます。
    3. インターネットリンクを介してサーバーに直接USBにデータファイルをエクスポートしますか。

6.データ処理・解析

  1. 「生データ」タブをクリックし、「インポートRCCファイル」を選択します。 USBからRCCファイル（生データファイル）を含むフォルダを選択します。
  2. 「次へ」をクリックして、すべてのQCボックスを選択し、「インポート」をクリックします。
  3. 「新研究」タブをクリックします。名前を付けて、研究を記述し、保存します。
  4. 新しい研究では、「新実験」タブと名前を選択して新規の実験を説明します。 「次へ」をクリックして、アップロードされた関連する生データファイルが含まれている左側のペインからRLFフォルダを選択します。それが選択されたら、「選択してください」をクリックし、「次へ」をクリックします。
  5. 加えます注釈があれば希望すると「次へ」をクリックします。
  6. 背景差分法を選択します。ネガティブコントロール、ブランク、レーン減算、またはユーザー定義の減算のいずれかを選択することができます。選択したら、「次へ」をクリックします。
    注：技術的なパラメータと研究の生物学的状況に基づいて、最も適切なバックグラウンド補正のアプローチを決定します。
    注：カウントは、低存在量の目標にはあまり正確で。ここで説明する研究の目的のために、データは最初QCパラメータを検討すると、技術的複製物間で異なる存在量のmiRNAのための数の変化を検討するために、バックグラウンド補正なしで処理しました。データは、25カウントのバックグラウンド閾値を用いて再処理しました。
  7. 「トップ100」の正規化を選択し、「次へ」をクリックします。
  8. 、比データを取得比パラメータを選択し、「次へ」をクリックしてください。
  9. 「完成」をクリックします。
  10. 名前の元をクリックします「生」を含むドロップダウンメニューを明らかにするために、左ペインでperiment、「正規化」、「グループ化」、「比データ」、および「分析データ」。
  11. 「生データ」をクリックし、右ペインのQCレポートを観察します。デフォルトのQCのパラメータを渡していないサンプルに次のフラグを確認します。フラグ付きのサンプルを含むと記載されているように再処理していない新たな「研究」を構築し、または単に「QC /正規化フラグによってサンプルを除外する」を選択することにより、データ解析ステップからフラグ付きQCサンプルを除外します。
    1. エクスポート「生」、「正規化」、またはCVSで「グループ化」のデータファイルまたは別の統計またはマイクロアレイソフトウェアでの分析のための別の互換性のあるファイル形式。
  12. 左側のペインから「正規化されたデータ」を選択し、右側のペインで、分析の対象となるサンプルを選択します。
  13. 「分析」をクリックして、所望の分析の種類（ 例えば、「ヒートマップ＆＃を選択34 ;,「ヴァイオリンのプロット」、「ボックスプロット」、「散布図」、「ヒストグラムプロット」）。希望の除外基準・ボックスを選択します（ 例えば、制御遺伝子を除外し、QCフラグによりサンプルを除外し、異常値サンプルまたは遺伝子を除外、および/またはデータ分析から正規化プローブを除外）。
  14. 所望のように分析から除外されるように個々のサンプルを選択します。
  15. 希望通りから除外または分析に含まれるべき個々の遺伝子を選択します。
  16. 選択した統計やデータの可視化操作のためのパラメータを選択し、「完了」をクリックしてください。

結果

機能障害におけるトランスクリプトーム摂動は微妙であってもよく、かつ確実に発現におけるそれらの微妙な変化を検出するために、遺伝子発現の定量化は、正確である必要があります。遺伝子発現プラットフォームアッセイ系は、高度に自動化された性質を介して技術的ノイズを低減し、そしてそれが使用するユニークな化学的性質は、高精度の遺伝子発現データを生成します。この方法を使用して可能である;（ハウスキーピング遺伝子は、黄色のドットで表現されているオレンジ色のドット）発現の定量化技術は、図1の内因性（ブルードット）およびウイルスのmiRNAの両方で高い再現性を実証するに示す複製します。この方法は、ウイルス（ 図2a）および内因性（ 図2b）健康調査の参加者によって定義されるように、予想される式からの偏差を示すmiRNAを用いて、IBSにおける関心の対象として同定することができます。ウイルスのmiRNAかどうかは不明であることに留意すべきですここで検出さは、人間のゲノムにまたはウイルス負荷から組み込まれたウイルスの遺伝子に由来します。アッセイは、シングルヌクレオチド特異性を有する成熟miRNAをカウントするように、同様の内因性ヒトmiRNAとのクロスハイブリダイゼーションはほとんどありません。それにもかかわらず、これらの分子の差動定常状態レベルは、バイオマーカーとして注目されています。低い発現ターゲット間摂動が検出されるため、これらの転写物の正確な検出は、より豊富な転写物によって圧倒されないような方法の精度を可能にします。微妙な乱れも確実に観察することができる。健常対照と比較して、IBSとIBS-サブタイプでmiRNAを循環3および図4は、これらの摂動の一部を図 、および5および6を 図 （いずれも3から適応）最も重要な2つの差動で上昇したmiRNAを示し、 （ 図5：miRNAの342-3p、 図6：miRNAの150）。IBSの参加者6図関連ソフトウェアによって生成された結果のグラフ出力の例です。

figure-results-1
。 図1：2 技術的反復からの正規化されたカウントの技術は、2つの別々のカートリッジ上で実行レプリケートが高い線形相関を示した（r 2 = 0.90、yは1.03x = - 0.4）を正規化の範囲にわたってのmiRNA（トップ100に正規化は、miRNAを発現します）カウント（x軸とy軸上のlog2カウント）。散布図は、青色の中の内因性ヒトmiRNA（654のmiRNA）、オレンジ色に内因性ウイルスのmiRNA（80のmiRNA）、イエロー（8遺伝子）中のハウスキーピング遺伝子のためのデータが含まれています。内因性ウイルスのmiRNAは、アッセイの以前のバージョン（バージョン1.4は、ここで使用された）上で入手できなかったが、彼らは、カスタムの追加として提供されていたが、もはや、標準的なアッセイに含まれています。/54693fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-2
図2：IBS- 便秘におけるウイルスおよび内因性ヒトmiRNAの正規化カウント（IBS- C）健常対照対 （a）は、ウイルス（オレンジ）における摂動および（b）は 、内因性ヒトmiRNA（青）は、この例では明らかです。 IBS-C参加者（y軸）の（LOG2形質）のmiRNAの数は、健康対照（x軸）のmiRNAの数（LOG2は、形質転換）に対して回帰されます。 miRNAの大部分は、両方の集団に非常によく似た表現が、いくつかは、特に相関関係から外れます。これらの偏差は稀で、豊富に発現の両方のターゲット間で明らかである。 してくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図3：miRNAが大幅にかつ均一に示差健常対照と比較してIBSで表現されているが示差的には、IBSにおけるmiRNAは、カテゴリ内での整合性をチェックと統計的有意性の検定を組み合わせた線形判別分析の効果の大き法を用いて明らかにされている表現。 にはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。

figure-results-4
図4：miRNA は大幅にあり、均一に差のある健康な対照と比較して、IBSサブタイプで発現される miRNAは、ジました。（：下痢、-C：-D便秘）fferentially IBS-サブタイプで表されます。カテゴリ内での整合性をチェックと統計的有意性の検定を組み合わせた線形判別分析の効果サイズ法を用いて、健常対照と比較して大きく表示するには、こちらをクリックしてください。この図のバージョン。

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図5： のmiRNA-342-3pの示差発現未知の病因の慢性腹痛は、IBSの主な症状です。ボックスプロットは、miR-342-3p（y軸上の正規化カウント）、病因不明の慢性膀胱痛に関連したmiRNAは、健常対照と比較して、すべてのIBSサブタイプ全体で高いカウントでの循環中に存在することが判明したことを示しています。バーは非外れ値の範囲を表し、ボックス四分位範囲および青い正方形の中央値のカウントエス。 3から変更された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図6： のmiRNA-150の発現差異 IBSの参加者が健常対照（y軸上のlog2変換されたカウント）と比較したmiR-150カウントを循環させる有意に高いいたことを示すバイオリンプロット。曲線はカテゴリ内のカウントの周波数を示し、縦の棒は1 番目と3 番目の四分位数を表し、赤の広場は中央値のカウントを示しています。 3から変更された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

プロトコル内の重要なステップ

特ににおけるmiRNAアッセイのために、試薬が溶解物での使用のために最適化されていないように、（これらは、mRNAおよびタンパク質アッセイに使用することができる）、未精製の溶解物を使用しないことが重要である、と試料調製反応が阻害される可能性があります。さらに、汚染物質は、連結および試料精製反応を阻害することができる（ 例えば、グアニジニウム化合物、エタノール、およびフェノール）溶解およびRNAの精製工程から持ち越さ。良質のRNAは、miRNAアッセイの感度および精度に極めて重要です。

加熱された蓋付きサーマルサイクラーを使用すると、すべての反応ステップの性能を最適化するために適切な温度制御を確実にするために重要です。ステップ3.5.1の間には、リガーゼの添加の間に温度を維持するために、サーモサイクラーからストリップを除去しないことが重要です。リガーゼを追加するためにストリップを削除します反応を妥協します。ハイブリダイゼーションの手順を実行する場合、これはレポータープローブを剪断することができるように、激しく振盪し、ピペッティング、またはチューブ内の試薬を混合する際にフリックを回避することが重要です。最適なパフォーマンスと一貫性を確保するためには、徹底的に穏やかなフリックすることによりチューブ内の試薬を混合することが重要です。常に混合した後、反応をスピンダウンし、新しいピペットチップを試薬は正確なピペット操作を確実にし、偶発的な交差汚染を避けるために分配されるたびに使用しています。

修正およびトラブルシューティング

コードセットは、目的のターゲットのみを含むようにカスタマイズすることができます。この方法では、コストはさらにバイオ署名を調査するか、検証するとき、大きなサンプルセットの検査を可能にするためにバランスさせることができます。カスタムプローブは、 アラカルトメニューから利用できない遺伝子またはターゲットのために設計することができます。あまり豊富でターゲットや低濃度のRNAの感度はすることができますおよび/または高解像度デジタルカウントを使用して、より長いハイブリダイゼーション時間を可能にすることによって操作します。

私たちの研究では、全血からの全RNAとの事前定義された800標的miRNAパネルを使用しました。しかし、アッセイは、よりターゲットを絞ったアプローチが必要な場合は、より少ないmiRNAを含むようにカスタマイズすることができます。 2つのカートリッジが快適ロボットプレップステーションにハイブリダイゼーション後の処理を通過し、次の日デジタル分析器上に結像することができるので、24サンプルの合計は、12の二組にずらし、単一の日に調製することができます。 12のバッチでサンプルの互い違いの処理は、ハイブリダイゼーション時間を標準化することが重要です。データ分析は、高解像度スキャンは稀miRNAの検出を改善し得ることを示唆している場合に撮像されているカートリッジを再スキャンする保存され4 O℃で保存することができます。まれな分子の検出はまた、より長いためのサンプルをハイブリダイズさせることによって改善することができます。しかし、長時間のハイブリダイゼーションはresulあり過飽和でtと開始RNA濃度は（細胞外ベシクル由来のRNAのように）低い場合にのみ、結果を改善することができます。プラットフォームの感度と精度が比較的低存在量miRNAは確実にカウントすることができます。

テクニックの制限事項

記載の遺伝子発現アッセイプラットフォームはアレイあたり800ターゲットまで収容します。したがって、全体のmiRNAトランスクリプトーム/全トランスクリプトーム研究には適していません。唯一、既知記載、及び指定されたターゲットプラットフォームを用いて検出することができるので、新しい分子種の検出には適していません。このようなRNASeqや他の伝統的なマイクロアレイ法などの他の方法は、全トランスクリプトーム探索的研究に適しています。

既存の/代替方法に関して技術の意義

IBSは、症状の組み合わせによって特徴付けられる、PRINcipally腹痛を含みます。内臓過敏症;そして、このような頻繁な下痢、便秘、またはその両方9,10の組み合わせのような排便習慣の変化。 IBSの症状は、既知の器質的原因がなく、患者が臨床的に有意な炎症、胃腸組織の組織病理学的摂動、または全身マーカー9-12で提示しません。研究は、IBSにおける生物学的調節不全は、炎症や免疫機能10周り新興共通のテーマで、微妙な不顕性、および不均質であることを示唆しています。したがって、我々は実験導入の変動を制御し、確実に遺伝子発現に微妙な摂動を検出することが可能だったプラットフォームを使用する必要がありました。アッセイおよびシステムの固有の属性は、サンプル処理を標準化し、再現性の高いデータを生成する技術的変動を低減する、自動化による処理実験を減らします。これらの機能は、集中的な調査を可能にし、高精度とrを生成しますeplicableデータ。強度 - または増幅ベースの方法を使用する場合に、より豊富なターゲットの信号によって見過ごさまたは圧倒することができる低発現のターゲット間の微妙な摂動と摂動の検出を可能にします。 PCRベースのマイクロアレイとRNAseq方法説明プラットフォームを使用する実行可能な代替であり、高いスループットが要求された場合、代替として魅力的であってもよいし、その目的は、全トランスクリプトームを特徴づけるために、または新規分子を探すことであるとき。しかし、選択肢が正確かつ高感度に検出し、希少な目標や微妙な乱れを定量においても実行しない場合があります。

このテクニックをマスターした後、将来のアプリケーションや行き方

IBSの参加者における循環miRNA発現は有意とカテゴリ内で一貫両方であることが見出された摂動の数を示しました。同定されたmiRNAは、関連pathwaと関連していましたYSと機能性疼痛状態（のmiR-342-3p：慢性膀胱痛）を含む病理学的状態、8および炎症（のmiR-150）13。研究事例は、関心の対象とシステムを定義するために使用される探索コホートに基づいていました。よりターゲットを絞っ、より小さいmiRNAアレイは、サンプルコストあたり低下し、検証と署名とバイオマーカーを精製するために、費用対効果の高い方法で分析することがはるかに大きなコホートを可能に構成しました。遺伝子発現プラットフォームアッセイ系は、分子署名とバイオマーカー14-16を改良し、テストするためのマイクロアレイとよりターゲットを絞った、仮説駆動型のデータ収集の伝統的な探索的性質との間のバランスをとります。方法について説明ターゲットmiRNAが過剰発現または阻害実験である場合、in vivoでおよびin vitroモデルにおいて 、分子およびタンパク質の摂動を調べるために使用されます。新しいアッセイは、mRNAおよびPの同時定量が可能に直接細胞および組織溶解物からroteins。また、末梢血と排泄物（ 例えば、尿）の特定画分の精製を最適化することにより、および特定のアッセイパラメータをカスタマイズし、最適化することにより、低分子濃度の画分（ 例えば、エキソソーム画分）の分子プロフィールと署名を検討します。

開示事項

W.A.H.、S.K.A.、N.H.F.、およびRMPは米国特許を保有しています(no.PCT/US14/38638)を、本明細書に記載された研究から発せられるIBSの循環miRNAシグネチャについて。

謝辞

著者は、米国保健社会福祉省、国立衛生研究所、国立看護研究所、および学内研究部門からの資金提供を Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06; Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Peace, Sarah K. Abey, and Leeanne B. Sherwin に学内研究研修賞を、そして Burroughs Wellcome Fund から Howard Hughes-NIH Research Scholar Ralph M. Peace への特別な支援に感謝します。

ここで表明された意見、およびこれらのデータの解釈と報告は著者の責任であり、国立衛生研究所または米国政府の公式の勧告、解釈、または政策と見なされるべきではありません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
nCounter Prep-StationNanostringN/Aエッセンシャル
nCounter デジタルアナライザーNanostringN/Aエッセンシャル
分光光度計NanoDropND-1000適切な同等の
遠心分離機任意のN/A同等の
MiniMicroCentrifugeを使用できる適切な同等の
ピペット(1,000、100、20、10、#181;l)任意のN/A適切な同等のものを使用できる
QiacubeQiagen9001292適切な同等の
PAXgene Blood miRNA KitQiagen763134適切な同等の
PAXgene Blood TubesVWR77776-026適切な同等の
nCounter Human miRNA Assay KitNanostring150625Essential
nCounter Master KitNanostring100050Essential
nSolverNanostringN/Aエッセンシャル
を使用できる 適切な を使用できる

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