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Summary

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

Abstract

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

Introduction

それらは経路^1-4シグナルの配線を解読するために使用することができるので、光遺伝学ツールは、部分的に、人気を集めています。これらは、光を照射されたとき、それらの立体配座および結合親和性を変更するための光活性化タンパク質の能力に基づいています。シグナリング要素にこれらのタンパク質を融合して、複雑な細胞内シグナル伝達経路^5-12内のシングルプレイヤーの特定の調節を可能にします。従って、シグナル伝達経路は、高い時間および空間分解能を用いて研究することができます。

ほとんどの細胞ベースの光遺伝学の研究では、生化学分析^11,12に続く光の存在下での培養と組み合わせた顕微鏡ベースの方法を利用します。対照的に、フローサイトメーター、キャピラリーに沿って細胞をsingularizesセルサイズ、粒度と蛍光強度を測定します。この方法は、thousan分析する能力を含む、顕微鏡または生化学的方法を超える大きな利点を有しており、非常に短い時間で単細胞解像度で生細胞のDS。したがって、フローサイトメトリーを用いて光遺伝学を組み合わせることが望ましいです。

我々の知る限りでは、光遺伝学、フローサイトメトリーのための確立されたプロトコルはありません。広く受け入れられた手順は、手動で懐中電灯のデバイスとの反応管の外側から細胞を照射することです。しかし、フローのマニュアル照明は、サイトメーターの反応管を通過する光を必要とし、生細胞イメージング、円筒形、加熱された水室のため。これは、実質的な光散乱および光の損失を引き起こします。また、手動の照明によって提供される光強度は（ 等角度、距離、）実験間の再現性がないと一つの実験の波長の数には限界があります。

LEDサーモフロー装置を構築することによって、我々は、これらの制限を克服することができました。このデバイスでは、細胞は一時中で特定の波長で照射することができますフローサイトメトリー測定中erature制御方法。これは、実験内との間の光の正確で再現性の量を可能にします。

インビボでの我々の装置の有用性を実証するために、我々はphotoswitching中ラモスB細胞におけるドロンパの蛍光シグナルを記録しました。ラモスB細胞は、ヒトバーキットリンパ腫に由来します。ドロンパは、モノマー、ダイマーまたは四量体として存在する蛍光タンパク質です。そのモノマー形態では、非蛍光性です。 400 nmの光で照明は二量体化および四を誘導し、ドロンパタンパク質の蛍光をレンダリングします。このプロセスは、500 nmの光を照射することによって逆転させることができます。ドロンパタンパク質は、タンパク質^4,13のシグナリング機能および位置を制御するために使用されています。

ここでは、フローサイトメーターでドロンパのphotoswitchingを研究するためにラモスB細胞にドロンパ – リンカー – ドロンパのタンパク質を発現しました。私たちのデバイスを使用して、我々は効率的にすることができたとリアルタイムでの蛍光強度を記録しながら再現性ドロンパをフォトスイッチ。この方法は、マニュアル照明で現在の照明プロトコルを介して実質的な利点を提供し、大幅に光遺伝学ツールとケージ化合物のための実験的なレパートリーを広げます。大幅に簡素化し、新たな光遺伝学ツールの発見と開発を加速する私たちのデバイスを使用しました。

Protocol

1.デバイスの設計と構築

1. パイロット実験
   注：特定の光遺伝学ツールおよび細胞型に必要な光強度が大幅に異なる場合があります。プロトタイプとパイロット実験は必要最小限の光強度を推定するのに有用です。以下の実験のために使用される光遺伝学ツールは、ドロンパ – リンカー – ドロンパ融合構築物です。ドロンパシーケンスは、商業的に（材料のリストを参照してください）を得ました。長いリンカーは、発現構築物は、分子内（分子間）二量体を形成することを可能にするために2つのドロンパ配列の間でクローニングしました。以下に説明する手順は、他の多くの光遺伝学ツールまたは光学的に制御された物質に適合させることができます。
   1. パッケージング細胞からのレトロウイルス含有上清を用いて、形質導入のための製造元の指示に従ってドロンパ – リンカー – ドロンパ含む構築物でラモスBリンパ球を伝達します。事前に応じて細胞を収穫し、カウントviouslyプロトコル^13を発表^しました 。
   2. 濃度で再懸濁し、細胞1×10 ⁶培地中/ mLの（RPMI 1640、10％の熱不活性化FCS、2mM L-グルタミン、100U / mLのペニシリン、100 U / mLのストレプトマイシン、および50μMの2-メルカプトエタノール）ガラスFACSチューブに移します。
   3. フローサイトメーターの中にチューブを挿入し、ドロンパ（GFPチャンネル^）14,15の蛍光強度を測定します。
   4. おそらく有害な波長から目を保護するために、すべてのさらなるステップのための保護メガネを着用してください。
   5. 手動でチューブの外側に500 nmのLEDライトを配置し、ドロンパの蛍光強度を測定し続けます。
   6. ドロンパの蛍光強度が減少するまでのLEDライトの数および/または強度を増加させます。
   7. 手動でチューブの外側に400nmのLEDライトを配置し、ドロンパの蛍光強度を測定し続けます。
   8. ドロンパのFLUOまでLED照明の数および/または強度を上げます強度が増加するrescence。
   9. ステップ1.1.5と1.1.7でphotoswitchingから必要であると予測されるようにデバイスを構築するために、少なくともとして多くのLEDライトを使用してください。
2. デバイスの構築
   注：デバイスはフライブルク大学からプロの加工ショップ、Arbeitsgruppe Technikでによって建てられました。ほとんどの部分はカスタムメイドであり、市販されていません。各部分の正確な寸法は、 図1および図 2に示されています。この装置の組み立てを明確にするために、補足ビデオ1が設けられており、最も重要なステップは、以下に記載されています。
   1. 図1Aに示されている正確な測定値を有するポリ塩化ビニル（PVC）からミル片A。
   2. ピースAのドリル穴にLEDライトを挿入し、水漏れを防ぐために、塩ビ接着剤で各穴を塞ぎます。
   3. （各波長が別々のchannを占有しなければならないマルチチャンネル変圧器にLEDを接続します0〜29ミリアンペアから調整可能な出力電力とエル）。
   4. 物理的な損傷からLEDを保護するために描かれているようにピースAに3本のネジで、外側シース（B）を取り付けます。
   5. ピースAの開けた穴にチューブクリップ（C）内の水ポンプ、接着剤にデバイスを接続できるようにするには（ 図1aに示された、断面Y：9ミリメートルと61.5ミリメートル）のPVC接着剤を使用しました。
   6. 58.5ミリメートル長いプレキシグラス管（D1）をカットします。
   7. 図2に示すようにプレキシグラスから作品D2とD3を製造しています。
   8. プレキシガラス接着剤でD1の底に接着剤ピースD3。
   9. ピースD2にゴム製のOリングを取り付け、プレキシグラスの接着剤でD1の一番上に接着。
      注：ピースD1、D2、D3が一緒にピースDを形成します
   10. 3本のネジでピースAにピースDを挿入します。
   11. 変圧器に電源を適用する前に水漏れのためのデバイスをテストします。

2.光遺伝学ツールの速度論を測定

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細胞を準備

1. RPMI培地中で培養ラモスB細胞（RPMI 1640、10％熱不活性化FCS、2mM L-グルタミン、100U / mLのペニシリン、100 U / mLのストレプトマイシン、および50μMの2-メルカプトエタノール）3-密度10×10 ⁶細胞/ mL、37℃で、5％CO _2。
2. 5分間350×gで4℃での遠心分離により収穫ラモスB細胞。
3. 製造者の指示に従ってノイバウアー計数チャンバーを用いて細胞を計数し、600μL培地に1-5×10 ⁶個^の細胞を懸濁します。
4. ガラスFACSチューブに細胞を移し、氷の上に置くと、測定まで、光から保護。

フローサイトメーターおよび機器を準備します。

1. 加熱された水ポンプにデバイスを接続し、37℃に温度を調整します。
2. ガラスFACSチューブを使用する場合は、ゴム製のOリングを用いて、フローサイトメーターの黒いOリングを交換し、さらにシリコングラムを適用します楽。

測定

1. 慎重にデバイスにガラスFACSチューブを挿入します （ 図3）フローサイトメーターに接続します。
2. 測定を開始し、ドロンパ蛍光強度（GFPチャネル）を記録。
3. それぞれが400nmまたは500 nmの光で細胞試料を照射し、ドロンパの蛍光強度（GFPチャネル）を記録。

データ分析

1. ソフトウェアサイトメーターの適切な流れに実験データを分析します。側方散乱およびゲート生きた細胞に対してプロット前方散乱。経時ドロンパの蛍光強度をプロットします。

Representative Results

Discussion

LEDサーモフローは、フローサイトメーターで光遺伝学ツールを研究するための革新的なデバイスです。

これまでのところ、光遺伝学のサンプルを顕微鏡レーザーや懐中電灯のデバイス^11,12のみで照らされてきました。試料に懐中電灯の角度と距離に応じて、照明の量の大幅な変動が実験間で期待されています。また、1人での実験で動作することができる懐中電灯の数には限界があります。これは実験的なレパートリーと再現性を制限します。これらの制限は、生細胞におけるリアルタイムphotoswitching動態を特徴付けるために使用することができる私達の装置の開発中に対処されました。我々の知る限り、全く同等のデバイスが存在しません。

現在の構成では、最大30のLEDは、一サーモフローチャンバ内に組み込むことができます。このように、各波長のために必要とされる光の強度に応じて、単一のデバイスは、私たちすることができます光遺伝学ツールの多種多様な編。確立photoswitchingプロトコルは、その後、カルシウムフラックス測定値、 例えば 、機能的な読み出しのために最適化することができます。私たちのデバイスは、ケージド化合物または光活性化蛍光団などの他の光学的に制御する物質、に適しています。

使用される科学的な問題と、試料に応じて、個別のプロトコルが迅速に確立することができます。ガラス管の代わりに、ポリスチレンまたはポリプロピレン管の使用は、400〜500 nmの波長で光誘発細胞毒性を制限することをお勧めします。すべての試験した細胞株は、照明（360ナノメートル、400ナノメートルまたは500ナノメートル）ガラス管で最大1時間を生き延びました。我々は、転写実験を行うことにより、プラスチックチューブで照明時の細胞死の原因を調査することを試みました。我々は、異なる波長の光をPBSまたはRPMIで細胞を照射した後、細胞死を測定するために、非照射細胞に上清を移しました。収集のなし上清を、レシピエント細胞において有意な細胞死を引き起こした（データは示さず）。また、ポリスチレン、またはポリプロピレンチューブで照らさPBSの温度は、ガラス管の温度とほぼ同じです。したがって、我々は、細胞死の原因を推測することができます。イルミネーションプラスチックは、細胞に対して毒性である波長の不安定な物質や放射線を放出することができます。

各実験に用いた培地の選択が重要です。緩衝能力を考慮し、pH指示薬のような異なる試薬、異なる程度に異なる波長を吸収する必要があります。 FCS含有培地をFCS不含を比較すると、さらに、細胞生存率は、例えば、大きく異なります。

光滴定の目標は、最大photoswitchingために必要な光の最小量を使用することです。ほとんどの実験のためには、フォトスイッチの速度を最大にし、従って、光強度を最大にすることが好ましいです。しかし、waveleに応じてngthおよび細胞型、光が過剰照射を避けるべきである理由であるシグナリング動作に直接的な効果を有することができます。

私たちのデバイスのための光のスケジュールをプログラムすると、他の光デバイスに共通であるとしてコンピュータに接続することが可能です。ほとんどのフローサイトメーターは、多くの異なるラボで共有される共通の作業場所にあるので、それは可能な限り小さく、携帯用などのデバイスを維持するのがベストです。また、ここで提示される2色の設定のための私達の装置の手動操作は非常にシンプルですが、そのプログラミングはわずかに実験手順を改善するであろう。

まとめると、我々はここで光遺伝学ツールのパワーを組み合わせて、フローサイトメトリーの革新的なデバイスを、提示します。これは、実質的に生体内での特性評価および光遺伝学ツールの開発を簡素化し、実験的なレパートリーを拡大していきます。

Materials

Glass FACS tube	Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA	14-961-26	Borosilicate glass tubes 12×75 mm
Flow Cytometer	BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany	Fortessa II	Special Order
Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N	Addgene; Cambridge, USA	41645
PolyJet	SignaGen, Rockville, USA	SL100688
LED 505 nm	Avago Technologies; Boeblingen, Germany	HLMP-CE34-Y1CDD
LED 400 nm	Avago Technologies; Boeblingen, Germany	UV5TZ-400-15
Plexiglas tube 15 mm	Maertin; Freiburg, Germany	76999
Plexiglas 3 mm	Maertin; Freiburg, Germany	692230
Plexiglas 2.5 mm	Maertin; Freiburg, Germany	692225
Plexiglas 1.5 mm	Maertin; Freiburg, Germany	692215
PVC tile 5 mm	Maertin; Freiburg, Germany	690020.005
PVC tile 6 mm	Maertin; Freiburg, Germany	690020.006
PVC block 50 mm	Maertin; Freiburg, Germany	690020.050
RPMI	Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany	61870-010
2-Mercaptoethanol	EMD; Germany	805740
FCS	PAN Biotech; Aidenbach, Germany	P30-3302
Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL)	Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany	15140-122
Acrifix plexiglas glue	Evonic industries, Essen, Germany	1R0192
Tangit PVC-U glue	Henkel, Düsseldorf, Germany