方法論記事

LEDサーモフロー - フローサイトメトリーで光遺伝学を組み合わせます

DOI：

10.3791/54707

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2016年12月30日

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1Max-Planck Institute for Immunobiology und Epigenetics, 2Spemann Graduate School of Biology and Medicine (SGBM), University of Freiburg, 3Centre for Biological Signaling Studies, BIOSS, University of Freiburg, 4Albert-Ludwigs-Universität, 5Institute for Biology III (Mol. Immunology), Albert-Ludwigs-Universität

この記事について

サマリー

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光学的に制御された物質は、シグナル伝達経路を研究するための強力なツールです。実験の可能性を広げるために、フローサイトメトリーを用いて光学制御物質をリアルタイムに研究する装置「LED Thermo Flow」を開発しました。

要約

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光遺伝学ツールは、複雑なシグナル伝達経路内のほぼすべてのシグナル伝達分子を単離し、機能的に調査することを可能にします。主な障害は、細胞サンプルへの光の供給の制御であるため、光遺伝学的研究のための最も一般的なツールは、顕微鏡ベースの細胞分析とin vitro実験です。フローサイトメーターは、単一細胞の分解能で数千の細胞を迅速に測定する能力など、顕微鏡に比べて大きな利点があります。しかし、光遺伝学ではまだ広く使用されていません。ここでは、オプトジェネティクスとフローサイトメトリーの力を組み合わせたデバイス、LED Thermo Flowを紹介します。このデバイスは、フローサイトメトリー測定中に特定の波長、光強度、および温度で細胞を照射します。低コストで構築でき、最も一般的なフローサイトメーターで使用できます。その有用性を実証するために、Dronpaタンパク質の光スイッチング速度をin vivoおよびリアルタイムで特徴付けました。このプロトコルは、ほとんどすべての光学制御物質に適合させることができ、可能な実験のセットを大幅に拡大します。さらに重要なことに、新しい光遺伝学ツールの発見と開発が大幅に簡素化されます。

概要

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それらは経路1-4シグナルの配線を解読するために使用することができるので、光遺伝学ツールは、部分的に、人気を集めています。これらは、光を照射されたとき、それらの立体配座および結合親和性を変更するための光活性化タンパク質の能力に基づいています。シグナリング要素にこれらのタンパク質を融合して、複雑な細胞内シグナル伝達経路5-12内のシングルプレイヤーの特定の調節を可能にします。従って、シグナル伝達経路は、高い時間および空間分解能を用いて研究することができます。

ほとんどの細胞ベースの光遺伝学の研究では、生化学分析11,12に続く光の存在下での培養と組み合わせた顕微鏡ベースの方法を利用します。対照的に、フローサイトメーター、キャピラリーに沿って細胞をsingularizesセルサイズ、粒度と蛍光強度を測定します。この方法は、thousan分析する能力を含む、顕微鏡または生化学的方法を超える大きな利点を有しており、非常に短い時間で単細胞解像度で生細胞のDS。したがって、フローサイトメトリーを用いて光遺伝学を組み合わせることが望ましいです。

我々の知る限りでは、光遺伝学、フローサイトメトリーのための確立されたプロトコルはありません。広く受け入れられた手順は、手動で懐中電灯のデバイスとの反応管の外側から細胞を照射することです。しかし、フローのマニュアル照明は、サイトメーターの反応管を通過する光を必要とし、生細胞イメージング、円筒形、加熱された水室のため。これは、実質的な光散乱および光の損失を引き起こします。また、手動の照明によって提供される光強度は（ 等角度、距離、）実験間の再現性がないと一つの実験の波長の数には限界があります。

LEDサーモフロー装置を構築することによって、我々は、これらの制限を克服することができました。このデバイスでは、細胞は一時中で特定の波長で照射することができますフローサイトメトリー測定中erature制御方法。これは、実験内との間の光の正確で再現性の量を可能にします。

インビボでの我々の装置の有用性を実証するために、我々はphotoswitching中ラモスB細胞におけるドロンパの蛍光シグナルを記録しました。ラモスB細胞は、ヒトバーキットリンパ腫に由来します。ドロンパは、モノマー、ダイマーまたは四量体として存在する蛍光タンパク質です。そのモノマー形態では、非蛍光性です。 400 nmの光で照明は二量体化および四を誘導し、ドロンパタンパク質の蛍光をレンダリングします。このプロセスは、500 nmの光を照射することによって逆転させることができます。ドロンパタンパク質は、タンパク質4,13のシグナリング機能および位置を制御するために使用されています。

ここでは、フローサイトメーターでドロンパのphotoswitchingを研究するためにラモスB細胞にドロンパ - リンカー - ドロンパのタンパク質を発現しました。私たちのデバイスを使用して、我々は効率的にすることができたとリアルタイムでの蛍光強度を記録しながら再現性ドロンパをフォトスイッチ。この方法は、マニュアル照明で現在の照明プロトコルを介して実質的な利点を提供し、大幅に光遺伝学ツールとケージ化合物のための実験的なレパートリーを広げます。大幅に簡素化し、新たな光遺伝学ツールの発見と開発を加速する私たちのデバイスを使用しました。

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プロトコル

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1.デバイスの設計と構築

  1. パイロット実験
    注：特定の光遺伝学ツールおよび細胞型に必要な光強度が大幅に異なる場合があります。プロトタイプとパイロット実験は必要最小限の光強度を推定するのに有用です。以下の実験のために使用される光遺伝学ツールは、ドロンパ - リンカー - ドロンパ融合構築物です。ドロンパシーケンスは、商業的に（材料のリストを参照してください）を得ました。長いリンカーは、発現構築物は、分子内（分子間）二量体を形成することを可能にするために2つのドロンパ配列の間でクローニングしました。以下に説明する手順は、他の多くの光遺伝学ツールまたは光学的に制御された物質に適合させることができます。
    1. パッケージング細胞からのレトロウイルス含有上清を用いて、形質導入のための製造元の指示に従ってドロンパ - リンカー - ドロンパ含む構築物でラモスBリンパ球を伝達します。事前に応じて細胞を収穫し、カウントviouslyプロトコル13を発表しました 。
    2. 濃度で再懸濁し、細胞1×10 6培地中/ mLの（RPMI 1640、10％の熱不活性化FCS、2mM L-グルタミン、100U / mLのペニシリン、100 U / mLのストレプトマイシン、および50μMの2-メルカプトエタノール）ガラスFACSチューブに移します。
    3. フローサイトメーターの中にチューブを挿入し、ドロンパ（GFPチャンネル）14,15の蛍光強度を測定します。
    4. おそらく有害な波長から目を保護するために、すべてのさらなるステップのための保護メガネを着用してください。
    5. 手動でチューブの外側に500 nmのLEDライトを配置し、ドロンパの蛍光強度を測定し続けます。
    6. ドロンパの蛍光強度が減少するまでのLEDライトの数および/または強度を増加させます。
    7. 手動でチューブの外側に400nmのLEDライトを配置し、ドロンパの蛍光強度を測定し続けます。
    8. ドロンパのFLUOまでLED照明の数および/または強度を上げます強度が増加するrescence。
    9. ステップ1.1.5と1.1.7でphotoswitchingから必要であると予測されるようにデバイスを構築するために、少なくともとして多くのLEDライトを使用してください。
  2. デバイスの構築
    注：デバイスはフライブルク大学からプロの加工ショップ、Arbeitsgruppe Technikでによって建てられました。ほとんどの部分はカスタムメイドであり、市販されていません。各部分の正確な寸法は、 図1および図 2に示されています。この装置の組み立てを明確にするために、補足ビデオ1が設けられており、最も重要なステップは、以下に記載されています。
    1. 図1Aに示されている正確な測定値を有するポリ塩化ビニル（PVC）からミル片A。
    2. ピースAのドリル穴にLEDライトを挿入し、水漏れを防ぐために、塩ビ接着剤で各穴を塞ぎます。
    3. （各波長が別々のchannを占有しなければならないマルチチャンネル変圧器にLEDを接続します0〜29ミリアンペアから調整可能な出力電力とエル）。
    4. 物理的な損傷からLEDを保護するために描かれているようにピースAに3本のネジで、外側シース（B）を取り付けます。
    5. ピースAの開けた穴にチューブクリップ（C）内の水ポンプ、接着剤にデバイスを接続できるようにするには（ 図1aに示された、断面Y：9ミリメートルと61.5ミリメートル）のPVC接着剤を使用しました。
    6. 58.5ミリメートル長いプレキシグラス管（D1）をカットします。
    7. 図2に示すようにプレキシグラスから作品D2とD3を製造しています。
    8. プレキシガラス接着剤でD1の底に接着剤ピースD3。
    9. ピースD2にゴム製のOリングを取り付け、プレキシグラスの接着剤でD1の一番上に接着。
      注：ピースD1、D2、D3が一緒にピースDを形成します
    10. 3本のネジでピースAにピースDを挿入します。
    11. 変圧器に電源を適用する前に水漏れのためのデバイスをテストします。

2.光遺伝学ツールの速度論を測定

  1. 細胞を準備
    1. RPMI培地中で培養ラモスB細胞（RPMI 1640、10％熱不活性化FCS、2mM L-グルタミン、100U / mLのペニシリン、100 U / mLのストレプトマイシン、および50μMの2-メルカプトエタノール）3-密度10×10 6細胞/ mL、37℃で、5％CO 2。
    2. 5分間350×gで4℃での遠心分離により収穫ラモスB細胞。
    3. 製造者の指示に従ってノイバウアー計数チャンバーを用いて細胞を計数し、600μL培地に1-5×10 6個の細胞を懸濁します。
    4. ガラスFACSチューブに細胞を移し、氷の上に置くと、測定まで、光から保護。
  2. フローサイトメーターおよび機器を準備します。
    1. 加熱された水ポンプにデバイスを接続し、37℃に温度を調整します。
    2. ガラスFACSチューブを使用する場合は、ゴム製のOリングを用いて、フローサイトメーターの黒いOリングを交換し、さらにシリコングラムを適用します楽。
  3. 測定
    1. 慎重にデバイスにガラスFACSチューブを挿入します （ 図3）フローサイトメーターに接続します。
    2. 測定を開始し、ドロンパ蛍光強度（GFPチャネル）を記録。
    3. それぞれが400nmまたは500 nmの光で細胞試料を照射し、ドロンパの蛍光強度（GFPチャネル）を記録。
  4. データ分析
    1. ソフトウェアサイトメーターの適切な流れに実験データを分析します。側方散乱およびゲート生きた細胞に対してプロット前方散乱。経時ドロンパの蛍光強度をプロットします。

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結果

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フローサイトメーターとLEDサーモフローを使用して

装置の機能コアは光が内側に向いて円形に配置されたLEDれた円筒状のチャンバです。このチャンバーは給水ポンプ、LEDの温度を制御することができ、ならびに細胞サンプルに接続することができます。 LEDは、変圧器に接続され、したがって、各波長に対する光強度を個別に制御することができます。デバイスの中心は最も標準的なフローサイトメーター（ 図4、図 5）に接続することができ、標準サイズFACSチューブを収容します。細胞の望ましくない加熱をもたらさない私たちのデバイスでその照明を表示するために、我々は3つの異なる波長のために時間をかけて点灯し、PBSの温度（ 図6）を測定しました。 360nmで、400nm以下500nmの持つ照明のみにつながります限界温度上昇。温度制御された細胞サンプルの再現可能な照明がフローサイト...

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ディスカッション

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LEDサーモフローは、フローサイトメーターで光遺伝学ツールを研究するための革新的なデバイスです。

これまでのところ、光遺伝学のサンプルを顕微鏡レーザーや懐中電灯のデバイス11,12のみで照らされてきました。試料に懐中電灯の角度と距離に応じて、照明の量の大幅な変動が実験間で期待されています。また、1人での実験で動作することができる懐中電灯の数には限界があります。これは実験的なレパートリーと再現性を制限します。これらの制限は、生細胞におけるリアルタイムphotoswitching動態を特徴付けるために使用することができる私達の装置の開発中に対処されました。我々の知る限り、全く同等のデバイスが存在しません。

現在の構成では、最大30のLEDは、一サーモフローチャンバ内に組み込むことができます。このように、各波長のために必要とされる光の強度に応じて、単一のデバイスは、私たちすることができます光遺伝学ツールの多種多様な編。確立photoswitchingプロトコルは、その後、カルシウムフラックス測定値、 ...

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

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装置を製作してくださったフライブルク大学のJ.シュミットに感謝します。P.ニールセンとD.メジェシには、この原稿の支援と批判的な読解に感謝します。本研究は、SFB746を通じてドイツ研究振興協会の支援を受け、ドイツ研究財団のエクセレンス・イニシアティブ(GSC-4, Spemann Graduate School)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ガラス製FACSチューブサーモフィッシャーサイエンティフィック;ウォルサム、米国14-961-26ホウケイ酸ガラス管 12x75 mm
フローサイトメーターBD Bioscienceg;ハイデルベルク、ドイツフォルテッサII特別注文
ドロンパ:pcDNA3-mNeptune2-NAddgene;米国ケンブリッジ41645
PolyJetSignaGen, Rockville, USASL100688
LED 505 nmAvago Technologies;Boeblingen、ドイツHLMP-CE34-Y1CDD
LED 400 nmAvago Technologies;Boeblingen、ドイツUV5TZ-400-15
プレキシガラス管 15 mmMaertin;フライブルク、ドイツ76999
プレキシガラス 3 mmマーティン;フライブルク、ドイツ692230
プレキシガラス 2.5 mmメルチン;フライブルク、ドイツ692225
プレキシガラス 1.5 mmMaertin;フライブルク、ドイツ692215
PVCタイル5 mmMaertin;フライブルク、ドイツ690020.005
PVCタイル6 mmMaertin;フライブルク、ドイツ690020.006
PVC ブロック 50 mmメルティン;フライブルク、ドイツ690020.050
RPMIInvitrogen、Life Technologies;ダルムシュタット、ドイツ61870-010
2-メルカプトエタノールEMD;ドイツ805740
FCSPANバイオテクノロジー;Aidenbach, GermanyP30-3302
Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL)Invitrogen, Life Technologies;ダルムシュタット、ドイツ15140-122
Acrifix プレキシガラス接着剤Evonic industries, Essen, Germany1R0192
Tangit PVC-U glueHenkel, Düドイツ、
ッセルドルフ

参考文献

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