グループBのマウスモデル連鎖球菌膣植民地化

サマリー

このプロトコルの目的は、マウスモデルでヒトB群連鎖球菌(GBS)の膣コロニー形成を模倣することです。この方法は、宿主の免疫応答やGBS膣の持続性に寄与する細菌因子の調査、および治療戦略のテストに使用できます。

要約

成人の30％ - ストレプトコッカス・アガラクティエ （B群連鎖球菌 、GBS）は、消化器および10の膣管のグラム陽性、無症候性植民です。新生児、妊婦、高齢者を含む免疫無防備状態の個体では、GBSは、敗血症、関節炎、肺炎、および髄膜炎を引き起こす侵襲性の病原体に切り替えることができます。 GBSは、新生児の主要な細菌性病原体であるため、現在の予防は、GBS膣コロニー形成およびGBS陽性の母親のその後の周産期抗生物質による治療のための妊娠後期のスクリーニングから構成されています。ヘビーGBS膣の負担が新生児疾患と植民地化の両方の危険因子です。残念ながら、少しはホストと促進またはGBS膣コロニー形成を可能にする細菌の要因について知られています。このプロトコルは、細菌ロアを決定するために、単一のβエストラジオール前処置と毎日のサンプリングを使用して永続的なGBS膣コロニー形成を確立するための技術を説明しますD。また、さらに詳細な方法関心の追加の治療薬または試薬を投与すると、膣洗浄液および生殖管の組織を収集します。このマウスモデルは、妊娠中の母体の膣コロニー形成を制御し、脆弱な新生児への送信を防止するために、潜在的な治療標的につながる膣環境内GBS-ホスト相互作用の理解を促進します。また、女性の膣管内の一般的な細菌宿主相互作用の我々の理解を高めるために対象としています。

概要

ストレプトコッカス・アガラクティエ 、B群連鎖球菌 （GBS）は、頻繁に腸と健康な成人の尿生殖路から隔離されているカプセル化された、グラム陽性細菌です。 1970年代には、GBSは毎年、新生児の病気の7,000以上の例¹で、感染新生児死亡率の主要な薬剤として登場しました。早期発症GBS疾患（EOD）が肺炎や呼吸困難として生じる、最初の数時間または生命の日に発生し、多くの場合、遅発性疾患（LOD）のに対し、敗血症に発展する数ヶ月後に続いて起こると頻繁に菌血症、と提示します²髄膜炎に進みます。 2002年のように、疾病管理予防センター（CDC）は、GBS陽性の母親¹に妊娠後期や分娩に抗生物質予防法（IAP）でGBS膣植民地化のための普遍的なスクリーニングを推奨しています。毎年IAPによる米国では約千例に早期発症疾患の減少にもかかわらず、GBSは、早発型新生児敗血症の主要な原因のままであり、遅発性の発生は¹影響を受けないままです。子宮内かどうかは、労働者の間に、あるいは遅発性の場合には、GBSの新生児の暴露は髄膜炎、高度に規制血液の交差した場合に、ホスト環境や障壁、免疫回避の数を介して生存、横断を必要とし、脳関門^2。新生児内のこれらの病原性の相互作用の上流には、母体の膣管の初期の植民地です。母体のGBS膣コロニー形成率は^12.7％3,4の推定平均速度で、先進国と途上国での8から18パーセントの範囲です。妊娠中の膣管のGBSコロニー形成は、個々の女性の⁵の間で自然の中で、一定の断続的な、または一過性であってもよいです。興味深いことに、母体の年齢> 36年には、永続的植民地化⁶に関連しています。 GBS膣植民地化のための多数の生物学的および社会経済的なリスク要因同定されています。生物学的因子は、胃腸GBSのコロニー形成および腸内で乳酸桿菌の不在が含まれます。しかし、民族性、肥満、衛生、および性的活動もGBS膣キャリッジ⁷に関連しています。

新生児の感染を引き起こすための悪名高いが、GBSはまた、母体の感染症の両方の周産期および産後の様々な原因となります。 GBSキャリッジも疾患実体⁹とすることができる、いくつかのケースでは、膣炎⁸を呈する女性で増加しています。また、妊娠中の生殖器官のGBSの昇天は、羊膜内感染症または絨毛羊膜炎¹⁰になることがあります。また、妊娠の3.5％までに、GBSは、尿路感染症や無症候性細菌尿^11を引き起こすために膀胱に発信しています。妊娠中のGBS細菌は、分娩の発熱、絨毛羊膜炎、早産、およびprematurのリスク増加と関連しています膜¹²の電子破裂。まとめると、膣管内のGBSの存在は、複数の宿主組織の感染症にリンクされており、このニッチからGBSを排除する能力の両方の妊産婦と新生児の健康のために不可欠です。

最近まで、頸膣管とGBSの相互作用を調べる作業の大半は、in vitro細胞モデル^13-15に制限されていました。これらのin vitroの実験では、表面タンパク質を含む接着のために重要である細菌の要因を、明らかにしたような線毛およびセリンリッチリピート^17,18と同様に、二成分調節系^15,19と膣上皮のグローバルな転写応答GBS ^19。しかし、完全に膣路内にホスト微生物の相互作用を解明するために、堅牢な動物モデルが必要です。初期の研究は、GBSは、接種したマウス^20,21およびラットの膣管から回収することができることを実証しました^{両方の妊娠と非妊娠状態の22。 2005年には、短期的なGBS膣植民地化は、24時間の期間23にわたって膣GBSを治療するためのファージ溶菌酵素の有効性を調べるために、マウスでモデル化しました。数年後、長期GBS膣植民地化のマウスモデルは、GBSの永続性を管理するホストおよび細菌の要因を研究するために開発されました。このモデルは、表面付属17,18およびGBS 2成分系19,24を含むコロニー形成に貢献する数々のGBS因子を同定しました。このモデルは、ホスト応答機構19,25の同定に貢献してきたし、免疫調節ペプチド26とプロバイオティクス27を含むいくつかの治療戦略をテストするために使用されました。このプロトコルは、マウスの膣管内にGBSを接種し、その後コロニー形成を追跡し、さらなる分析のためのサンプルを収集するために必要な指導を提供します。}

プロトコル

すべての動物作業は、サンディエゴ州立大学の実験動物ケアオフィスによって承認され、受け入れられた獣医学基準の下で実施されました。この方法の開発には、8〜16週齢の雌マウスを使用しました。

1. β-エストラジオールの調製と腹腔内注射

1. 適切な個人用保護具(PPE)を着用しながら、β-エストラジオール(0.5 mg /マウス)を計量紙で測定します。.注意:β-エストラジオールは、皮膚や粘膜の表面から吸収される可能性があります。
2. β-エストラジオールを15mlの円錐管に移し、すべての塊が取り除かれ、β-エストラジオールが微粉末になるまで渦巻きます。ごま油(100μl/マウス)を10mlのシリンジに吸い込みます。シリンジフィルターでゴマ油をβ-エストラジオールが入った15mlの円錐管に0.45μmフィルターで入れます。β-エストラジオールがゴマ油中の均質な懸濁液になるまで、15mlの円錐管をボルテックスします。
3. β-エストラジオール懸濁液を新しい10mlシリンジに引き込みます。.18 G、1インチ。針、懸濁液100μlを1 mLのツベルクリン注射器に分注します。マウスごとに1つのシリンジを準備します。新しい滅菌済み26 G、1/2インチを置きます。各ツベルクリン注射器に針を刺します。
4. ゴマ油100μl(5 mg/mL)に懸濁したβ-エストラジオール0.5 mgを、細菌接種の24時間前に各マウスに投与します。各マウスを腹腔内、下腹部象限、正中線のすぐ右または左に注入します(前述のように²⁸.
   注:注入部位の洗浄やクリッピングは必要ありません。

2. GBSの膣接種

1. 接種の1日前に、A909(血清型Ia)などの目的のGBS株の5 mLの一晩の液体培養物を、Todd Hewittブロス(THB)で37°Cで培養します。
2. GBSを1:10の容量で一晩培養し、新鮮なTHBに継代培養し、37°Cでインキュベートします。注:これには、GBSの株にもよりますが、通常2〜3時間かかります。
3. 継代培養物を滅菌済みの15mlコニカルチューブに移し、3,000 × gでバクテリアを5分間ペレット化します。細菌ペレットを200 μlの滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に再懸濁します。
4. 再懸濁したペレットを使用して、3〜5 mlのPBS(マウス10匹あたり1 ml)を新しい5 ml培養チューブで正確にOD₆₀₀ = 0.4にします。これは、~1 ×^{10 8}コロニー形成単位(CFU)/mlの濃度になります。新しい15mlのコニカルチューブに移し、バクテリアを3,000 × gで5分間再ペレット化します。上清を吸引します。
5. ペレットをPBSに元の容量の1/10で再懸濁します。例えば、3 mLのOD₆₀₀ = 0.4をペレット化した場合、300 μlのPBSに再懸濁します。注:これは、動物への接種に使用される最終的な細菌懸濁液(~1 × 10⁹ CFU/ml)です。
6. この懸濁液50 μlを段階希釈し、THB寒天上に播種して正確な接種物を決定するために予備します。
7. 各マウスに10 μlの最終細菌懸濁液を接種し、各マウスに1 × 10⁷ CFUが投与されるようにします。
   1. 接種するには、前述のように、ハンドラーの親指と人差し指の間の首筋の緩んだ皮膚を固定し、次に尾を固定することにより、マウスを手動で拘束します²⁸。
   2. ステップ2.6で調製したGBS10 μlを200 μlのゲルローディングピペットチップに吸引します。先端を膣内腔に5〜10mm挿入し、10μlの接種液を分注します
      注:ゲルローディングチップは、特に若年または小型のマウスにおいて、臓器の外傷や損傷のリスクを最小限に抑えるために、標準的な200μlチップよりも好まれます。
   3. 接種直後に、首筋を離し、マウスの後端を持ち上げ、マウスの尾を持ち上げ、前足を硬い表面で~1分間歩きます。
   4. 接種の逆流がないか膣口を目視検査します。逆流が観察された場合は、新しいピペットチップを使用して膣口を操作または拡大し、逆流の内腔への取り込みを促進することができます。さらに、逆流はピペットで吸引し、再接種することができます.
      注:局所剤、プロバイオティクス生物、または目的のタンパク質を投与する場合は、生理学的緩衝液中の最大20μlの容量を膣管に投与することができます。

3. GBS負荷を定量化するための膣内腔のスワブ

1. 100 μlのPBSを加えて、マウス1匹につき1.5 mLの微量遠心チューブを1本調製します。綿棒を拭く直前に、綿棒をPBSで事前に濡らします。
2. 手順2.7.1の説明に従ってマウスを拘束し、綿棒を膣内腔に10mm挿入します。綿棒を時計回りに4回、反時計回りに4回ゆっくりと回転させ、膣壁にわずかな圧力をかけます。
3. 綿棒を100 μlのPBSを入れた1.5 mLの微量遠心チューブに移します。めっきする前に、微量遠心チューブを~15秒間ボルテックスして、スワブから細菌を放出します。各サンプルをPBSで連続希釈し、メーカーの指示に従って調製した微分培地寒天プレートで20μlの希釈液を1:10から1:10,000にプレートします。プレートを37°Cで24時間インキュベートすると、GBSコロニーは明るいピンク色または藤色に見えます。他の内因性植物相は阻害されるか、青、白、または灰色のコロニーとして現れます。

4. 膣洗浄液の収集

1. ステップ2.7.1の説明に従ってマウスを拘束します。200 μlゲルローディングピペットチップを使用して、20 μlのPBSを膣内腔にピペットで移します。ルーメン内で全容量を4回静かにピペットで上下させ、同じピペットチップで全容量を引き出します。注:洗浄液が粘液で濃厚な場合は、標準の200μlピペットチップを使用して最終的な洗浄液を収集できます。
2. サイトカイン分析やCFU定量のために洗浄液を節約する場合は、0.7 mLの微量遠心チューブに分注してください。発情の段階を決定する場合は、少なくとも5 μlの洗浄液をスライドガラスに分注し、光学顕微鏡で100倍の倍率で細胞を観察します。注:発情期の例については、図1を参照してください。

5. 組織解剖と均質化

1. 各マウスについて、3つの2mlスクリューキャップチューブを準備します(各組織:膣、子宮頸部、および子宮に1本)。各チューブに十分な(0.4〜0.5 g)1.0 mmジルコニアビーズを充填して、チューブの円錐形の底を覆います。
2. 特に細菌負荷を定量化する場合は、組織を採取する前に、121°Cで30分間調製したチューブをオートクレーブします。各チューブに500 μlの滅菌PBSを加えます。オートクレーブ後に各チューブを秤量し、将来の参照のために記録して回収された組織重量を計算します。
3. CO₂窒息や子宮頸部脱臼などの承認された制度的方法を使用してマウスを犠牲にします。腹側腹部に70%EtOHをスプレーします。滅菌ハサミで腹骨盤を開き、背中の皮膚と腹筋を持ち上げ、生殖管が露出するように腸を変位させます。
4. はさみを70%EtOHで滅菌し、必要に応じてきれいに拭き取り、子宮体と卵巣の間の両方の子宮角を中間の長さに切ります。はさみと鉗子を使用して、内臓脂肪、膜、および膀胱を生殖管から分離し、尾側に移動します。
5. 手順5.4で説明されているように、はさみを滅菌します。生殖管を体から分離するために、膣をできるだけ外陰部の近くで横方向に切ります。無傷の生殖管を持ち上げて取り外し、滅菌ペトリ皿に入れます。.
6. 新しいかみそりの刃を使用して、子宮を子宮頸部から1回横方向に切ります。カミソリの刃を70%EtOHで滅菌し、次に子宮頸部を膣から1回の横切りで分離します。注:子宮頸部に付着した子宮組織の量は最小限に抑えられます。子宮頸部に付着した膣組織の量は最小限に抑えられます。
7. 滅菌鉗子を使用して、各組織をPBSと均質化ビーズを含むそれぞれの2mlチューブに移します。各組織の取り扱いの間に70%EtOHで鉗子を洗浄します。
8. 各2mlスクリューキャップチューブの重量を量り、チューブの元の重量を差し引いて組織の重量を決定します。組織の重量は通常20〜100mgの間で変動します。スクリューキャップチューブをしっかりと密封し、組織ホモジナイザーで組織を最大速度で1分間均質化します。
9. 細菌負荷を定量するには、25 μLの組織ホモジネートとプレート希釈液を1:10から1:10,000の差圧培地寒天プレートで連続希釈します。ステップ3.3の説明に従ってプレートをインキュベートします。サイトカイン定量用のサンプルを保存するには、組織ホモジネートを-20°Cで凍結します。

結果

このモデルの開発中に、GBS膣のコロニー形成の期間に影響を与える要因について複数の観察が行われました。接種時の発情期がGBS細菌の持続性にどのように影響するかを決定するために、マウスを接種日に膣洗浄液を介してステージングしました。図1は、マウスの発情周期の4つの段階を示しており、これは、確立された方法であるウェットマウント膣洗浄液によって決定される²⁹。この初期段階に基づいてマウスをグループに分け、GBSの持続性を膣スワブで経時的にモニターしました。発情前期に接種されたマウスは、他のどの発情期よりも長くGBSに定着し、特に接種時に発情期のマウスに定着しました(図2)。これらの結果に基づき、現行モデルでは、GBS接種の1日前にマウスにβ-エストラジオールを投与し、発情前期に同期

させる。

他の生殖管感染症のマウスモデルでは、外因性エストラジオール治療を通じてマウスが発...

ディスカッション

宿主と他の微生物の両方とのGBS相互作用の理解をさらに進めるためには、動物モデルが必要です。この研究では、マウスにおけるGBS膣コロニー形成の確立の技術的側面について説明します。このプロトコルは、細菌を接種したり、綿棒サンプルを採取したりするための麻酔薬、コロニー形成を可能にする免疫抑制剤、膣の予備洗浄、または接種物を増厚させるための添加剤を使用せずに、マウスの90%>コロニー形成を達成します。さらに、このモデルは、GBSの持続期間と細菌負荷の両方において適度な実験間のばらつきがあり、堅牢な再現性を示しています。この研究で実証された代表的な結果は、独立した実験の編集であり、将来の実験計画の参考となるはずです。ただし、GBS系統とマウス系統間の直接比較は注意して行う必要があります。

このモデルは、マウスの粘膜膣GBSコロニー形成が生殖管に限定されているように見えるという点で、ヒトのコロニー形成を模倣しています。子宮頸部および子宮への上昇は複数のGBS株で観察されていますが²⁵、マウスは、数か月のコロニー形成の後でも、罹患率または死亡率の兆候を示しません。さらに、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ごま油	シグマ アルドリッチ	S3547-250ML&
beta;-エストラジオール	シグマアルドリッチ	E8875-1G	注意:適切なPPEを着用してください。「エストラジオールは皮膚や粘膜の表面から吸収される可能性があります。」
200 μl ゲルローディングピペットのヒント	USA Scientific	1252-0610
尿道性器、滅菌、アルギン酸カルシウム綿棒	ピューリタン	25-801 A 50
CHROMagar StrepB	DRG International	SB282
Todd Hewitt Broth	Hardy Diagnostics	7161C
18 G、1.5 インチ ニードル	BD	305199
26 G、0.5 インチ ニードル	BD	305111
10 mlシリンジ	BD	309604
1 mlシリンジ	BD	309659
0.45 μm PVDFシリンジ	フィルターWhatman	6900-2504
Dulbeccoのリン酸塩緩衝塩溶液1x	Corning	21-031-CV