ここでは、固形腫瘍および血液悪性腫瘍における薬剤耐性に異常なスプライシングの影響を調査することを目的とプロトコルについて説明します。この目標のために、我々は、RNA-seqのを介してin vitroモデルにおける親及び抵抗性のトランスクリプトームプロフィールを分析し、候補遺伝子を検証するための定量RT-PCRベースの方法を確立しました。
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方法論記事
に薬剤耐性に関連する新規スプライス変異体を検出するために、RNA配列決定を使用して、
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
薬剤耐性は、血液悪性腫瘍および固形腫瘍の両方のために、癌の治療における主要な問題です。内因性または抵抗が大きく薬物除去を含む、メカニズムの範囲によって引き起こされる可能性が取得された、薬物摂取、薬物の不活性化、および薬物標的の変化を減少させました。最近のデータは、他よりはよく知られている遺伝子（突然変異、増幅）およびエピジェネティックな（DNAの過剰メチル化、ヒストンの翻訳後修飾）修飾により、薬物耐性の機構はまた、スプライシング異常によって調節されるかもしれないことを示しました。これは、より効果的な治療法を計画するために、将来の注目に値する研究の急速に成長している分野です。この論文に記載されているプロトコルは、固形腫瘍および血液悪性腫瘍における薬剤耐性に異常なスプライシングの影響を調査することを目的とします。この目標のために、我々は、RNA-seqのを介してin vitroモデルにおけるいくつかのトランスクリプトームのプロファイルを分析し、確立しますED定量RT-PCRに基づく方法は、候補遺伝子の妥当性を検証します。特に、我々はDDX5とPKM転写産物の差動スプライシングを評価しました。計算ツールマットによって検出された異常なスプライシングが異なるDDX5スプライス変異体は、親対抵抗性細胞において発現されることを示し、白血病細胞において確認されました。これらの細胞では、我々はまた、ゲムシタビン曝露によって誘発される薬剤耐性の異なるメカニズムを示唆し、親PANC-1細胞と比較して、PANC-1、ゲムシタビン耐性の対応では検出されなかった高いPKM2 / PKM1比を、観察しました。
概要
癌治療、化学療法に対する悪性細胞の抵抗、いずれかの真性または長期の薬物曝露の際に取得にかなりの進歩にもかかわらず、白血病および固形腫瘍1の広い範囲で治療失敗の主な理由です。
薬剤耐性の機序を描写するために、 インビトロ細胞株モデルにおいて化学療法剤に耐性の癌細胞の段階的な選択によって開発されています。この手順は、臨床現場で使用される体制を模倣し、従って、関連する耐性機構の深さ調査にできます。処置を生き延びる耐性細胞は、次いで、細胞生存性/細胞毒性アッセイ2を使用して、親の感受性細胞と区別されます。初代細胞のインビトロでの薬剤耐性プロファイルに化学療法3に対する臨床応答に有意に関連することが示されています。
ハイスループットcytotoxicityアッセイは、in vitroでの薬剤感受性を決定するための便利な方法を構成しています。本明細書において、細胞の生存率は、によって評価される、例えば、3- [4,5-ジメチルチアゾール-2-イル] -2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド- すなわち 、特定の基質の代謝的変換（に基づいているMTTアッセイ4、それによって、細胞のミトコンドリア活性を....
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プロトコル
細胞毒性アッセイを介して薬剤耐性プロファイルの特徴付け
- 白血病細胞株培養
- 親のT細胞を含む10ミリリットルRPMI-1640培地中で25cm 2の中のすべての細胞株CCRF-CEM（CEM-WT）と同様に、CEM / R30dm、CEM-R5およびCEM-C3を含め、その薬剤耐性サブラインを、維持2.3μM、10％ウシ胎児血清および100単位/ mlペニシリンGおよび100μg/ mlストレプトマイシンを補充した葉酸。
- 文化、5％CO 2インキュベーター内で37℃の加湿雰囲気で細胞。
- 3×10 6細胞/ mlの- 2の間の濃度に細胞増殖を可能にします。
- 0.3×10 6細胞/ mlの初期濃度で1週間に2回、細胞を分割（ 例えば、細胞濃度を3×10 6細胞/ mlで9 mlの新鮮な培地を含む新たなフラスコ内の転送1mLの細胞懸濁液の場合）。 20回連続継代後に文化を捨てます。
- 膵癌細胞株の培養
注記：高グルコースおよび10％ウシ胎児血清および100単位/ mlのペニシリンGおよび100μg/ mlのストレプトマイシンを補充したL-グルタミン、10 mlのDMEM培地中で75cm 2
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結果
プロトコルに記載の細胞毒性アッセイは、in vitroでの化学療法剤に対する癌細胞の耐性を評価するための信頼性の高い強固な方法を提供します。 CEM / R30dm、CEM-R5及びCEM-C3：MTTアッセイにより、デックスに対する感度がデックス感受性親CEM-WT細胞を含む4つのT-ALL細胞株、および3つのDex耐性亜系統で決定しました。 Dexの耐性細胞株（640μM - 0.33 nM）を - 二つの異なる濃度範囲は、CEM-WT間の感度差が大きい（0.97 nMの2μM）のために使用しなければなりませんでした。 MTTアッセイは明らかにCEM-と比較して、CEM / R30dm（IC 50 = 456±49μM）、CEM-R5（IC 50> 640μM）およびCEM-C3（IC 50 = 386±98μM）でのDex性を示しましたWT細胞（IC 50 = 0.028±0.003μM）。同様にSRBアッセイは、IC 50 = 3.......
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ディスカッション
ここでは、十分に確立された細胞毒性のスクリーニング技術を組み合わせて、強力なNGSベースのトランスクリプトームは、薬剤耐性に関連する差動スプライシング事象を識別するために分析する新規な方法を記載します。分光光度アッセイは、in vitroでの癌モデルにおける薬剤感受性を評価するための便利で堅牢なハイスループット法であり、細胞毒性スクリーニングを行う多くの研究室のための最初の選択肢を表します。このメソッドのトラブルシューティングだけでなく、可能なバリエーションは広範囲に他の場所で4,5説明しました。
ハイスループットゲノムは、現在のSNP検出に主に依存し、特定の薬剤耐性表現型に関連する遺伝子の発現の推定差分薬剤耐性メカニズムを調査するために使用される分析します。本研究では、正確なmRNA転写物の注釈とDIFの検出のための堅牢なバイオインフォマティクスパイプラインと一緒に、RNA配列決定法の使用を記載しています差動のスプライシング。記載されたプロトコルの特に重要な特徴は、別個の薬剤感受性プロファイルを有する2つのサンプルグループ間での新規スプライ.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
著者は、この研究で使用された耐性細胞株を提供してくださったJ.J. McGuire教授、R. Kofler教授、K. Quint博士に感謝の意を表します。この研究は、アムステルダムがんセンター(CCA)財団(JC、EG、RS)、KiKa(AWの小児がんフリー助成金)財団、中皮腫応用研究財団(VEGおよびEGへ)、Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro(AIRC)、Istituto Toscano Tumori(ITT)、 Regione Toscana Bando FAS Salute(EGへ)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| スルフォロダミン B | Sigma-Aldrich | 230162 | |
| トリクロロ酢酸 | Sigma-Aldrich | 251399 | |
| CCRF-CEM | ATCC, マナッサス, バージニア | 米国 ATCC CCL-119 | |
| Panc-1 | ATCC, マナッサス, バージニア | 米国 ATCC CRL-1469 | |
| DMEM 高グルコース | ロンザ, バーゼル, スイス | 12-604F | |
| RPMI-1640 | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 11875093 | |
| Fetal wevine and calf serum | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 758093 | |
| Penicillin G streptomycin sulphate | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 15140122 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
| MTT formazan | Sigma Aldrich | M2003 | |
| Anthos-Elisa-reader 2001 | Labtec, Heerhugowaard, Netherlands | UV-Vis 96-well plate spectrophotometer | |
| Greiner CELLSTAR 96ウェルプレート | Greiner/Sigma | M0812-100EA | |
| Trypsin/EDTA Solution 100 ml | Lonza, Basel, Switzerland | CC-5012 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82051-074 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82050-856 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) | B.Braun Melsungen AG, Germany | 362 3140 |
参考文献
- Gottesman, M. M. Mechanisms of cancer drug resistance. Annu Rev Med. 53, 615-627 (2002).
- McDermott, M., et al. In vitro Development of Chemotherapy and Targeted Therapy Drug-Resistant Cancer Cell Lines: A Practical Guide with Case Studies. ....
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再版と許可
