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方法論記事

に薬剤耐性に関連する新規スプライス変異体を検出するために、RNA配列決定を使用して、

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DOI:

10.3791/54714

⸱

2016年12月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Oncology/Hematology, VU University Medical Center, 2Department of Hematology, VU University Medical Center, 3Department of Medical Oncology, VU University Medical Center, 4Department of Clinical Genetics, VU University Medical Center, 5Division of General and Transplant Surgery, Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana, Universita’ di Pisa, 6Amsterdam Immunology and Rheumatology Center, VU University Medical Center, 7Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, 8Cancer Pharmacology Lab, AIRC Start-Up Unit, University of Pisa, 9Institute of Nanoscience and Nanotechnology, CNR-Nano

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、固形腫瘍および血液悪性腫瘍における薬剤耐性に異常なスプライシングの影響を調査することを目的とプロトコルについて説明します。この目標のために、我々は、RNA-seqのを介してin vitroモデルにおける親及び抵抗性のトランスクリプトームプロフィールを分析し、候補遺伝子を検証するための定量RT-PCRベースの方法を確立しました。

要約

薬剤耐性は、血液悪性腫瘍および固形腫瘍の両方のために、癌の治療における主要な問題です。内因性または抵抗が大きく薬物除去を含む、メカニズムの範囲によって引き起こされる可能性が取得された、薬物摂取、薬物の不活性化、および薬物標的の変化を減少させました。最近のデータは、他よりはよく知られている遺伝子（突然変異、増幅）およびエピジェネティックな（DNAの過剰メチル化、ヒストンの翻訳後修飾）修飾により、薬物耐性の機構はまた、スプライシング異常によって調節されるかもしれないことを示しました。これは、より効果的な治療法を計画するために、将来の注目に値する研究の急速に成長している分野です。この論文に記載されているプロトコルは、固形腫瘍および血液悪性腫瘍における薬剤耐性に異常なスプライシングの影響を調査することを目的とします。この目標のために、我々は、RNA-seqのを介してin vitroモデルにおけるいくつかのトランスクリプトームのプロファイルを分析し、確立しますED定量RT-PCRに基づく方法は、候補遺伝子の妥当性を検証します。特に、我々はDDX5とPKM転写産物の差動スプライシングを評価しました。計算ツールマットによって検出された異常なスプライシングが異なるDDX5スプライス変異体は、親対抵抗性細胞において発現されることを示し、白血病細胞において確認されました。これらの細胞では、我々はまた、ゲムシタビン曝露によって誘発される薬剤耐性の異なるメカニズムを示唆し、親PANC-1細胞と比較して、PANC-1、ゲムシタビン耐性の対応では検出されなかった高いPKM2 / PKM1比を、観察しました。

概要

癌治療、化学療法に対する悪性細胞の抵抗、いずれかの真性または長期の薬物曝露の際に取得にかなりの進歩にもかかわらず、白血病および固形腫瘍1の広い範囲で治療失敗の主な理由です。

薬剤耐性の機序を描写するために、 インビトロ細胞株モデルにおいて化学療法剤に耐性の癌細胞の段階的な選択によって開発されています。この手順は、臨床現場で使用される体制を模倣し、従って、関連する耐性機構の深さ調査にできます。処置を生き延びる耐性細胞は、次いで、細胞生存性/細胞毒性アッセイ2を使用して、親の感受性細胞と区別されます。初代細胞のインビトロでの薬剤耐性プロファイルに化学療法3に対する臨床応答に有意に関連することが示されています。

ハイスループットcytotoxicityアッセイは、in vitroでの薬剤感受性を決定するための便利な方法を構成しています。本明細書において、細胞の生存率は、によって評価される、例えば、3- [4,5-ジメチルチアゾール-2-イル] -2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド- すなわち 、特定の基質の代謝的変換（に基づいているMTTアッセイ4、それによって、細胞のミトコンドリア活性を反映して着色された製品へのテトラゾリウム塩）、。あるいは、細胞のタンパク質含有量は、スルホローダミンB（SRB）アッセイ5を用いて定量することができます。ここでは、生存細胞の数は、必要とせず、分光光度計に適切な波長で測定した光学密度（OD）に比例します 広範かつ時間のかかる細胞計数手順を。特定の化学療法剤によって誘導される成長阻害は、細胞が、試験薬剤で処理し、未処理対照細胞のODと比較したウェルのODに基づいて計算することができます。用量反応曲線はobtaあります細胞を制御するために相対生存細胞の割合対薬物濃度をプロットすることによりINED。最後に、薬物感受性は、未処理細胞（IC 50）と比較して細胞増殖阻害の50％を生じる濃度として報告することができます。

薬剤耐性のメカニズムは、薬物活性および細胞代謝の決定因子の遺伝子発現に影響を与える変化のような多くの異なる異常を含みます。突然変異、異常な転写時および転写後レベルだけでなく、邪魔エピジェネティック制御を含むこれらの分子の病変は、多くの場合、薬物代謝やアポトーシス6のいずれかに関与する遺伝子に影響を与えます。

代替的なプレmRNAスプライシング、その複雑な調節は、最近、癌細胞7の薬剤耐性を決定することができる新規な実体としてかなりの注目を集めています。ヒト遺伝子の95％までの代わりにこのによって正常細胞にスプライスされ同じ遺伝子から多くの異なるタンパク質アイソフォームを生成しっかりと調節されたプロセス。選択的スプライシングは、多くの場合、癌において調節解除され、いくつかの腫瘍は、薬物代謝に関与する遺伝子の増加（ すなわち 、デオキシシチジンキナーゼ、葉酸ポリグルタミン酸合成酵素、または多剤耐性タンパク質）6,8の変化したスプライシングによって特徴付けられます。しかし、薬剤耐性細胞のスプライシングプロファイルの包括的な分析が痛いほど欠けています。したがって、選択的スプライシング分析のためのハイスループット方法を開発することが不可欠です。これは、より効果的な治療法の開発に役立つ可能性があります。

最後の十年の間に、次世代シーケンシング（NGS）技術の急速な発展は、ゲノム発現の調節および様々な生物学的プロセス9におけるそれらの役割を支配する分子メカニズムに新しい洞察力を持つ生物医学研究を豊かにしています。 RNAシーケンシング（RNA-seqの）強力なサブアプリケーションですトランスクリプトミクスの分野におけるNGSの。それは、同時に数千の遺伝子の発現パターンのゲノムワイドなプロファイリングを（定性的および定量的に）可能にし、新たなコーディングmRNAの特性評価だけでなく、長い非コードRNA、miRNAのは、siRNA、および他の小RNAに適していますクラス（ 例えば 、snRNAをとのpiRNA）10,11。

RNA-のSeqは、トランスクリプトームの特徴づけ（ 例えば、サンガー配列決定及び発現マイクロアレイ）の以前の技術に比べて多くの利点を持っています。これは、既存のゲノム注釈に基づいていない、それは解像度の単一ヌクレオチドのレベルを有し、それは、発現レベルの推定のための広いダイナミックレンジを有しています。簡単に言えば、RNA-seqの実験の基本的な実験的なワークフローは、cDNAへの変換、ライブラリー構築、最終的には、大規模並列深いシーケンシング12,13に続いて、ポリアデニル化転写産物（mRNAの）選択と断片から構成されています。 sequencinの急速な低下に起因しますここ数年、RNA-seqのオーバーグラムコストは徐々に他の技術を交換し、重要な努力がライブラリの準備プロトコルを改善するために行われています。例えば、デオキシウリジン三リン酸（dUTPを）を有する第二鎖cDNAをマークし、PCR増幅の前に、ウラシルDNA-グリコシラーゼ（UDG）でマークされた鎖を消化することによってmRNA転写物のストランド情報を保持することが可能になりました。このプロセスは、遺伝子アノテーションと発現レベル14,15の推定精度を向上させます。

RNA-seqのデータの分析および解釈は、バイオインフォマティクスパイプライン16,17内の複雑で強力な計算ソフトウェアパッケージおよび処理を必要とします。まず、生のは、厳しい品質要求に達しない配列を技術的、生物学的なアーティファクトを除去し、廃棄する（トリミング）により品質管理を受ける読み取ります。続いて参照ゲノムにマッピングされ、インデックスが作成されている各サンプルに対して読み取り、遺伝子レベル、エクソンレベル、または転写物レベルに、各カテゴリの豊富さを決定するためです。用途に応じて、精製されたデータは、対立遺伝子特異的な発現、スプライシング、遺伝子融合、および単一ヌクレオチド多型（SNP）12を識別するための統計的モデルを介して計算されます。最後に、選択されたレベル（ すなわち、遺伝子発現または選択的スプライシング）の微分解析は、異なる条件下で得られた試料を比較するために使用することができます。

異なるスプライシング分析は、2サンプル間のスプライス部位の使用状況の違いを説明しています。この目的のために捧げられたソフトウェアパッケージの増加数は異なる統計モデル、パフォーマンスやユーザーインターフェース18に基づいてご利用いただけます。これらの中でも、MATS（トランスクリプトスプライシングの多変量解析）はベイズ統計の枠組みに基づいて、自由に利用できると正確な計算ツールとして現れ、diffeを検出するように設計します単一またはペアエンドRNA-seqのデータからrentialスプライシング事象。整列（.bam）ファイルから出発して、MATSは、選択的スプライシング事象のすべての主要なタイプを検出することができます（エクソンスキッピング、代替3 'スプライス部位、代替5'スプライス部位、相互に排他的なエクソンおよびイントロン保持を-また、 図1を参照します）。

まず、ソフトウェアの識別は、例えばエクソンスキッピングのために、特定のスプライシングイベントをサポートする読み出し、二つのタイプにそれらを分類します。調べエクソン内にマッピングし、その特定のエキソンと2上流と下流の隣接するエクソンの間の接合部にまたがる（標準的なスプライスイベントのために）」包含読み取り」。 2つのフランキングエクソンの間の接合部にまたがる（選択的スプライシングイベントのために）「スキップ読み取り」。その後、マットは両方の正準および代替イベントのための正規化された含有レベルを返し、サンプルまたは条件の間の値を比較します。最終的には、P値Aを算出しますND偽発見率（FDR）は、二つの状態の間の遺伝子の変異率の差が各スプライシング事象19,34の指定されたユーザ定義のしきい値を超えたと仮定します。

RNA-seqのと併せて、差動スプライシング解析に続いて、大規模な実験的検証は真陽性遺伝子候補18を識別するために保証されています。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（QRT-PCR）はRNA-、配列番号解析部20から得られた候補の検証の中で最も一般的に使用され、最適な方法です。本稿の目的は、固形腫瘍および血液悪性腫瘍における薬剤耐性関連のスプライシングプロファイルを調査するための堅牢な方法論を提供することにあります。我々のアプローチは、薬剤耐性に関与する候補遺伝子の検証のために確立された定量RT-PCR法と組み合わせた薬剤耐性癌の選択された細胞株モデルのRNA-配列に基づくトランスクリプトーム・プロファイリングを利用します。

本研究で用いたヒト白血病細胞株モデルは、小児T細胞急性リンパ芽球性白血病を含めた（T-ALL）細胞株CCRF-CEM（CEM-WT）、その2つのグルココルチコイド（GC）耐性サブクローンCEM -C7H2-R5C3（CEM-C3）とCEM-C7R5（CEM-R5）21,22およびメトトレキサート（MTX）耐性サブラインCEM / R30dm 23。 GCおよびMTXに基づいて、現在の治療法は、症例の約90％に臨床的有益性を確立しているが、GC-耐性の出現はまだ不明分子機構との未解決の問題を表します。 GC耐性サブクローンを単離するために、CEM-WT細胞は、2〜3週間、1μMのデキサメタゾン（Dexの）中で培養しました。 MTX耐性サブラインCEM / R30dmが繰り返さ短期（24時間）臨床プロトコルの模倣として30μMMTXへのCEM-WT細胞の曝露によって開発されました。興味深いことに、この細胞株はまた、メカニズムは完全には理解されていないデックスに対する交差耐性（未発表の結果）を表示します。

固体TUMまたは本研究で検討したモデルは、化学療法への特別な耐火性のための悪名高い、膵管腺癌です。この目的のために、我々は、薬剤24の1μMで連続インキュベーションによって得られたPANC-1細胞株およびそのゲムシタビン耐性サブクローンPANC-1Rを選択しました。に関連する新規なスプライス変異体を同定するためのRNA配列ベースのパイプライン、固形腫瘍からの白血病細胞および癌細胞における薬剤感受性を評価するために、比色細胞毒性アッセイ：ここでは、3つのプロトコルを組み合わせることによりインビトロ薬剤耐性の基礎となる新規のメカニズムを発見する方法を説明します薬剤感受性/抵抗およびRT-PCRおよび定量RT-PCR分析は、潜在的な候補者の妥当性を検証します。

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プロトコル

細胞毒性アッセイを介して薬剤耐性プロファイルの特徴付け

  1. 白血病細胞株培養
    1. 親のT細胞を含む10ミリリットルRPMI-1640培地中で25cm 2の中のすべての細胞株CCRF-CEM（CEM-WT）と同様に、CEM / R30dm、CEM-R5およびCEM-C3を含め、その薬剤耐性サブラインを、維持2.3μM、10％ウシ胎児血清および100単位/ mlペニシリンGおよび100μg/ mlストレプトマイシンを補充した葉酸。
    2. 文化、5％CO 2インキュベーター内で37℃の加湿雰囲気で細胞。
    3. 3×10 6細胞/ mlの- 2の間の濃度に細胞増殖を可能にします。
    4. 0.3×10 6細胞/ mlの初期濃度で1週間に2回、細胞を分割（ 例えば、細胞濃度を3×10 6細胞/ mlで9 mlの新鮮な培地を含む新たなフラスコ内の転送1mLの細胞懸濁液の場合）。 20回連続継代後に文化を捨てます。
  2. 膵癌細胞株の培養
    注記：高グルコースおよび10％ウシ胎児血清および100単位/ mlのペニシリンGおよび100μg/ mlのストレプトマイシンを補充したL-グルタミン、10 mlのDMEM培地中で75cm 2の培養フラスコ中でヒト膵臓癌細胞株PANC-1を維持。薬剤耐性変異、PANC-1Rは、滅菌水に溶解した1μMのゲムシタビンを含む同じ培地で培養されます。さらなる詳細は24で提供されます。
    1. 文化、5％CO 2インキュベーター内で37℃で細胞。
    2. 細胞が約90％コンフルエンスに達したときに5：1の割合で3日間 - すべての2セルを分割します。
    3. 細胞を分割し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回を洗浄し、75cm 2の培養フラスコあたりトリプシン/ EDTA 1 mlを加え、3分間37℃でインキュベートします。
    4. 9ミリリットル培地を追加し、15ミリリットルチューブに剥離した細胞を収穫。新しいフラスココンタでシード2ミリリットルの細胞懸濁液8ミリリットル培地ining。 20回連続継代後に文化を捨てます。
  3. 白血病細胞のためのMTTアッセイ
    1. 事前にMTT溶液を調製する：約1時間磁気撹拌機を（光から保護）10mlのPBSおよび撹拌にMTTホルマザンの500ミリグラムを溶解します。 0.22μmのフィルターで溶液を滅菌します。注：溶液を、-20℃で10mLのアリコートで保存することができます。解凍後、直接光から保護します。
    2. 事前に酸性化したイソプロパノールを準備：イソプロパノール2.5 Lに2 M HClを50ミリリットルを追加します。注：使用前に室温で少なくとも1ヶ月のためのソリューションを保存してください。イソプロパノールが正しく酸性化されていない場合は、媒体と沈殿物を形成し、分光光度読み出しを損なう可能性があります。
    3. 成長阻害のより正確な推定を確保するために、別の96ウェル平底「0日目」（コントロール）プレートを準備します。成長の30μlを添加、細胞株あたり3〜6井戸をささげます培地と、ブランク（細胞なし）に対応するウェルに成長培地の各ウェルに150μlのあたりの細胞懸濁液（8000細胞）の120μlの。光学密度（OD）を測定するには、このセクションの1.3.13をステップステップ1.3.9から進んでください。注：さらなる詳細は4で提供されます。
    4. 96ウェル平底実験プレートを準備します（（空白）細胞を含まない培地を制御するために、細胞および10のウェルを制御するために、薬物濃度（10濃度、各3回）、10ウェルに30井戸を捧げるとデキサメタゾンの薬物希釈範囲を準備溶媒としてジメチルスルホキシドを使用してDEX）。
      注：CEM-WT細胞についてDexの希釈範囲は2μMおよび0.97 nMの間にあります。 CEM / R30dmについて、CEM-R5およびCEM-C3細胞のDexの希釈範囲は640μMおよび0.33 nMの間にあります。
    5. 96ウェルプレートの適切なウェルにそれぞれDexの希釈から30μlのを追加します。三連で各濃度を含めるようにしてください。
    6. ウェルに増殖培地の30μLを追加Sはブランクに対応するウェルに、細胞および増殖培地の150μlのを制御するように対応します。
    7. 収穫は指数関数的にそれらの最適な播種濃度で細胞を再懸濁を成長させます。
      注：最適な出発細胞濃度を決定するために、それはいくつかの濃度で細胞を播種し、少なくとも4日間、毎日それを測定することにより、96ウェルプレート中の各細胞株の細胞株の増殖プロファイルを評価することが推奨されます。これはOD値を飽和させることにより、実験に影響を与えるように、72時間後の細胞の異常増殖を防ぐ播種濃度を選択してください。 CEM / R30dmのは5,000細胞/ウェルであるがCEM-WT、CEM-C5およびCEM-R5のための最適な播種濃度は、8000細胞/ウェルです。
    8. よく薬液や成長培地（細胞を制御するために、対応するウェル）のいずれかを含む各細胞懸濁液120μlのを追加します。プレートに良い湿度を確保するために、150μlのPBSでプレートの空の外側のウェルを記入し、番目をインキュベート細胞培養インキュベーター中で5％CO 2で37℃で72時間の電子版。
    9. 各ウェルにMTT溶液の15μlを添加して、/分で900揺れの最大プレートシェーカー上にして、5分間プレートを振ります。
    10. 細胞培養インキュベーター中、5％CO 2で戻って37℃でプレートを置き、別の4インキュベート- 6時間。
    11. 各ウェルに酸性化したイソプロパノール150μlを添加して、徹底的にすべてのホルマザン結晶を再懸濁するためにマルチチャンネルピペットでよく混ぜます。ブランクウェルから始めて、ウェルプレートの別の行に進む前に、ヒントを洗い流してください。
    12. 10分間室温（RT）でプレートをインキュベートします。
    13. マイクロプレートリーダーを使用して、バックグラウンドODを補正することで正確な測定を保証するために、540および720 nmでのODを決定します。その後、スプレッドシートファイルにデータを保存して、4を分析します。
  4. SRBアッセイ膵臓癌細胞のための
    1. 0.4％の最終濃度で1％酢酸中のSRB試薬を溶解する（W / V）。
    2. （w / v）の50％の最終濃度で超純水にトリクロロ酢酸（TCA）を溶解します。
    3. 10mMの最終濃度で、超純水中のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを溶解します。
    4. 成長阻害のより正確な推定を確保するために、別の96ウェル平底「0日」対照プレートの準備：シード適切な播種濃度で100μlの培地中で指数増殖期に増殖する細胞で6ウェルのみに対応するウェルに100μlの培地を追加ブランク。プレートへの細胞の適切な接着を確実にするために、5％CO 2で37℃で一晩インキュベートします。そして、すべてのウェルに100μlの培地を追加し、ステップ1.4.8に進み - このセクションの1.4.16。
    5. 96ウェル平底実験プレートを準備します。私の100μl中の適切な密度で96ウェル中の三連で指数増殖期に成長している種細胞平底プレートマルチチャンネルピペットを使用してdium。
      注：最適な出発細胞濃度を決定するために、それはいくつかの濃度で細胞を播種し、少なくとも4日間、毎日それを測定することにより、96ウェルプレート中の各細胞株の細胞株の増殖プロファイルを評価することが推奨されます。これはOD値を飽和させることにより、実験に影響を与えるように、72時間後の細胞の異常増殖を防ぐ播種濃度を選択してください。 PANC-1およびPANC-1R細胞については、最適な播種濃度/ウェル8000細胞です。
    6. 培地のみのウェルに100μlの培地を加え、プレートへの細胞の適切な接着を確実にするために、5％CO 2で37℃で一晩インキュベートします。
    7. PANC-1R細胞を1μMおよびPANC-1および1 mMのための10および100nMの間ゲムシタビンの薬物希釈範囲を準備します。マルチチャンネルピペットを用いて、96ウェルプレートの適切なウェルに各希釈液から100μlを添加します。三連で各濃度を持っていることを確認してください。加えて、培地のみのウェルおよび対照細胞に100μlの培地を追加します。 72時間、5％CO 2で37℃でインキュベートします。
    8. マルチチャンネルピペットを用いて、ウェルに25μlの冷たいTCA溶液を追加し、ウェルの底でタンパク質を沈殿させ、固定するために4℃で少なくとも60分間プレートをインキュベートします。
    9. 組織上の媒体及び乾燥を簡単に除去することによって、プレートを空にします。
    10. プレートを空にし、室温で乾燥させた後、水道水で5回洗浄します。
    11. 室温で15分間リピート・ピペットと染色を用いて、ウェルあたり50μlのSRBソリューションを追加します。
    12. SRB染色を除去することによって、プレートを空にします。
    13. プレートを空にし、室温でそれを乾燥させた後、1％酢酸で4回洗浄します。
    14. マルチチャンネルピペットを用いて、ウェル当たり150μlのTris溶液を追加し、/分で900揺れの最大プレートシェーカーアップで3分間混合します。
    15. トン場合は540 nmの（または492nmでの光学密度を読みます彼は）値が高すぎるOD。
    16. データを分析します。
  5. MTTとSRBアッセイのためのデータ分析
    1. -平均OD ブランクウェル OD 0日 = OD 対照細胞 ：以下の式を使用して「0日」の細胞のOD値を計算します
    2. 以下の式に従って、各薬物濃度について生存細胞の割合を計算します。％処理細胞=平均[OD 処理された細胞 -平均OD ブランクウェル - OD 日0] / [OD コントロール細胞 -平均OD ブランクウェル - OD Day0] * 100
    3. 用量反応曲線（％での成長阻害対薬物濃度）をプロットします。
    4. 用量応答曲線を用いて、50％（IC 50）によって細胞の増殖を阻害する薬剤の濃度を算出します。

RNA-配列決定のため2. RNAの単離とライブラリの準備

  1. サンプルコルectionとRNAの単離
    1. CEM細胞について：培地から直接的に10 6細胞を回収。
    2. PANC-1およびPANC-1Rの場合：、培地を除去し、PBSで細胞を2回洗浄し、トリプシンEDTAを添加し、3分間37℃でインキュベートすることによって切り離します。培養液を追加し、10 6細胞を採取します。
    3. 3分間300×gでサンプルをスピンダウンし、上清を除去し、manufacturer`sプロトコルに従うことにより、市販のシリカ膜のスピンカラムを使用して全mRNAを抽出します。
    4. 紫外可視分光光度計を用いて、全RNAの濃度および純度を決定します。
      注：260 NM / 280 nmの吸光度比が1.8以上であれば、RNAは高純度で考えられています。 80°C - サンプルがで保存することができます。
    5. 臭化エチジウムで染色した1％アガロースゲル上でサンプルを200 ngのの電気泳動によって全RNAの完全性を評価します。
      注：約哺乳類28Sおよび18SのrRNAに対応する二つの無傷のバンドの検出2キロバイトと優れたトータルRNAの完全性の指標であるサイズで1キロバイト
  2. シーケンシングライブラリの準備
    1. 各サンプルにつき全mRNA2μgのを使用してください。製造元の指示に従ってmRNAのライブラリー調製プロトコルに従ってください。
    2. バイオアナライザシステムを使用して、各ライブラリーの品質と濃度を決定します。 10ナノモル/ Lの最終濃度に単一のサンプルアップ内のライブラリをプールし、バイオアナライザーでそれを測定します。
    3. シングルリード100 bpのモードとハイスループットシークエンシングシステムを使用してください。
      注：> 80塩基対のリード長は、転写アイソフォームを識別するために必要です。

3.シーケンシングから異なるスプライシングの検出は、読み込み

  1. アライメントは、リファレンスゲノムと品質チェックに読み込み
    1. UCSCテーブルブラウザ（25963遺伝子）を使用して、NCBI refGeneテーブルから遺伝子アノテーション（.gtfファイル）をコンパイルします。
    2. 実行しますシークエンシングの注釈認識ギャップ付きアラインメントはSTARを使用して参照ゲノム（GRCh37）に読み込みます。
    3. ソートとインデックスピカードツールと結果の整合ファイル。
    4. RSeQCとsamtoolsを使用することにより、マッピング後の品質管理を行います。
  2. サンプルグループ間の異なるスプライシング検出
    1. Pythonとnumpyのとscipyのダウンロードの対応バージョンをインストールします。ダウンロードしsamtoolsをインストールします。蝶ネクタイとトップハットをダウンロードしてインストールし、
    2. $ PATH環境変数にPythonの、蝶ネクタイ、トップハットとsamtoolsディレクトリを追加します。ダウンロード事前に構築されたボウタイインデックス（hg19）。 rMATSのバージョン3.0.9をダウンロードしてください。
      注：rMATSに関するさらなる詳細は、 図19および34に設けられています。
    3. 別々のMATSでPANC-1RにCEM-WT及びPANC-1にそれぞれのDex耐性細胞株を比較することによって、選択的スプライシングイベントを検出は、 図5（a）に従って実行されます。
    4. previoから差動スプライシング事象を検出しますusly整列配列決定はPanc-する対CEM- C3、CEM-WT対CEM-R5、CEM-WT対CEM / R30dmとPANC1 CEM-WTについては、 図5（b）からのコマンドを使用して、MATSを実行し、（.bamファイル）を読み込みます1Rの比較。
      注：MATSは、分析スプライシング事象の種類ごとの結果を持つ2つの.txtファイルに出力フォルダを作成します（SE - エクソンスキッピング、A5SS - 代替5 'スプライス部位、A3SS - 代替3'スプライス部位、MEX - 相互排他的エクソンとRI - イントロン保持）：1のみの接合数に基づいて結果を含むファイルであり、接合カウントに基づいて結果を有する第二のファイルとターゲットに読み込みます。また、結果の概要を追加.txtファイルは同じフォルダに生成されます。
    5. SE、A5SS、A3SSとRIインポートが接合カウントに基づいて.txtファイルをスプレッドシートにするため、およびターゲットに読み込みます。 MEXのためにのみ接合カウントに基づいて.txtファイルをインポートします。
      注：遺伝子ID、遺伝子記号：MATS出力ファイルはP値とを昇順でソートされているが、いくつかのパラメータが含まれています、染色体および鎖位置、選択的スプライシングされた断片のゲノム座標だけでなく、介在物の長さをカウントし、両方の分析サンプル、介在物の長さおよび正規化、p値、偽発見率（FDRに使用スキップフォームのフォームをスキップ）、正規化された数との差分を含めるスコア（平均（IncLevel1）に基づいて、各サンプルの含有レベル - 平均（IncLevel2））。
    6. FDR <さらなる検証（ 例えば 、DDX5とPKM2）は10％で統計的に有意な候補遺伝子を選択します。
    7. 図5に報告したように、統合ゲノミクスビューア（IGV、https://www.broadinstitute.org/igv/）との選択的スプライシングイベントを視覚化します。

RT-PCRおよび定量RT-PCRアッセイの業績4.検証

  1. プライマーの設計
    注：mRNAのトランス、バイオインフォマティクスパイプラインを使用して得られた結果の信頼性の検証を提供するために、選択的スプライシング事象から生じるcriptsは、RT-PCRを用いて増幅したPCR産物のアガロースゲル電気泳動により可視化されます。例えばSYBRグリーン定量RT-PCRアッセイなどのシアニングリーン色素は、特定のスプライスを定量するために使用されるハウスキーピング遺伝子に対して変異体。 図7は、DDX5遺伝子のエクソン12スキッピングイベントを視覚化するとPKM遺伝子の相互排他的エクソン9及びエクソン10を定量化するために適用される戦略を描いています。
    1. 構成的エクソン（エクソン10とエクソン13）上流と下流に位置選択的スプライシング部位（ 図7A）にRT-PCRアッセイのために、設計プライマー対は、アニール。
      注：アンプリコンサイズは、アガロースゲル上で予測されたPCR産物の明確な分離を確実にするために、100〜800塩基対をカバーすべきです。プライマーのアニーリング温度は55℃〜65℃であるべきであり、GC含量が60％を超えてはなりません。
    2. シアニングリーンアッセイ（ 図7B）。
      1. 2相互排他的エクソンおよびそのそれぞれの具体的な設計2のプライマー対の配列相同性を確認し、排他的にのみ2つのスプライスバリアントのどれかを検出しました。
        注：PKMについては、逆方向プライマーは、フォワードプライマーは、変異型固有およびアニール9（PKM1）をエキソンまたはエキソン10（PKM2）であるが、両方のバリアントに共通する11のエクソンにアニールします。
      2. DDX5完全長遺伝子を検出するために、スキップされたエクソン（エクソン12）内のリバースプライマーをアニーリング。
        注：DDX5ΔEx12変異体の特異的検出のために、逆方向プライマーは、exon11 / exon13の境界にまたがります。両反応のための構成的エクソン10にアニール同じフォワードプライマーを使用してください。
        注：アンプリコンサイズは80と200 bpの間であるべきです。
  2. 第一鎖cDNA合成
    1. モロニーマウス白血病ウイルスの200 U /μLを使用してcDNAと単離されたRNAを1μgの逆転写を設定します（M-MLV）rever滅菌水で5：その反応緩衝液中のSE転写酵素は、1に希釈しました。 DTT、1μM、ランダムヘキサマーの0.05μgの、デオキシヌクレオチドミックス（のdNTP）1mMの、およびリボヌクレアーゼインヒビターの40 U /μlを添加します。
    2. 渦を簡単にし、2時間37℃で反応混合物をインキュベートします。
    3. 、逆転写酵素を不活性化し、氷上でミックスを転送し、マイクロ遠心を用いて、スピンダウンする5分間、70℃で反応混合物をインキュベートします。サンプルは、直ちに使用するかで保存することができる - 20°C。
  3. RT-PCR反応、アガロースゲル
    1. セットアップ2倍の12.5μLを混合することにより、各サンプルあたりPCRチューブでのPCR反応は、滅菌水で25μlの最終容量まで、10μMフォワードプライマーとリバースプライマーのために同じ量の1.25μLをPCRマスターミックスを濃縮しました。
    2. ミックスにcDNAを1μlを添加しサーモサイクラーにチューブを配置します。初期変性：95℃を2分間、以下のようにプログラムを実行します。35サイクル以下の手順を繰り返す：変性を25秒間95℃で、 35秒間52℃でのアニーリング; 1分間の72℃での伸長。 5分間72℃で最終伸長を設定します。
    3. TBE緩衝液1×100mlのアガロース1gを溶解させて、1％アガロースゲルを準備します。溶液に、臭化エチジウムの2.5μlを添加します。注意：エチジウムブロマイドは発癌性である、化学ヒュームフードを使用して、取り扱いに注意して。
    4. サンプルをロードし、電気泳動システムで約30分間、100 Vで1×TBE緩衝液でゲルを実行します。
    5. デジタルUVカメラでゲルを明らかにし、画像を保存します。
  4. 定量RT-PCRおよびデータ分析
    1. PCRチューブ内の滅菌水で15μlの最終容量まで5μMフォワードプライマーとリバースプライマーのために同じ量の2μlを、2×グリーンPCRマスターミックスの12.5μLを混合することにより、各サンプル当たりシアニングリーンPCR反応を設定します。各特定のスプライス用のミックスを準備します（PKM1、PKM2、DDX5全長、DDX5ΔEx12）を検出し、ハウスキーピング遺伝子（GUS）のためにするバリアント。
    2. 白色96ウェルプレートにマスターミックスをロードし、各サンプルごとに重複を準備します。
    3. 水の中のcDNAの10倍を希釈し、各ミックスに5μlを添加し、サーマルサイクラーにプレートを配置します。初期変性：95℃を5分間以下のようにプログラムを実行します。 45サイクルのために、以下の手順を繰り返す：変性を10秒間95℃で、 20秒間58°C（DDX5とDDX5ΔEx12がミックスの場合）または60（PKM1とPKM2ミックス用）°Cでアニール。 20秒間、72℃での最終伸長を設定します。 65から97℃に勾配を適用することにより、曲線を溶融設定します。
    4. 彼らのターゲットにプライマーセットの特異性を評価するために、融解曲線を確認し、単一のピークが各プライマーセットごとに形成されていることを確認します。
    5. 増幅曲線の二次導関数値を計算し、サイクル閾値（CT）をエクスポートします。
    6. Calculat電子mRNAスプライスバリアントの相対的な発現レベル（REL）は「デルタCT（ΔCt値）」法を用いて、各試料中のGUSのハウスキーピング（参照）遺伝子と比較しました。式は次のとおりです。REL = 2 -のCt 参照遺伝子 -のΔCt= Ctをターゲットスプライスバリアント のΔCt、
    7. 比率REL比= REL スプライス変異体1 / REL スプライスバリアント2：スプライス変異体の相対的な存在量を定量化する式を用いてREL率を算出するためです。

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結果

プロトコルに記載の細胞毒性アッセイは、in vitroでの化学療法剤に対する癌細胞の耐性を評価するための信頼性の高い強固な方法を提供します。 CEM / R30dm、CEM-R5及びCEM-C3：MTTアッセイにより、デックスに対する感度がデックス感受性親CEM-WT細胞を含む4つのT-ALL細胞株、および3つのDex耐性亜系統で決定しました。 Dexの耐性細胞株（640μM - 0.33 nM）を - 二つの異なる濃度範囲は、CEM-WT間の感度差が大きい（0.97 nMの2μM）のために使用しなければなりませんでした。 MTTアッセイは明らかにCEM-と比較して、CEM / R30dm（IC 50 = 456±49μM）、CEM-R5（IC 50> 640μM）およびCEM-C3（IC 50 = 386±98μM）でのDex性を示しましたWT細胞（IC 50 = 0.028±0.003μM）。同様にSRBアッセイは、IC 50 = 3...

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ディスカッション

ここでは、十分に確立された細胞毒性のスクリーニング技術を組み合わせて、強力なNGSベースのトランスクリプトームは、薬剤耐性に関連する差動スプライシング事象を識別するために分析する新規な方法を記載します。分光光度アッセイは、in vitroでの癌モデルにおける薬剤感受性を評価するための便利で堅牢なハイスループット法であり、細胞毒性スクリーニングを行う多くの研究室のための最初の選択肢を表します。このメソッドのトラブルシューティングだけでなく、可能なバリエーションは広範囲に他の場所で4,5説明しました。

ハイスループットゲノムは、現在のSNP検出に主に依存し、特定の薬剤耐性表現型に関連する遺伝子の発現の推定差分薬剤耐性メカニズムを調査するために使用される分析します。本研究では、正確なmRNA転写物の注釈とDIFの検出のための堅牢なバイオインフォマティクスパイプラインと一緒に、RNA配列決定法の使用を記載しています差動のスプライシング。記載されたプロトコルの特に重要な特徴は、別個の薬剤感受性プロファイルを有する2つのサンプルグループ間での新規スプライ...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者は、この研究で使用された耐性細胞株を提供してくださったJ.J. McGuire教授、R. Kofler教授、K. Quint博士に感謝の意を表します。この研究は、アムステルダムがんセンター(CCA)財団(JC、EG、RS)、KiKa(AWの小児がんフリー助成金)財団、中皮腫応用研究財団(VEGおよびEGへ)、Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro(AIRC)、Istituto Toscano Tumori(ITT)、 Regione Toscana Bando FAS Salute(EGへ)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
スルフォロダミン BSigma-Aldrich230162
トリクロロ酢酸Sigma-Aldrich251399
CCRF-CEMATCC, マナッサス, バージニア米国 ATCC CCL-119
Panc-1ATCC, マナッサス, バージニア米国 ATCC CRL-1469
DMEM 高グルコースロンザ, バーゼル, スイス12-604F
RPMI-1640 Gibco, Carlsbad, CA, USA11875093
Fetal wevine and calf serumGreiner Bio-One, Frickenhausen, Germany758093
Penicillin G streptomycin sulphateGibco, Carlsbad, CA, USA15140122
Tris(hydroxymethyl)-aminomethaneSigma Aldrich252859
MTT formazanSigma AldrichM2003
Anthos-Elisa-reader 2001Labtec, Heerhugowaard, NetherlandsUV-Vis 96-well plate spectrophotometer
Greiner CELLSTAR 96ウェルプレートGreiner/SigmaM0812-100EA
Trypsin/EDTA Solution 100 mlLonza, Basel, SwitzerlandCC-5012
CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany82051-074
CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany82050-856
Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%)B.Braun Melsungen AG, Germany362 3140
州, 州,

参考文献

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