方法論記事

自己免疫に対する幹細胞由来の抗原特異的制御性T細胞の開発

DOI：

10.3791/54720

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2016年11月8日

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1Department of Microbiology and Immunology, The Pennsylvania State University College of Medicine

この記事について

サマリー

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ここでは、マウスモデルにおける自己免疫性関節炎の免疫療法のために、人工多能性幹細胞(iPSC)から機能的な抗原(Ag)特異的制御性T細胞(Tregs)を開発する方法を紹介します。

要約

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自己免疫疾患は、免疫学的自己寛容の損失に起因し発生します。制御性T細胞（Treg）免疫学的自己寛容の重要なメディエーターです。末梢血中を循環するものTregの2％ -約1で、マウスおよびヒトにおける成熟したCD4 + T細胞亜集団の10％ - Tregは約5を表します。人工多能性幹細胞（iPS細胞）は、自己免疫疾患の細胞ベースの治療のために使用される可能性を持っている機能のTregへ分化させることができます。ここでは、iPS細胞からの抗原（Ag）から固有のTreg（ すなわち 、IPSC-のTreg）を開発するための方法を提示します。この方法は、iPS細胞への転写因子のFoxP3及びAg特異的T細胞受容体（TCR）を組み込み、次いでノッチを発現OP9間質細胞上で分化に基づいてデルタ様（DL）1とDL4のリガンド。 in vitroでの分化に続いて、IPSC-Tregは、CD4、CD8、CD3、CD25、FoxP3の、およびAg特異的TCRを発現し、Agの刺激に応答することができます。この方法は、正常マウスモデルにおいて自己免疫性関節炎の細胞ベースの治療に適用されています。マウス-bearingのAg誘導関節炎（AIA）にこれらのAg特異的IPSC - Tregの養子移入は、関節の炎症および腫脹を軽減し、骨損失を防止する能力を有します。

概要

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自己免疫性関節炎は、滑膜組織の過形成と関節軟骨、骨、靭帯の進行性の破壊を特徴とする全身性疾患です。自己免疫性関節炎における制御性T細胞の生成または機能の低下は、制御性T細胞が自己反応性免疫細胞の発生を防ぐ上で重要な役割を果たすため、慢性炎症および組織損傷の一因となります。

制御性Tregの操作は、Ag依存的な方法で炎症を抑制する治療法の開発のための理想的な戦略です。Tregベースの免疫療法では、転写されたTregの特異性が進行中の自己免疫の治療に重要です2。抑制活性を示すためには、制御性T細胞は移動し、患部に留置される必要があり、これは、その位置におけるAgに対するTCRの特異性によって指示され得る3。ポリクローナルTregには、TCRからこのAg特異性を含む小さな集団が含まれている可能性がありますが、これらのAg特異的Tregの数は通常少ないです。その結果、自己免疫疾患に対するポリクローナル制御性制御性T細胞を用いた細胞ベースの治療には、多数の制御性制御性T細胞の養子移植が必要です4,5。多能性幹細胞(PSC)はあらゆるタイプの細胞に成長する能力を持っているため、Ag特異的PSC-TregはTregベースの免疫療法の優れた候補となる可能性があります。これまでの研究では、Tregs6-8を含むPSC由来T細胞の良好な開発が示されています。

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プロトコル

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全ての動物実験は医学動物実験委員会（IACUCプロトコル＃45470）のペンシルベニア州立大学によって承認されており、実験動物管理の評価と認定協会のガイドラインに準拠して行われています。

1.幹細胞培養

  1. 被覆するためのプレートで37°C（インキュベーター）で少なくとも30分間、0.1％ゼラチン、10 mlの10cmの皿をインキュベートします。
  2. 皿からゼラチンを除去し、プレート3×10 6 SNL76 / 7細胞を照射し、10％DMEM培地（10％FBSおよび1％ペニシリンストレプトマイシン）を用いて37°C（インキュベーター）で1日インキュベートします。
  3. IPSCのメディアを使用してSNL76 / 7細胞フィーダー層上に平板培養解凍iPS細胞から培地を除去（15％ウシ胎児血清、0.1ミリモル/ L非必須アミノ酸、1ミリモル/ LのL-グルタミンを含有するDMEM培地、および0.1ミリモル/ Lのβメルカプトエタノール）9。マウスのiPS-MEF-NG-20D-17セルのLiOct3 / 4、Sox2の、Klf4及びc-Mycのレトロウイルストランスフェクションによるマウス胚線維芽細胞から誘導された、ね、博士山中伸弥（、京都大学再生医科学研究所、京都、日本）から入手しました。
  4. 新鮮な培地で3日目に培地を変更して、顕微鏡下でIPSCのコロニーを観察します。

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結果

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28日目に、ここに示されるように、Ag特異的Tregは、実質的にCD3およびAg特異的TCR、2つのT細胞マーカーを発現しました。 CD3 +TCRVβ5+集団は、CD4を発現しました。 + CD3 +TCRVβ5+ CD4のほとんどの細胞はまた、CD25、CD127、およびCTLA-4、一般的に天然に存在するTのREGS（nTregs）および異所のFoxP3を発現するT細胞で上昇したレベルで発現される表現しました。フローサイトメトリー（図1）によって分析し、細胞内染色によって検出されるIPSC由来細胞中でFoxp3発現は、Notchリガンドでin vitro刺激後も長期間持続しました。 IPSC-Tregは潜在的な抑制活性を持っていた示し、Agをパルス脾細胞（図2） を用いてインビトロで刺激した場合また、Ag特異的IP.......

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ディスカッション

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このプロトコルでは、重要なステップは、TCR / FoxP3の遺伝子形質iPS細胞のインビトロ分化である。 インビトロで Notchシグナル伝達は、T細胞系統に向けて開発を誘導します。 CD4 + FoxP3の+ TregのにiPS細胞を区別するために、我々は非常にMHC II（IA b）の分子を発現するOP9-DL1 / DL4 / IA B細胞を、使用していました。 iPS細胞の大部分は、CD4 +細胞に分化します。しかし、表面TCR発現の後、多くの分化プレT細胞が分化し、最終的には死ぬ能力を失います。その結果、IPSC由来の機能的Tregの細胞数は劇的インビトロ分化の4週間後に減少します。これを回避するために、IL-2の添加は、これらの時点での細胞生存率を向上させることができます。 Ag特異的プレTregの成熟および生存を駆動する別の方法は、マウスに一週間のために、in vitroで分化した前のTregを転送することです。これらの予備Tregは共存する.......

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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このプロジェクトは、健康（R01AI121180、R21AI109239とK18CA151798）、米国糖尿病協会の国立研究所からの助成金の下で、一部には、資金を供給された（1月16日 - IBS-281）、および健康のペンシルベニア州省（たばこ和解基金）へJS

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
C57BL/6j マウスJackson Laboratory664
B6.129S7 Rag1tm1Mom/JJackson Laboratory2216
抗CD3 (2C11) 抗体BD Pharmingen553058
Anti-CD28 (37.51) antibodyBD Pharmingen553295
Anti-CD4 (GK1.5) antibodyBiolegend100417
Anti-CD8 (53–6.7) 抗体Biolegend100714
抗 CD25 (3C7) 抗体Biolegend101912
Anti-TCR-&β;(H57597) 抗体Biolegend109220
抗IL10Biolegend505010
抗TGF&β;Biolegend141402
DMEMInvitrogenABCD1234
&-MEMInvitrogenA10490-01
FBSHycloneSH3007.01
Brefeldin ASigmaB7651
PolybreneSigma107689
GenejammerIntegrated science204130
ACK溶解バッファーロンザ10-548E
mFlt-3Lpeprotech250-31L
mIL-7peprotech217-17
ラチンシグマG9391
パラホルムアルデヒドシグマP6148-500G注意:アレルギー性、発がん性、毒性
透過化バッファーBiolegend
mBSASigmaA7906
卵子アルブミンAvantor0440-01
CFADifco2017014
Tailveiner 拘束Braintree scientificRTV 150-STD
ゼ421002具

参考文献

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  1. Firestein, G. S. Evolving concepts of rheumatoid arthritis. Nature. 423, 356-361 (2003).
  2. Ferraro, A., et al. Interindividual variation in human T regulatory cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E1111-E1120 (2014).
  3. Tang, Q., et al.

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タグ

Stem Cell derived TregsAntigen specific TregsiPSC DifferentiationOP9 Stromal CellsFoxP3 ExpressionTCR TransductionAdoptive TransferAutoimmune ArthritisJoint InflammationBone Loss

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