方法論記事

使用した金ナノ粒子の効率的な放射性標識のために最適化されたプロトコル

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DOI：

10.3791/54759

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2016年10月10日

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1Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, 2Department of Radiation Biotechnology and Applied Radioisotope Science, University of Science and Technology

この記事について

サマリー

125 I標識アジドの合成と銅のないクリック反応を用いて、dibenzocyclooctyne（DBCO） -基コンジュゲート、13-nmサイズの金ナノ粒子の放射性標識のための詳細な手順が記載されています。

要約

ここでは、125I標識アジド補綴基の放射合成と、銅フリークリック反応を用いたDBCO基官能基化金ナノ粒子の効率的な放射性標識への応用のための詳細なプロトコルを示します。スタンニル化前駆体(2)の放射性ヨウ素化は、[125I]NaIとクロラミンTを酸化剤として室温で15分間使用して行った。粗生成物のHPLC精製後、精製された125I標識アジド(1)は、高い放射化学的収率(75 ± 10%、n = 8)および優れた放射化学的純度(>99%)で得られた。放射性標識された13nmサイズの金ナノ粒子の合成のために、チオール化ポリエチレングリコールポリマーを使用してDBCO官能化金ナノ粒子(3)を調製しました。1と3の間の銅フリークリック反応により、125個のI標識金ナノ粒子(4)が得られ、放射性薄層クロマトグラフィー(radio-TLC)によって測定される放射性化学的収率が95%を超えました。これらの結果は、ひずみ促進銅フリークリック反応を用いた本放射性標識法が、DBCO基含有ナノ材料の効率的かつ簡便な放射性標識に有用であることを明確に示しています。

概要

アジドとシクロオクチンの間のひずみ促進銅フリークリック反応は、広範囲の生体分子、ナノ材料、および生体被験者1-7の効率的な生体直交標識に広く適用されています。この標識反応の優れた部位特異性と迅速な反応速度により、放射性標識トレーサーの合成にも使用されています。ペプチドおよび抗体を標的とするさまざまながんのin vitro標識、ならびに腫瘍8-13のin vivoプレターゲティングイメージングのために、いくつかの18のF標識アジドまたはDBCO補綴群が調製されています。これらの例に加えて、陽電子放出断層撮影(PET)イメージング研究14-16のためのナノ材料の金属-放射性同位元素標識にも同じ共役反応が適用された。

数十年にわたり、放射性ヨウ素は、PETイメージング(124I)、単一光子放出型コンピュータ断層撮影(SPECT)イメージング(123I、125I)、および甲状腺癌治療(131I)17-21を通じて、生物医学研究および臨床試験に使用されてきました。したがって、放射性ヨウ素の効率的な標識法は、分子イメージング研究、生体分子の臓器分布の解析、バイオマーカーの同定、医薬品開発など、さまざまな研究において基本的に重要です。銅フリーのクリック反応戦略は、放射性ヨウ素の標識に使用できます。しかし、この応用は、18のF標識生体分子22-23ほど広範囲に研究されていません。ここでは、DBCO基由来分子の放射性標識のための125I標識アジドの合成のための段階的なプロトコールを提供します。本報告の手順には、スタンニル化前駆体の放射性ヨウ素化、HPLCによる精製ステップ、および固相抽出が含まれます。また、125I標識アジドを用いて、DBCO基修飾13 nmサイズの金ナノ粒子の効率的な放射性標識を実証しています。このレポートの詳細なプロトコルは、合成化学者が放射性標識製品の合成のための新しい放射性標識法を理解するのに役立ちます。

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プロトコル

注意：放射性ヨウ素の酸化形態は非常に揮発性であり、十分なリードシールドとリードバイアルで処理する必要があります。すべての放射化学的手順は風通し木炭濾過フード内で行われるべきであり、実験手順は、放射能検出装置によって監視される必要があります。

125 I標識アジドの合成のための化学物質と逆相カートリッジの調製

  1. 溶液中の試薬の調製
    1. 150μlの無水エタノール中アジド前駆体（2）（ 図1）1mgを溶解させます。
      注：アジド前駆体の詳細な合成手順は、（2）前報22で報告されました。
    2. 1×リン酸緩衝生理食塩水（pHは= 7.4）20μlに1mgのクロラミンTを溶解させます。
    3. 20μlのH 2 Oで2 mgのメタ重亜硫酸ナトリウムを溶解させます
  2. Preparaカートリッジの化
    1. 10ミリリットルのH 2 O、続いて10ミリリットル無水エタノールでTC18カートリッジを洗います空気とカートリッジのマトリックスを乾燥させないでください。

125 I標識アジド補欠分子族の2放射合成

  1. 前駆体の放射性ヨウ素化反応
    1. 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにアジド前駆体溶液（無水エタノールを150μl中1mg）および酢酸（10μl）を追加します。
    2. 反応混合物に0.1 MのNaOH（50μL）の[125 I]のNaI 150 MBqのを追加します。
    3. クロラミンT溶液（1×リン酸緩衝生理食塩水の20μlの中で1 mg）を加え、反応混合物を含むマイクロチューブを閉じます。
    4. 放射性ヨウ素化反応が完了するまで、15分間室温で反応混合物をインキュベートします。
    5. 反応混合物にメタ重亜硫酸ナトリウム溶液（20μlのH 2 O中の2 mg）を加えます放射性ヨウ素化反応を停止します。
    6. 粗生成物の0.2μLを撤回した後、溶液100μl（H 2 O / CH 3 CN、1：1）を用いて希釈し、HPLC分析のために。
      注：すべてのHPLC実験のために、H 2 O（A溶媒）及び溶離剤としてアセトニトリル（溶媒B）を含有する0.1％ギ酸を含む0.1％ギ酸を使用します。
    7. 逆相分析用無線-HPLCを（逆相C18カラムを用いて希釈し、粗生成物を分析;流速：1ml /分;溶離剤勾配：0-2分20％溶媒Bのため20〜80％溶媒B 2-22分、22-23分80〜100％の溶媒B、および23から28分間、100％溶媒B;保持時間：16.4分）（ 図2）。
  2. 分取HPLCで粗生成物の精製
    注：このような注入器、カラム、検出器、コレクションバイアル、および流出物は収集された容器としてHPLC部品の周囲に十分な鉛遮蔽を提供します。
    1. 目を撤回HPLCバイアル中に反応混合物全体を電子。アセトニトリル（0.5ml）で反応管を洗浄し、同じ注射バイアルにリンスを追加します。 H 2 O（1mL）で回収した溶液を希釈します。
    2. 取ラジオ-HPLC（逆相C18カラムを上に、粗生成物を注入し、流速：10ml /分;溶離液勾配：0-2分20％溶媒B、2-22分間の百分の20から80溶媒B、 22-23分80〜100％の溶媒B、および23から28分間、100％溶媒B）。
    3. ガラス試験管において125 I標識アジド（1）（これらのHPLC条件下でのt Rは 17.8から18.8分である）（ 図2）を表す放射性ピークを集めます。
    4. 製造業者のプロトコルに従って放射能線量キャリブレータを使用して、画分の放射化学的収率を測定します。
    5. 生成物の放射化学的純度を決定するための同一のHPLC条件を使用して分析ラジオHPLCに精製された生成物を注入します。
  3. 製品の固相抽出
    1. 40ミリリットルで、所望の生成物（1）を含む画分を希釈し、純粋なH 2 O
    2. 予め調整TC18カートリッジに希釈した溶液を加えます。
    3. 追加の15ミリリットルのH 2 Oでカートリッジを洗浄
    4. 生成物を溶出（1）鉛シールドによって保護されている10-mlのガラスバイアルに2ミリリットルのアセトンでカートリッジ内に閉じ込められました。製造業者のプロトコルに従って放射能線量キャリブレータを用いて溶出し、製品の放射能を測定します。
      注：ジメチルスルホキシド（DMSO）または無水エタノールは、また、カートリッジからの生成物の溶出のために使用することができます。放射能の約5〜10％、通常カートリッジに付着し、残りの放射性標識生成物が完全に有機溶媒の過剰量を用いて溶出することができません。
    5. 窒素またはアルゴンガスの流れでアセトンを蒸発させます。
    6. 再溶解させます次の放射性標識工程のためのDMSO（100〜200μl）を持つs​​idue。

DBCO-基結合金ナノ粒子の3合成

  1. DBCO基含有ポリエチレングリコールと13-nmサイズの金ナノ粒子の表面修飾
    1. 既報24に従って、クエン酸ナトリウム安定化金ナノ粒子（3）（平均サイズ= 13 nm）を準備します。
    2. （10 nMの15 ml）をクエン酸で安定化した金ナノ粒子にTween 20を（1mMの1.5 ml）の水溶液を加えます。オービタルシェーカー上で20分間この溶液を振ります。
    3. DBCO基含有ポリエチレングリコールチオール（平均分子量= 5,000、100μM1.5 ml）の水溶液を加えます。オービタルシェーカー上で2時間のためのソリューションを振ります。
  2. DBCO基変性金ナノ粒子の精製
    1. 精製DBCO基修飾金ナノ粒子（4）</連続的な遠心分離（11,400×gで、15分×3）によって>強いです。
    2. 上清を除去し、金ナノ粒子ペレットの再懸濁のための純水を追加します。

4.銅系クリック反応を介したDBCO基修飾金ナノ粒子の放射性標識

  1. 125 I標識アジドを使用して、125 I標識した金ナノ粒子の合成（1）
    1. 遠心分離（11,400×gで、15分）を使用してDBCO基修飾金ナノ粒子の濃縮液を用意し、2μMに金ナノ粒子の濃度を調整します。
    2. （2μM、50μL）（4）金ナノ粒子の懸濁液にDMSO（5μL）に（1）125 I標識アジドの4.1 MBqのを追加します。
    3. 60分間40℃で得られた反応混合物をインキュベートします。
    4. 粗生成物からのアリコート（0.2μl）を撤回し、シリカ共にそれを適用します薄層クロマトグラフィー（TLC）プレートated。
    5. 移動相として酢酸エチルを使用して、TLCプレートを開発。
    6. 製造業者のプロトコルに従って（ 図3）放射性TLCスキャナーでTLCプレートを配置し、放射性標識反応を監視するためのスキャナを実行します。
  2. 粗生成物の精製
    1. 遠心分離（11,400×gで15分間）によって125 I標識された金ナノ粒子（4）を含む反応混合物を精製します。
    2. 上清を除去し、金ナノ粒子ペレットの再懸濁のための純水を追加します。
    3. 精製された生成物からのアリコート（0.2μl）を撤回し、シリカ被覆TLCプレート上にそれを適用します。
    4. 移動相として酢酸エチルを使用して、TLCプレートを開発。
    5. 放射性TLCスキャナーでTLCプレートを配置し、125 I標識ゴルの放射化学的収率および放射化学的純度を決定するためのスキャナを実行製造業者のプロトコルに従ってDナノ粒子（4）（ 図3）。

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結果

スタンニル化前駆体（2）の放射性ヨウ素化反応は、放射性標識生成物を提供するために15分間室温で[125 I] NaIを、酢酸、及びクロラミンTの150 MBqのを使用して実施した（1）。粗混合物を分取HPLC精製後、所望の生成物は、放射化学的収率の75±10％（N = 8）を得ました。分析用HPLCは、125 I標識産物の放射化学的純度は99％以上（ 図2）であり、生成物1の観察比放射能は40.7 MBqで/モルであることを明らかにしました。カートリッジを使用して精製された生成物を含む画分の固相抽出1のアセトン溶液を得ました。窒素またはアルゴンガス流を用いて、有機溶媒を蒸発させることができ、その後、残留物を次のSTEためにDMSO又は無水エタノールに再溶解することができますP。

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ディスカッション

一般的に、精製された125 I標識アジド（1）の観察された放射化学収率は75±10％であった（n = 8）。放射性標識は、放射能の50から150 MBqので達成された、および放射化学的結果は非常に一貫しています。 [125 I] NaIを（T 1/2 = 59.4 d）の放射性ヨウ素化反応に使用した1ヶ月以上放射性崩壊を受け、1の放射化学的収率があることが観察された場合は、わずかに（53から65パーセント）減少しました。従って、[125 I] NaIを、それが生成されるとすぐに利用すること、または最適化された放射化学的収率を得るために実験室に送達されることが推奨されます。また、新たに調製したクロラミンT溶液は、所望の放射化学的収率を得るために、反応に使用されるべきです。

前駆体（2）は 、非常に疎水性であったため、150μlの無水エタノールは、1mgを溶解させるために追加する必...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、大韓民国政府による資金提供を受けた韓国国立研究財団からの助成金(助成金番号2012M2B2B1055245および2012M2A2A6011335)と韓国原子力研究所のRI-Biomicsセンターによって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
クロラミンT三水和物Sigma402869
[125I]NaI in aq.NaOH Perkin-ElmerNEZ033A010MC
Sodium metabisulfite SigmaS9000
ギ酸Sigma251364
Sep-Pak tC18 plus カートリッジWatersWAT036800
ジメチルスルホキシド SigmaD2650
アセトンSigma650501
エタノールSigma459844
金(III) 塩化Sigma520918
Tween 20 SigmaP1379
DBCO PEG SH (MW 5,000)NANOCSPG2-DBTH-5k
TLC シリカゲル 60 F254Merck
Analytical HPLCAgilent1290 Infinity型番
分取HPLCAgilent1260 Infinity型番
Analytical C18 逆相カラムAgilentZorbax Eclipse XDB-C18
分取 C18 逆相カラムAgilentPrepHT XDB-C18
ラジオTLCスキャナーバイオスキャンAR-2000型式番号
放射性同位元素線量校正器Capintec, IncCRC -25R 線量校正器型式番号
物

参考文献

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125 HPLC TLC DBCO

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