ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

サマリー

ナノスケールPCRによってDNA及びRNAベースの病原体のハイスループット試験は、症候性イヌおよびウマの呼吸PCRパネルを用いて説明します。

要約

ナノリットルスケールリアルタイムPCRは、複数のアッセイが一緒に反応を組み合わせた一般的な欠点がない単一のプレート上で並行して実行できるように空間多重化を使用します。私たちは、急速に急性呼吸器疾患でイヌやウマの一般的な疾患の薬剤の存在を同定するために、この原理に基づいてパネルを設計し、評価しました。この原稿は、マイクロリットルスケールの反応とは異なる手順に焦点を当て、サンプル調製、増幅、および標的病原体配列の分析のためのナノスケール診断PCRワークフローを記載しています。提示呼吸パネルでは、18アッセイは、各プレートあたり48サンプルまで収容、三重に設定しました。ユニバーサル抽出および増幅前のワークフローは、複数の行列及びDNAとRNAベースの病原体を収容するためにハイスループット試料調製のために最適化しました。代表的なデータを1つのRNAターゲット（インフルエンザマトリックス）と1つのDNA標的（ウマヘルペスウイルスのために提示されています1）。迅速かつ正確に病原体の包括的、シンドロームベースのグループをテストする能力は、診断テストの効率性と人間工学を改善するため、および急性呼吸器疾患の診断と管理のための貴重なツールです。

概要

単一疾患のためにテストされている多数のサンプルに使用しない限り、ヒトおよび動物のための臨床診断における複数のエージェントの迅速かつ包括的に検出するための需要が、病原体検出のための単一の生物の分子診断方法は厄介です。獣医学的文脈では、ハイスループット診断方法が原因種の多種多様な病原体をカバーするための追加の必要性に特に重要です。食品媒介性疾患の管理や新興病原体サーベイランスのために近づくOneHealth細菌、ウイルス（DNAまたはRNAベース）、寄生虫、および真菌の数を含むテストのニーズの一例です。テスト効率を向上させるために一緒に複数の検体（多重化）のためのテストを組み合わせることへの挑戦は、感度の損失の可能性と最適化およびアッセイの検証のための大きな負担となっています。

ナノリットルスケールリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を変更であります多くの別々の反応は、同じ試料¹上で同時に実行することを可能にする多重化の実施にネイティブ。 OpenArrayプラットフォームは、この原則²のアプリケーションです。それは、リアルタイムPCRとマイクロアレイ技術を兼ね備えています。空間多重化の概念に基づいて、すべてのサンプルは、貫通孔別個で多数のターゲットのために試験されます。このプラットフォームは、最初はシアニン系の二本鎖DNA結合化学²を使用し、暗い消光プローブ^3を用いて、プローブベースの化学的性質のために利用できるようになりましたました。このプラットフォームは、主に人間⁴及び動物⁵に遺伝的プロファイリングに使用されています。最近、Grigorenko らによって血液由来DNA及びRNAの病原体を検出するように適合された^。6二段階の逆転写/プレ増幅（プリアンプ）の手順を使用して。

ここでは、呼吸秒で病原体の両方のタイプを検出するためのワンステッププリアンプベースの手順を説明しますretionsと標準勤務時間内で完全に行うことができ、他の様々なサンプルタイプ。ワンステップのプリアンプが完了すると、サンプルは、このナノスケールPCRプラットフォームに付属の自動液体ハンドリングシステムによって受け入れられるフォーマットで384ウェルプレートに移します。システムは、一度に最大4枚のプレート（192検体およびコントロール）の表面を横切ってマスターミックスとサンプルを描画します。このロード処理の後、我々はサンプルが増幅され、1枚のプリントページに収まるの表に、各サンプル/ターゲットの組み合わせの3技術的反復の平均をまとめたマクロスプレッドシートを用いて分析する方法について説明します。

このプラットフォームを使用したサンプルから抽出したDNAおよび/またはRNAを分析するための統一された方法を確立しました。サンプルの多種多様なエラーの可能性を最小限に抑え、逆転写され、抽出された96ウェルフォーマットで事前に増幅しました。テストした呼吸サンプルは鼻腔スワブ、深い咽頭スワブを含め、トランス気管洗浄液、気管支肺胞洗浄液、および肺組織。試験された薬剤のいくつかはまた、末梢血または糞便中に存在することができるので、我々は、プロシージャに、サンプルのこれらのタイプを組み込みました。この合理化されたワークフローは、個々のテストの代わりにパネルベースの病原体や毒素遺伝子の検出によって、効率的なテストを可能にすることによって、複数のプレートで実験を実行するに比べて時間とリソースを節約するのに役立ちます。ここで実証した呼吸器パネルは18アッセイは、各プレートあたり48サンプルまで収容、スルーホール三重に印刷されていました。検出されたウマの病原体は、ウマアデノウイルス1及び2、ウマ動脈炎ウイルス、ウマ鼻炎ウイルスA及びB、ウマヘルペスウイルス（EHV）タイプ1及び4、及びストレプトコッカス・エクイを含んでいました 。イヌの病原体は、イヌ呼吸器コロナウイルス（betacoronavirus）、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌニューモ、 気管支敗血症菌、およびマイコプラズマカニクイザルが含まれていました 。 Aユニバーサルインフルエンザアッセイおよび内部統制（MS2 RNAファージ）も含まれていました。

プロトコル

いいえヒト被験体または実験動物は、このプロトコルの開発に使用されませんでした。コントロールは、配列を確認したアンプリコンの精製によって、およびRNA標的のためのin vitro転写で生成されました。臨床サンプルはコーネルアニマルヘルス診断センターへの日常的な診断テストのために提出されました。

1.プレートデザイン

1. 各アッセイは、プライマー、プローブテストツールを使用して、60℃のアニーリングと標準プローブベースのリアルタイムPCRサイクル条件に準拠していることを確認するために、プライマー設計ソフトウェアを使用します（デフォルトのパラメータで設定定量プローブを選択します）。
   注：使用する代表的なRNA標的は、普遍的なインフルエンザシュウらによって発表され、マトリックスの標的アッセイ⁷から適応させました。次のようなプライマーおよびプローブは、次のとおりです。フォワードプライマー：GACCRATCCTGTCACCTCTGAC、リバースプライマー：AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA、プローブ：ファム - TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-QSY。ここで使用される代表的なDNAアッセイは、あちこちに適応させましたイーリアらによって発表されたウマヘルペスウイルス1型（EHV-1）の検出方法をメートル ^8。次のようなプライマーおよびプローブは、次のとおりです。フォワードプライマー：GCTCTCAGGTTTTACGACATC、リバースプライマー：CTTTACCCAGGCCCTTGAAA、プローブ：FAM-TCAACGTGGACAATACCGCAGTGATTAT-QSY。
2. 所望の形状にナノスケールのPCR増幅プレートを注文。
   注：この研究のために、18x3遺伝子発現形式が使用された（ 表1）。メーカーに各ターゲットのすべてのプライマーおよびプローブのための配列（またはインベントリアッセイID）を提供します。

2.核酸抽出

1. 任意の方法により全核酸（DNAやRNA）を抽出します。
   注：自動化された磁気ビーズをベース抽出キットをメーカーの指示に従ってここで使用された（詳細については、材料の表を参照）。
2. 次のようにサンプルを準備します。
   1. 10％の漂白剤とドライ徹底的に各試料容器の外側を清掃してください。手袋をはめたFワイプ交差汚染を防止するために、サンプル間の10％の漂白剤とインガーのヒント。
   2. 場所の鼻または生理食塩水を数滴と（赤トップ採血管など）の任意の滅菌、密封バイアル中の深い咽頭スワブは、処理の前に乾燥を防ぐために添加しました。
      注：綿、プラスチック、木材処理され、ダクロンや他の合成スワブを全て許容されるが、アルギン酸カルシウムスワブを避けます。
   3. 液体の少なくとも1〜2ミリリットルがあるように綿棒や気管洗浄のために、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を追加します。チューブに積極的に綿棒とDMEMをVORTEX。次に、新しいチューブにメディアの約1ミリリットルを転送するためにピペットを使用しています。
   4. 825×gで3分間遠心分離し、製造元の指示に従って組織破砕機を用いて機械的に溶解組織（DMEMの1ミリリットルで100から200 mg）を。新しいチューブに上清500μlのを転送します。
   5. 糞のために、1×リン酸緩衝SAの800μlの糞の400ミリグラムを組み合わせますライン液pH7.4（PBS）。ボルテックス1分以上用サスペンションは、試料を均質化または完全に中断されるまで。いったん均質化し、その後、新しいチューブに400μlのを転送し、18,000×gで10分間のサスペンションを遠心します。
   6. 全凝固していない血液について、サンプルをボルテックスし、250μlのアリコートを作ります。混合する溶解試薬と渦の6滴を追加します。 37℃で15分間インキュベートします。
3. 製造元の指示に従って溶解及び洗浄バッファーを準備します。 MS2ファージまたは内部陽性抽出制御⁹などの溶解バッファーへの選択肢の内部コントロールを追加します。
4. 各ビーズチューブに溶解緩衝液235μlのと（負の対照またはPBS）のサンプル175μlを添加します。製造業者のプロトコールに進みます。
   注：精製された全核酸は、90μlのここに溶出しました。

3.逆転写/プレ増幅（プリアンプ）

注：で使用されるすべての試薬およびサンプルを保管してくださいすべての回で氷の上のプリアンプの反応。プリアンプに続いて、室温で全ての試薬を保持します。

1. ネガティブコントロールとして溶出したDNAおよび/またはRNA、PCR反応ミックス、ヌクレアーゼフリー水を組み立て、そしてポジティブ増幅制御のための基準をプールしました。
   注：48サンプルまでは、コントロールを含む増幅プレートで実行することができる（試料が引っ張られるべきであるから、各抽出板のための少なくとも一つの負の抽出制御を含みます）。
2. サンプルマップを印刷します。二人目の検査マップとサンプルレイアウトが一致することがあります。
3. 1.5mlチューブで、プリアンプのマスターミックスを準備するには、次を追加します。
   注：14μlの最終容量がここで使用されました。
   1. 各ターゲットからの予混合プライマープールを追加するように、各プライマーの最終濃度は900 nMです。
      注：ここで使用されるプールは10倍濃度で調製し、1.4μlの反応ごとに追加されました。
   2. 600 nMもしくは0.1×の最終濃度にランダムプライマーを追加します。
   3. 最終容量（ここでは7マイクロリットル）の半分に2倍RT-定量PCRミックスを追加します。
   4. 穏やかにボルテックスし、スピンダウンしてマスターミックスの成分を一緒に混ぜます。
4. プレートのみ（列1-6）の左側を使用して、標準的な96ウェルプレートにプリアンプを実行します。
5. 各ウェルにプリアンプのマスターミックスの8.5μlのおよびDNA / RNAサンプルの5.5μLを加えます。
6. すべての試薬（プリアンプミックスとサンプル、陽性対照および陰性対照）を結合した後、完全に透明な接着剤シールで、標準的な96ウェルプレートをシール。サイクル中、シール間隙の形成を防止するために、カミソリの刃を使用して、余分なシールを取り除きます。 PCRプレートスピナーを用いて20秒間密閉されたプレートを遠心。すべての試薬は、プレートウェルの底に結合されて確認してください。
7. 以下の条件で、従来のサーモサイクラー上のプリアンプのアッセイを実行します。50℃で15分。 95℃で1分; 95℃で、次に2分で60℃で15秒の20サイクル。 99.9＆＃176; 10分間、C。 4℃で保持します。プログラム開始する前に、これらの条件。
8. 、従来のサーマルサイクラーをオンにプリアンプサイクリングプログラムを選択して、プログラムを起動します。サーモサイクラー（ないカバー）の底部は、画面上で読み温度を監視することにより、cDNAを生産（50°C）のために必要な温度に到達した場合にのみ、サーモサイクラー中で96ウェルプレートを置きます。これに先立ち、偽陽性の結果を生成するリスクを最小限に抑えるために、コールドプレートを保ちます。
9. プリアンプの実行が完了すると、プレートは、密閉されたままであることを確認してください。
10. 4.1すぐにステップ進みます。 、一晩このプレートを格納するステップ4.5から4.2に記載されているように希釈を実行するには、代わりにゆるくプレートをカバーするのを除いて、4℃で保存ジッパーロック袋の内側に透明な接着剤シールと場所、でプレートをシール。

プリアンププレートの4希釈

1. あちこち増幅プレートの適切な数を削除します（4までを一度に実行することができる）冷凍庫メートル。パッケージを開けないでください。プレートは室温で少なくとも15分間ウォームアップすることができます。プレートのシリアル番号とロット番号を記録します。
   注：未開封のプレートには、最大24時間室温で残ることができますが、ベストプラクティスのために、冷凍庫から前に必要な30分以下でこれらを削除しません。
2. PCRプレートスピナーを用いて20秒間完成プリアンププレートを遠心。増幅機とコンピュータの電源をオンにし、関連付けられたプログラムを起動します。
3. PCRセットアップ領域からすべての不要な項目を削除します。二重手袋と袖カバーに入れてください。
4. プリアンププレートからシールを取り外し、慎重に取り外し、外側の手袋を破棄します。ピペッティングによりカラム96ウェルプリアンププレートの1-6混合の各ウェルにTE緩衝液の56μLを添加することにより、5：1でプリアンプ製品を希釈します。底部から吸引すると、より高いアップを分配するが作成していない、だけピペットの最初のピットストップに行きます泡。かかわらず、未使用のすべてのウェル6列にTEバッファーを追加します。
5. 透明な接着剤またはホイルシールのいずれかでプレートを再密封し、PCRプレートスピナーを用いて20秒間、それを遠心します。ステップ6.1が完了するまで（緩く覆われた）はさておき、このプレートを設定します。残りの手袋と袖のカバーを破棄します。

増幅プレートに384ウェル転送5.準備

1. 蓋、栓、浸漬液、プレートプレス、エタノール噴霧ボトル、および糸くずの出ない実験用ワイプのシリンジ：増幅プレートをカバーし、シールするために必要な材料を設定します。 （力を必要とする）シリンジキャップを外し、注射器の上に小さなプラスチックの先端をロックします。 （いくつかの小さな気泡が先端に残っている場合、それはOKです）空気の蓄積を除去するためにペーパータオルの上に浸漬液の少量を取り出します。真空密封されたアルミ袋から注射器を除去する60分以内に液浸流体を使用してください。注射器が開かれると、後で使用するためのキャップを再接続しないでください。
2. チェックプレートローディング液体ハンドラーの廃棄物のビンが空であることやヒントのボックスを開きます。新しいボックスが開かれ、先端ボックスカバーのヒントの有効期限を書き、ヒントは有効期限が切れていないことを確認してください。液体ハンドラとコンピュータの電源を入れ、セルフテストを実行します液体ハンドラ・ソフトウェアを開きます。
3. 「セットアップとロード」をクリックしてください。サンプルトラッカーソフトウェアから作成したCSVファイルを選択し、「参照」をクリックします。ファイルが表示されない場合は、「インストゥルメント/編集環境設定」に移動して、「サンプルプレートファイルフォルダ」で「変更」をクリックします。 csvファイルが保存されているフォルダを選択します。そして、その後、 "参照"とファイルを選択し、「セットアップおよびロード」をクリックします。
4. 次に、次の「プレートホルダーの位置1」〜「ブラウズ」をクリックし、プレートと同じシリアル番号を持っている（製造業者によって提供される）TPFファイルを選択します。

6.リキッドハンドラー転送

注：Fiのを起動しないでください上記の手順の全てが完了するまで、384ウェルプレートをlling。蒸発させると、小容量で懸念される - 384ウェルプレートは、内部の液体で覆われていない放置しないでください。

1. 一旦、全て上記の手順が完了している新しい、よくフィット二重手袋を着用し、スリーブがカバーしています。その後、384ウェルプレートに増幅マスターミックスの2.5μlを添加します。
2. 表2にマップに従って384ウェルプレートに希釈したプリアンプ製品の2.5μLを移し、すぐにホイルシールでしっかりとプレートをカバーしています。外側の手袋とスリーブカバーを破棄します。
3. 遠心PCRプレートスピナーで20秒間、384ウェルプレート。
4. ホイルシールを削除するが、液体ハンドラで384ウェルプレートを置かないでください。
5. 包まれた増幅プレートを含むパッケージを開き、右側のシリアル番号を持つ最初のスロットに液体ハンドラーに慎重にそれを置く - 表面Oに触れることなくエッジでケースを開催プレートF。開口部の1時間以内に開封されたプレートを使用してください。
   注：これは、スルーホール内部プライマーおよびプローブの少量を乱す可能性があるので、ケースの目的は、タッチされることからプレートを保護することです。
6. すべてが所定の位置になると液体ハンドラ内で384ウェルプレートからホイルシールを取り外します。 [次へ]をクリックし、各ステップが完了すると、すべてのチェックボックスをオンにします。実行を開始するには、[OK]をクリックします。
7. 液体ハンドラーへの扉を閉じ、直ちに充填プロセスを開始します。液体ハンドラーの隣に滞在し、プレートが充填された後、すぐに次のステップに進みます。
8. 液体ハンドラが実行されている間、ケース蓋の下部から保護膜を除去。
   注：ケース蓋の底の接着剤は、赤テープと保護膜で覆われています。フィルムは赤いテープにアクセスする最初に削除する必要があります。
   1. ステップ6.15までの場所でトップフィルムを残します。プライムRELEASに少し引いて、赤テープ接着剤からそれを電子。
9. 液体ハンドラーからロードされた（埋め）増幅プレートを外し、ゆっくりと右のシリアル番号プレートプレスに配置します。
10. （プレートの方を向いて）底面の右と接着剤上の切り欠き端部とプレートの上に蓋を置きます。
11. 慎重にそれを開閉板押圧レバーを引き下げ。光が20秒間点滅します。この時間の間にプレートプレスに手を触れないでください。ライトが緑色に点灯したら、慎重にレバーを持ち上げ、慎重に端にそれを保持することによって密閉されたプレートを取り外します。
12. 例縁によって垂直方向に密封された増幅プレートを保持したまま、すぐに例最後にロードポートにシリンジ先端を挿入し、その後、プレートとの間の空間を充填する1穏やかな連続動作でゆっくりと浸漬液を分配蓋。板が浸漬されると、隅に小さな気泡を残します。
13. Hしながら古いプレートは、垂直エッジによって、ハンドルが途切れるまで、十分な圧力を加え、ポートにプラグを挿入し、プラグを時計回りにねじることにより、ロードポートを密封します。グリップケースのエッジがしっかりとハンドル破壊の力は、ケースを低下させないように。プレートがドロップされた場合は、それを捨てます。
14. 糸くずの出ないことをワイプが完全にエタノールを噴霧されたとのケースを清掃してください。ケースを乾燥させるために、ワイプクリーンで下向きのケースを拭きます。静かにケースを扱います。井戸上記ガラスに圧力を加えないようにしてください。
15. 増幅機にシールプレートを持参してください。 「インストゥルメント」タブで、「インストゥルメントコンソール」を選択します。その後、増幅マシンを選択し、「オープンドア」ボタンをクリックします。
16. アダプタが正しく左上隅にA1と並んされていることを確認し、プレートアダプタの最初のスロットに増幅プレートを置きます。東洋最大と向いているバーコード付きプレート楽器の正面。 「クローズドア」ボタンをクリックします。アダプタトレイの使用に注意してください - 10用途の制限があります。
17. 画面下部の[ホーム]タブの下で、ファイル名を指定して実行]メニューの下、OpenArrayを選択します。 「プレートIDを取得します。」をクリックします空のボックスは自動的にプレートについての情報が取り込まれます。実行を開始するには、「スタートファイル名を指定して実行」をクリックします。
18. 液体ハンドラーのソフトウェアを閉じて、液体ハンドラーをオフにします。チップラックの上に先端カバーを置きます。ごみ箱からヒントを破棄し、それをきれいに。清潔で作業面、ピペット、廃棄物のバケツ、とヒントボックスなどすべての項目を除染。
19. -20℃で透明な接着剤シールとストアとプリアンププレートを再密封。

7.結果の分析

1. 実行が完了したら、ファイルを保存し、ファイルを閉じるには、画面の一番下に実行名を持つタブの「X」をクリックしてください。
2. オープンドア」をクリックします。「ドアを開くには、画面の上部にある。ない浸漬液が漏れ出ていないことを確認し、増幅プレートを取り外します。をクリックして「ドアを閉めるには、画面の上部にある「閉じるドア。
3. 「開く」をクリックして、それを開くために、実行ファイルを選択します。画面右上のボタンを分析し、緑色を押します。 （.txtファイルなど）結果をエクスポートするには、画面の左側にある「エクスポート」をクリックし、「エクスポート開始」。それが開いた後、ファイルを最小化します。そして、「エクスポートQCイメージ」をクリックします。
4. 以下の基準に従って画像解析プログラムでQCの画像を確認してください。
   1. 何のダークスポットや汚れがないことを確認することにより、PRE-READ_CHANNEL_4.tiffとPOST-READ_CHANNEL_4.tiffを使用してロードの品質を評価します。
      注：このチャネルによって検出された染料は反応がロードされたときに溶液中に放出されたプライマーおよびプローブの製造業者、で追加されます。このチャネルでの読み取りは、反応が適切であったことを示していますロードされ、染料と混合したプライマーおよびプローブが存在していること。
   2. S02_C001_t03_p001_m1_x2_e1_cp＃1 _spotfind.tiffを使用してロードした後、プレートに漏れや攪拌のために確認してください。画像が暗く見える場合はプレート全体が表示されるまで、（Ctrlキーを押しながらコントロールを開くには、Shift + Cを）輝度を上げます。画像はありません影、泡、または変位のサンプルで均一に見えることを確認してください。
   3. STAGE2_CYCLE1_CHANNEL_1.tiffとSTAGE2_CYCLE40_CHANNEL_1.tiffを使用して蓋（輝点）の下蓋の配置や破片を評価します。
5. オプション：結果のマクロ（補足コードファイル）を含むスプレッドシートを開きます。エクスポートしたデータファイルでは、右画面の下部にあるタブをクリックし、「移動またはコピー」を選択します。 「予約する」フィールドで、「Macro.xlsm結果」を選択します。 「最後に移動」と「コピーを作成」チェックボックスをオンにします。次に、[OK]をクリックします。
   1. 結果マクロオプションは、「予約する」フィールドに表示されない場合は、シムプライエクスポートしたデータファイルのワークシートの内容をコピーして、新しいタブに貼り付けます（すべてのセルとCtrl-Cを強調表示するには、左上のセルをクリックしてください）。
6. 古い「エクスポート」タブを削除してから、「エクスポート」として新たに追加されたタブの名前を変更します。
7. 「Altキーを押しながらF8」をクリックします（または[マクロを表示]をクリックします）、次に「マクロ」を選択し、「ファイル名を指定して実行」をクリックします。次に、 "Macro2では"を選択し、「ファイル名を指定して実行」をクリックし、 "Altキーを押しながらF8」をクリックすることで、Macro2では、これを繰り返します。
8. 関連する情報（日付とシリアル番号）を使用して、結果のマクロファイルの名前を変更し、テーブルの上にこの情報を入れて、エクスポートされた結果のフォルダに同じファイル名として保存します。最後に、マクロ生成された結果表をプリントアウト。
9. 増幅マシンソフトウェアでは、画面の左側に分析/増幅プロットを選択することで、マクロテーブルに対して各サンプルおよびコントロールのための曲線をチェックしてください。次に、サンプルのタブを選択し、各サンプルをクリックしてください表中の陽性結果のそれぞれについて、2または3の正の増幅曲線があることを確認してください。
10. 増幅機の電源をオフにします。

結果

結果は、ポジティブコントロールルーチン診断試験のために提出臨床サンプルの組み合わせによる代表的なRNAアッセイ（インフルエンザマトリックス）とDNAアッセイ（EHV-1）のために、図1および図 2に示されています。この典型的な反応を通じて放出された蛍光シグナルは、1サイクル当たりの生の蛍光値をプロットし、図1に示されています。すべての相対サイクル閾値（Ct）値は、自動的に増幅マシンソフトウェアによって生成されました。バックグラウンド蛍光は、Ct値を計算する前に蛍光読み取りに組み込むのではなく、負荷品質の評価のための別個の測定基準として使用しました。

各ターゲットの検出（LOD）の分析限界は95％の検出レベルでのCt値の全体平均値プラスのコントロールのプールで2標準偏差に基づいて算出しました。すべてのターゲット。複製の少なくとも95％が代表的なアッセイのために陽性であった最高希釈は50コピーでした。 5コピーの検出は、複製の50％に成功しました。どちらのアッセイは、以下の1コピーで検出されました。 RNAおよびDNA分析のためのLODは、21.92と20.05のCt値で計算しました。これらの値は、疑わしい対として正の（潜在的にではない反復）の報告値のカットオフであると考えられました。

ターゲットの分析的性能の他の側面は、3つの異なる日（ 図2）で実行プール陽性対照の連続希釈を用いて評価しました。代表的なRNAとDNAのアッセイの平均効率は101.1パーセントと106.6パーセントでした。すべてのターゲットの全体の平均効率は101.3パーセントでした。アッセイはまた、良好な直線性（R ^2> 0.98）を有していました。複製中の変動はスルーホール一般的に、臨床サンプルについての0.2の標準偏差内でしたDコントロール。標的のいずれかとの間の交差反応性は観察されませんでした。

補足ファイル内の最終結果のワークシートは、10臨床診断サンプルおよび4を制御するための代表的な定量的な結果を示しています。臨床サンプルは日常鼻/口咽頭スワブ、肺組織、および糞便サンプルを含む試験した試料の種類のサブセットです。このセット内の1つ（馬）糞便サンプルは、サンプル中の阻害剤の存在を示して失敗したMS2内部統制を、示しています。これは、典型的に溶出された試料および/または再抽出の希釈によって管理されています。ここでそうであるように、負の増幅制御は、すべてのターゲットに対して否定的であるべきであり、負の抽出制御は、内部コントロールが含まれている必要があります。臨床セットでは、サンプルがbetacoronavirus、 気管支敗血症菌 、イヌジステンパーウイルスA、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌニューモ、およびインフルエンザのためのCt値を生成しA.

図1増幅プロット。蛍光読み取りはRNAアッセイ（A）およびDNAアッセイ（B）用の増幅サイクルに対してプロットされています。三角形はCt値を表す示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2.標準曲線を3つの異なる日に試験したRNAおよびDNAアッセイの標準曲線は、ポジティブコントロールを使用して、増幅の直線範囲を示すためにプロットされています。 RNA（A）又はDNAのコピー数のサイクル閾値（Ct）値は対数に対してプロットされている（10）（ この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

増幅プレート及びターゲット位置の表1に概略図。このプラットフォーム上でナノスケールのリアルタイムPCR試験のために使用したプレートは、顕微鏡スライドのサイズであり、貫通孔64の48サブアレイに配置され、貫通孔3,072の合計個々の反応のために。一つのサブアレイは三連で18ターゲットに、ここに示されています。各試料は、液体ハンドラーずつサブアレイに添加されます。プレートは、表面張力を介して貫通孔内の試薬を保持するために親水性および疎水性化合物で被覆されています。ステンレス鋼チップは3,072マイクロ加工、320ミクロンdiameteの直線アレイを形成するために、「フォトリソグラフィパターン化およびウェットエッチングでありますrを次のようにターゲットのための33ナノリットルの穴それぞれ^「2略語は次のとおりです。BCOR、イヌ呼吸器コロナウイルス（betacoronavirus）; BORD、 気管支敗血症菌 CAV、イヌアデノウイルス; CPIV、イヌパラインフルエンザウイルス; CPNV、イヌニューモ; DISTA / B、イヌを。ジステンパーウイルスA及びB; EADV1 / 2、ウマアデノウイルス1/2; EAV、ウマ動脈炎ウイルス; EHV1 / 4、ウマヘルペスウイルスタイプ1/4; ERVA / B、ウマ鼻炎ウイルスA / B; IVM、インフルエンザマトリックス; MCYNOS、 マイコプラズマカニクイザル 、MS2、内部統制（MS2 RNAファージ）; SEQU、 ストレプトコッカス・エクイ 。

表2プレート伝達マップ 384ウェルプレートの96ウェルプリアンププレートから転送するために、固定の8チャンネルピペットを使用するための色分けされたプレート転送マップが示されています。あるいは、調節可能なピペットを使用してもよいです。同じ手順にかかわらず時間のたびに実行されます OW多くのサンプルをプレートにあります。

補足ファイル。サマリーテーブルに結果をフォーマットするための2つのマクロを含むマクロ有効スプレッドシートファイルは、（プロトコールに記載されているように）が設けられています。マクロによって生成される典型的な結果表は（最終結果の下の）ファイルに含まれています。 2のマクロは、（48サンプルまで）最初の列のサンプル名と肯定的な結果とのそれらのため、各ターゲットのための3つのCt値の平均を記入します。増幅しなかったターゲットがこの表に空白表示されていることに注意してください。これは、簡単に用紙1枚に印刷され、効率的に生データを確認するための基準として使用することができます。最終的な結果]タブでは、10の臨床サンプルおよび4のコントロールのための代表的な結果が示されています。アッセイ名の略語は、 表1の凡例に記載されています。www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm "ターゲット=" _空白 ">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

この手順は、6ヶ月（週2~3回）にわたって我々の研究室での呼吸器病原体のルーチン試験に使用されてきました。また、個別にカスタマイズされたプレート上の糞便サンプルおよび細菌分離株における腸管病原体プロファイリングのために同じ手順を使用して成功を収めています。プレートが生産されると、経験豊富なスタッフが一つの標準勤務時間内の2-7のステップを完了することができます。最も重要なステップは、プリアンププレート、（蒸発を防ぐために迅速に行わなければなりません）プレート間の前置サンプルの転送、および増幅プレートの最終的なカバーの適切なシールです。それが大幅にこのプロセスに必要な時間や事務処理の量を減少させたとして結果の分析（サンプルおよびコントロールの曲線をチェックする）ためのガイドとして、マクロのスプレッドシートを使用することも重要でした。提供マクロスプレッドシートは一例です。それは、異なる構成を有する板のために修正または再作成する必要があります。これは簡単にPEすることができます基本的なスプレッドシートの知識を持つ誰かによってrformed。

増幅板（33 NL）上にロードしたサンプルの非常に少量に、前増幅が必要とされます。このプロトコル（図示せず）の最適化では、増幅前にマスターミックス、ランダムプライマーの添加、サイクル数、アニール時間、および希釈を含む前置増幅パラメータの数を比較しました。各ターゲットは独自の最適な条件を持っていて、ここに記載されているものは、私たちのパネルの全体的な検出の最高の限界をもたらしたものを表します。このパネルには、ルーチン獣医の診断テストで検出された病原性ターゲットとサンプルタイプの広い範囲をカバーしていますが、プリアンプ手順への変更は、異なるパネルのために必要になることがあります。製造者に最適化された増幅条件は、95℃、アンでの変性、続いて95℃の酵素活性化で10分間で標準プローブベースのリアルタイムPCRプロトコルに基づいています60℃でのイーリング/エクステンション。プライマーおよびプローブはまた、メーカーに最適化された条件、したがって、滴定を必要としないを使用して、プレート上に予め印刷されています。 （関係なく、ターゲットのタイプの）全ての試料について、逆転写および予備増幅工程を組み合わせることで、ワークフローの効率を維持するために必要でした。全てのサンプルが逆転写し持つことも、感度を最大化するために有益です。さらに、阻害剤を最小限に抑えるために最適化されたプリアンプ用マスターミックスの使用は、同じプレート上の異なるサンプルタイプを組み合わせることで汎用性を可能にします。

シュウらによって記載された疾病管理センター（CDC）インフルエンザマトリックスアッセイ^。7およびナノリットルスケールの反応のためにここに適合した人間とコンパニオンアニマルからサンプルをテストするのに適しているアッセイ普遍的なインフルエンザです。これは、マイクロリットルスケールのレアを使用して、すべてのA型インフルエンザウイルスのマトリックス遺伝子の普遍的検出のために設計されましたctions。これは、CDCヒトインフルエンザウイルスパネルとCDC豚インフルエンザパネルの一部として世界中で使用されています。ここで適応EHV-1アッセイ^8は、流産や神経疾患（Pusterlaとハッセー¹⁰によってレビュー）を引き起こす可能性があります馬の重要な呼吸器病原体を検出します。種に依存しない内部対照とのハイスループットプラットフォームにこれらのテストを適応の重要性は、それらがOneHealth監視手法に組み込むことができることです。高スループットのテストプラットフォーム上でこれらのアッセイの両方を持つことは、臨床施設、避難所、およびパフォーマンスイベントのための緊急事態への準備を容易にするであろう。

上記の結果は、分析的な性能にかなり多くの変動を示したマイコプラズマカニクイザルを除いて、プレート上のすべてのターゲットの代表でした。これは、理想的には58〜60となるべきであるプライマーの次善の融解温度（T _m）に思われました＃176; C（理想的なプローブのTmは、68から70℃です）。このプラットフォームの制限は、それが迅速に配列を変更する能力を制限する個々のプローブを、注文の場合よりもプレートの設計、製造に時間がかかることです。一般に、リアルタイムPCRの他の制限は、新規または予期しない病原体を検出することができないことです。これは、複数の種における配列に一致するアッセイを設計することによってある程度克服することができますが、公平な全ゲノムシーケンシングベースの方法論は、新規薬剤の発見のために、より適しています^。11,12

ナノスケールのリアルタイムPCRは、シンドロームベースではなく、高スループット分子診断における試薬や人件費を低減するために有用である種ベースのテストのための新しいパラダイムを可能にします。このアプローチによる大規模なパネルテストは、ダンとGurfield ¹³とMoutailler ら ¹⁴に記載されているようなOneHealthサーベイランスを容易にすることができます。初期のスワブサンプルの収集、一般的に臨床的発症の3日以内に、呼吸器病原体の存在を同定するための最良の機会を提供します。感染症の出現は、多くの場合、予測不可能であり、および試薬の変更を必要とすることなく、異なる種に対して実行できるテストは準備のために理想的です。この技術の将来のアプリケーションはpathotyping、抗菌薬耐性プロファイリング、さらにシンドロームベースの臨床診断のパネルにある可能性が高いです。ナノスケールリアルタイムPCRは、複数のサンプルの病原体タイプの迅速、ハイスループットスクリーニングのために最も有用であり、新しく出現する病原体を同定するための公平なまたは部分的にバイアスされたシークエンシングに基づくアプローチによって補完されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Zap-OGlobin II 溶解試薬	ベックマン・コールター	7546138	血液サンプルを調製するためのオプションの試薬です。
抽出キット (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	AM1840	その他、目的のサンプルタイプに適した抽出キットを代用することができます。このキットには、PBS、溶解バッファー、および洗浄バッファーが付属しています。
2x ワンステップ RT-qPCR ミックス (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix)	Quanta Biosciences	95134-500
遺伝子特異的プライマープール	IDT	カスタムオーダー	ユーザーが作成することも、増幅プレートと一緒に購入することもできます。
ランダムプライマーミックス	ニューイングランドバイオラボ	S1330S
スタンダード96ウェルプレート	サーモフィッシャー/アプライドバイオシステム	N8010560	これは、使用される従来のPCR装置に収まる任意のプレートにすることができます。
増幅マスターミックス(OpenArray master mix)	サーモフィッシャー/Applied Biosystems	4462164
透明粘着シール	サーモフィッシャー	430611
ホイルシール	エクセルサイエンティフィック	AF-100
384ウェルプレート	サーモフィッシャー/アプライドバイオシステムズ	4482221
増幅プレート(QuantStudio 12K Flex OpenArrayプレート)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4470813	標準的なTaqMan条件に適合する任意のアッセイでカスタマイズできます。
アクセサリーキット	サーモフィッシャー/アプライドバイオシステム	ズ 4469576	ケースの蓋、プラグ、液浸液が含まれています。
AccuFill tips	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457246
増幅装置 (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4471090
リキッドハンドラー (OpenArray AccuFill System)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4457243	増幅装置と一緒に購入します。
プライマー設計ソフトウェア(Primer Express)	Thermo-Fisher/Applied Biosystems	4363991	プライマーとプローブの詳細な仕様については、製造元の指示書を参照してください。
画像解析プログラム (ImageJ)	NIH		Available at http://imagej.nih.gov/ij/
Spreadsheet program (Excel)	Microsoft		Available at https://products.office.com/en-us/excel
DMEM	Thermo-Fisher/Gibco	11965-092
Tissue disruptor (TissueLyser II)	Qiagen	85300
Conventional thermal cycler (Veriti)	サーモフィッシャー/アプライドバイオシステム	4375786	加熱された蓋を備えた従来のサーマルサイクラーであれば、どれでも使用できます。
PCRプレートスピナー	VWR	89184-608	この装置は、1つの速度(2,500 rpm)のみを持ち、蓋を閉じるとローターが始動し、ボタンを押すと停止します。
TE バッファー	ミリポア	8890-100ML	10 mM トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン塩酸塩、1 mM エチレンジアミン四酢酸、pH 8.0