方法論記事

HIV-1感染細胞からのエキソソームのSILACベースのプロテオミクス特性評価

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DOI：

10.3791/54799

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2017年3月3日

 ,  ,  ,  , 
1Brown University, 2COBRE Center for Cancer Research, Lifespan Laboratories, Rhode Island and Miriam Hospitals, 3Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Warren Alpert Medical School, Brown University

この記事について

サマリー

ここでは、ホストエキソソームプロテオームのHIV-1感染の効果を分析するために、細胞培養中のアミノ酸による安定同位体標識法（SILAC）を用いて定量的プロテオミクスの方法を記載します。このプロトコルは、容易に異なるストレスまたは感染の条件下で細胞に適合させることができます。

要約

Proteomicsは、タンパク質の大規模な分析です。液体クロマトグラフィータンデム質量分析法(LC-MS/MS)などのプロテオミクス手法は、一度に数千のタンパク質を特性評価できます。これらの強力な技術により、特に細胞が感染、ストレス、特定の試験条件などのさまざまな刺激にさらされた場合の細胞の変化を体系的に理解することができます。最近の開発でも、エキソソームプロテオームの解析には時間がかかり、多くの場合、複雑な方法論が必要です。さらに、結果として得られる大規模なデータセットは、研究者がさらに下流の研究を行うために、堅牢で合理化された分析を必要とすることがよくあります。ここでは、細胞がHIV-1に感染したときのエキソソームプロテオームを特徴付けるためのSILACベースのプロトコルについて説明します。この方法は、単純な同位体標識、示差標識細胞からのエキソソームの単離、および質量分析に基づいています。これに続いて、プロテオミクスヒットの詳細なデータマイニングとバイオインフォマティクス分析が行われます。結果として得られるデータセットと候補は理解しやすく、多くの場合、ダウンストリーム分析に役立つ豊富な情報を提供します。このプロトコルは、他の細胞内コンパートメントや幅広い試験条件に適用できます。

概要

ウイルス感染を含む多くのヒトの疾患は、多くの場合、影響を受けた細胞とその周辺行われる独特の細胞プロセスに関連しています。タンパク質は、多くの場合、これらのプロセスを仲介する、究極の携帯エフェクターとして働きます。タンパク質の分析は、多くの場合、影響を受けた細胞の局所環境に関して貴重な情報を提供し、疾患の病因の根底にあるメカニズムを理解するために私たちを助けることができます。様々なタンパク質分析技術の中で、プロテオミクスは、特に非常に有望です。強力な、大規模なツールとして、プロテオミクスは、特に、タンパク質の機能および相互作用の領域において、細胞プロセスの全身的な理解を提供することができます。特定のタンパク質を分析して、調査のサイトにおいて、研究者は、細胞成分、特にタンパク質の発現をモニターすることを可能にする標識技術の開発により簡素化されます。多くのプロテオーム解析は、携帯で行われてきたがプロテオームスケール、細胞内コンパートメントにプロテオミクスの特徴付けは、1特に有益であることが判明しています。これは、HIV-1感染症の研究によく例示されています。

エキソソーム、細胞タイプ2、3の広い範囲によって分泌さ30〜100nmの膜小胞は、細胞間コミュニケーションと分子輸送の重要な構成要素です。これらは、以前にHIV-1出芽過程4、5で重要な役割を果たすことが発見されました。機能解剖とプロテオーム解析を組み合わせることにより、我々は、HIV-1感染細胞から放出されたエキソソームは、細胞のアポトーシスおよび増殖6を含む受容細胞を、隣接の細胞特性に影響を与えるユニークかつ定量的に異なるタンパク質の署名と港調節分子で構成されていることがわかりました。方法は、このプロトコルに記載されており、HIV-1感染細胞からのエキソソームの、すなわちSILAC（細胞培養中のアミノ酸による安定同位体標識）7ベースのプロテオミクス特性評価。同様のアプローチは、より良い目的の特定の区画または画分に実験的応力を調整し、記載された手順に必要な変更を行うことで、発病時に他の細胞内コンパートメントを理解するために適用することができます。

定量プロテオミクス法の最近の発展を考えると、特定の実験のために最も効率的な方法を選択するときに選択することが多くあります。これらのうち、化学ベースのiTRAQ（相対および絶対定量のための同重体タグ）8とラベルフリーMRM（多重反応モニタリング）9の技術があります。両方の方法は、強力なツールであり、特定の設定のために良い選択です。主に細胞株を操作典型的な研究室のために、しかし、これらの2つの方法は、relativelを有しますyの高いコストと多くの時間がかかるSILACベースの方法と比較しています。 SILACは、細胞タンパク質に培養培地からのアミノ酸の非放射性同位体形態を組み込んだ、代謝ベースの標識技術です。一般的に、SILAC実験は、例えば、感染および非感染、2つの細胞集団で始まります。完全な標識化が達成されるまで、それぞれが差動で、その特定の同位体の環境で標識されています。これらの細胞を標識したエキソソームを、次いでタンパク質抽出に供されます。一度抽出し、標識されたエキソソームのタンパク質は、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法10を用いて分析します。最後に、質量分析結果と大幅に標識されたタンパク質は、同様に厳格な生化学的検証を分析し、統計的およびバイオインフォマティクスに供されます。我々の以前の調査レポートは、細胞株は、ANに通常あるようにSILAC /エキソソーム手順は、初代細胞よりも細胞系に適していることを示唆しています効率的な同位体標識のための積極的な増殖性状態、

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プロトコル

1.細胞培養およびHIV-1感染

注：実験を開始する前に、それはMTTアッセイ12を介してトリパンブルー染色11を介して、細胞の生存率およびそれらの増殖をチェックすることをお勧めします。新たに調製したSILAC培地を使用することも重要です。種々の細胞株は、それらが活発に増殖段階にあり、そしてHIV-1感染症、または選択した試験条件に感受性である限り、使用することができます。このプロトコルでは、例として、H9細胞株を使用します。

  1. 各細胞培養フラスコにシード2×10 6個のH9細胞。 10％透析ウシ胎児血清（FBS）、100 mg / Lで13 C 6、L-リジンおよび100mg / L 13 C 6〜15 N 4 L-アルギニンを含有するRPMI 1640培地標識10mlの一つのグループを成長させます。 10％透析FBS、100 mg / LのL-リジンおよび100mg / LのL-アルギニンと10mlの標識されていないRPMI 1640培地中で、他のグループを育てます。
  2. 重いアミノ酸で標識された培地中の細胞のタンパク質が実質的に完全にラベル付けされた時点で6倍加（> 99％）のための細胞を増殖させます。新鮮な培地を追加するか、定期的にメディアを変更します（1〜3日毎に、細胞の種類に応じて。H9細胞については、培地3日ごとに変更）。標識化の終わりには、より多くの細胞の増殖に対応するために、培養体積（ 例えば、約30 ml）を増加させます。
    注：トリパンブルー染色及び細胞計数を経由して、実験の開始時に正確な細胞倍加時間を決定します。
  3. 48時間の標準的なHIV-1感染のプロトコル13を使用して、HIV-1 NL4-3で標識された細胞に感染します。 0.3周りの感染多重度（MOI）でウイルスの適切な量で細胞をインキュベートします。 HIV-1 p24抗原ELISAキットを用いて、培養上清のP24の定量によってHIV-1感染を確認してください。細胞の正常な感染を確認するために、免疫蛍光アッセイ14を実行します 。ケーpは、HIV-1感染せず、非標識培地中の非標識細胞を増殖させます。
  4. 感染の終了（ステップ2.1）で、両グループの上清を収穫。

2.エキソソームの単離

注：超遠心分離工程の一連の培養上清からのエキソソーム画分15が濃縮されます。 100,000以上のxグラムの速度に達することができる超遠心ローターで、4℃で、次のすべての手順を実行します。

  1. 細胞を避け、50ミリリットルコニカルチューブに培養物の上清を収集します。残りの細胞を除去するために300×gで10分間、それらを遠心分離。
  2. 新しい50mlコニカルチューブ内の上清を収集し、死細胞を除去するために、2000×gで10分間、それらを遠心分離します。超遠心分離に耐えることができる商用ローター互換チューブに上清を得られた転送。
  3. 超遠心管のバランスをとるようにしてください。除去するために、万×gで30分間チューブを遠心細胞残屑。
  4. 10万×gで70分間超遠心管中の上清および遠心分離機を収集します。上清を捨てます。
  5. 新鮮なPBS 5ml中のエキソソームが豊富なペレットを再懸濁します。 10万×gで70分間、再び新鮮な超遠心管と遠心分離機にソリューションを転送します。
  6. 上清を捨てます。エキソソームを長期的に保存するには、-80℃でPBSと店舗の50μl中にペレットを再懸濁します。以下に示すように別の方法として、タンパク質抽出に直接進みます。

3.タンパク質抽出と準備

  1. 追加されたプロテアーゼ阻害剤カクテルで100から200μlのRIPA溶解および抽出緩衝液中で孤立したエキソソームペレットを溶解します。バッファーは、pH 7.6で、25mMトリス - 塩酸、150mM塩化ナトリウム、1％NP-40、1％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）で構成されています。プロテアーゼ阻害剤カクテルは、アプロチニン、ベスタチン、リットルなどのプロテアーゼ阻害剤の様々な含まれている必要がありますeupeptinは、A及びEDTA（エチレンジアミン四酢酸）ペプスタチン、それはプロテアーゼのフルレンジを阻害することができます。
  2. 13,000×gで（4℃）で10分間溶解したソリューションを遠心し、新しい1.5 mlのマイクロチューブにクリア上清を移します。
  3. ビシンコニン酸（BCA）またはBradfordアッセイ16を使用して、エキソソームの各サンプルのタンパク質濃度を定量します。
  4. 標識し、非標識試料からのタンパク質の等しい量（2μgの）を混合し、30分間120ミリアンペア/ 200 Vで、4〜20％SDS-PAGEゲル上で等量混合物を実行します。
  5. クマシーブルーで染色ゲルは、17を脱色が続きます。
  6. カミソリの刃を用いて、ゲルからサンプルレーンを切断します。その後、10〜15等分にゲルのレーンをカット。 10-15チューブの合計新鮮1.5ミリリットルのマイクロチューブに各ピースを入れてください。
  7. 50％アセトニトリル中の25mM NH 4 HCO 3でキューブを浸し、渦、そして上清を捨てます。二回繰り返します。ドライ真空濃縮器18、19キューブ。
  8. 10mMのジチオスレイトール（DTT）、渦、および遠心簡単にキューブを再水和。 1時間56℃でインキュベートします。上清を捨てます。
  9. 55mMのヨードアセトアミド、ボルテックスし、スピン中のゲルキューブを浸し。暗所で45分間室温でインキュベートします。上清を捨てます。
  10. 25mMのNH 4 HCO 3、ボルテックス、スピンでキューブを浸し、そして上清を捨てます。
  11. 50％アセトニトリル、ボルテックスし、スピンに25mMのNH 4 HCO 3でキューブを浸し。 3.9と3.10を繰り返します。
  12. 真空濃縮器でキューブを乾燥させます。 25mMのNH 4 HCO 3で25μlの配列決定グレード変更されたトリプシンを追加し、4℃で30分間インキュベートし、過剰の溶液を捨てます。トリプシンなしで25mMのNH 4 HCO 3でキューブを浸し、37℃で一晩インキュベートします。
  13. 簡単に言えばダウンキューブを回転し、余分得られたペプチドを転送新しいチューブにCT。 30分、およびスピンのために、キューブに50％アセトニトリル中で渦を5％ギ酸の30μLを加えます。抽出物と上清を兼ね備えています。未満5μlに真空濃縮器を有するペプチド抽出物を乾燥させます。
  14. LC-MS / MS分析のための質量分析の中核施設にサンプルを提出します。オープンソースソフトウェアから生成することができますMS分析データは、一般的に同定された各タンパク質標識/非標識比と同定されたユニークなペプチドの数のための受託番号が含まれています。

4.ウェスタンブロッティング検証

注：ウエスタンブロット法は、質量分析の結果を検証することをお勧めします。

  1. 標準ウェスタンブロッティングプロトコルに従って、各グループからの等量のタンパク質がロードされていることを確認してください。 MSによって同定目的のタンパク質に対する抗体（ 例えば 、アネキシンA5、乳酸脱水素酵素B鎖）を使用します。デンシトメトリーanalysiと共にウェスタンブロッティング検出、Sは、MSのタンパク質の同定と定量化が正確であることを再確認することができます。

5.プロテオームデータ解析

注：各MSは、複製のために重要なタンパク質候補のデータ品質評価、データの前処理、計算と決意が別々に行われています。上記の分析が完了すると、複製の解析されたデータを比較すると、21 20、6組み合わせます。

  1. MSデータの品質を評価します。
    1. まず、LOG2 SILAC-MSを変換するスプレッドシートプログラムで/定量化されたタンパク質の非標識比を標識しました。
    2. 科学的なグラフや統計ソフトウェアでは、グループ比40-100比ビンにヒストグラムを生成するために、1ビン当たりの比率の数をプロットします。ヒストグラムの正規分布は、MSデータ6の良好な品質を示しています。すべてのMSが複製のために、このステップを実行してください。
  2. MSペプチド比の信頼性と精度を向上させるために、2個未満定量化されたペプチドを有するタンパク質を除去することを検討してください。
  3. 大幅に上下調節されるタンパク質の候補を決定するには、有意性を計算するには、次の手順を使用して22をしきい値。
    1. 科学的なグラフおよび統計ソフトウェアでは、頻度分布データを非線形回帰または曲線適合を生成します。このステップでは、カットオフ値を計算するために使用できる値が得られます。 1.96、95％信頼限界のためにσまたは99％信頼限界のための2.56σ±中央値としてのカットオフ値を計算します。
      注：カットオフを算出する具体的な詳細はエモットらに見出すことができます。 22。
    2. （（過剰発現大幅に）その比1.96（2.56）よりも大きいかあるタンパク質候補の中央値以上の標準偏差を選択するか、1.96（2.56）よりも低い中央値以下の標準偏差大幅に過小発現）。
  4. 一貫性を達成するために、上記で特定の重要な候補の複製を比較してください。彼らはこの最後の選択ステップに合格するには、以下の基準を満たしていることを確認してください：候補者は一貫して、すべての反復で識別される必要があります。候補の複製がレギュレーションの彼らの方向に一致していなければならない（アップレギュレートまたはダウンレギュレート、好ましくは、候補の3複製のうち少なくとも2のいずれかでなければなりません）。
  5. その複製のデータをマージすることにより、上記の基準を満たす候補のデータを確定。

6.バイオインフォマティクスの検証と特性評価

注：既存のゲノムとバイオインフォマティクス情報は、ほとんどすべてのタンパク質のための豊富な情報を提供しています。その情報のデータマイニングとバイオインフォマティクス解析は重要な候補者のプロパティと機能への洞察を大量に獲得するのに役立ちます。このprocessは、適切な下流のウェットラボ実験を設計することが通常必要です。

  1. 彼らのGenBankアクセッション番号やUniProtのIDを使用して、候補タンパク質は、以前にエキソソーム中に発見されていることを確認するために、現在のエキソソームデータベース（Exocarta 23、Evpedia 24）に対する候補を検索します。このステップは、候補者がエキソソーム中に実際にある信頼のレイヤを追加します。
    1. アクセスhttp://www.exocarta.org/、「クエリ」と入力のいずれかの遺伝子やタンパク質名/アクセッション番号をクリックします。要約ページが表示され、エキソソーム中の証拠がもしあれば提供、表示されます。
  2. HIV-1およびヒトタンパク質相互作用データベース25に対して候補を検索します。また、候補タンパク質の相互作用および試験条件についての情報を提供することができる特定のデータベースを検索します。
    1. www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVでデータベースにアクセスします相互作用。 「タンパク質ドメイン名」の項目では、候補者の名前やアクセッション番号を入力し、検索をクリックします。検索結果は、HIV-1およびタンパク質候補との間の相互作用への洞察を提供し、真のHIV-1関連であるかもしれない候補者のどの提案することができます。
  3. インポートGenBankアクセッション番号または（例えばFunRich、機能充実解析ツール26など）GO解析ソフトウェアへの候補者のUniProtのIDとソフトウェアを実行します。
    1. http://www.funrich.org/でソフトウェアをダウンロードしてください。インストールが完了したら、ソフトウェアを開き、濃縮分析の下で、「データ・セットの追加」、およびタンパク質/遺伝子のリストをアップロード]をクリックします。次に、GO解析を視覚化するグラフの種類を選択します。
      注：GO解析結果を円グラフの形で視覚化されます。このステップは、生物学的プロセス（BP）の分野で候補に関連付けられているグローバルな洞察力、細胞成分（Cを得るために私たちを助けますC）、および分子機能（MF）。
  4. http://david.ncifcrf.gov/ 27でアクセスDAVID、そのウェブサイト上の「機能注釈ツール」をクリックします。候補リストを入力して、このような「UniProtのID」として、遺伝子の「識別子」を選択し、「遺伝子リスト」と検索を選択します。濃縮されたGOターム、p値、および他のパラメータは、「Gene_Ontology」カテゴリの下に "注釈サマリー結果」ページをクリックすることで見つけることができます。
  5. 他のタンパク質と候補者の潜在的な相互作用を調べるために、潜在的なタンパク質-タンパク質相互作用および可能な生化学的経路を解明するために公然とアクセス可能なSTRINGデータベース28を使用します 。
    注：分析と機能アノテーション（セクション6.3から6.4）のGOは、最新のSTRINGソフトウェアを使用して行うことができます。
    1. http://string-db.org/でデータベースにアクセスします。指定された秒に入力プロテインIDまたはシーケンスearchがボックスおよび分析のための適切な種を選択します。 「検索」をクリックします。結果は、両方の直接の（物理的）および間接的（機能）の関連付けに関する情報を提供します。エキソソーム候補のトップ10既知のマッチが表示され、重要な候補選択のために考慮すべきです。
      注：候補に関連付けられた大量の情報は、上記の手順を用いて分析することができます。最も重要な候補は、さらに下流の分子および生化学的分析のために選択することができます。

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結果

図1Aは、SILAC標識手順21を概説するフローチャートです。エキソソームを精製するために、サンプルは、遠心分離器を経由してスピンダウンする必要があります。 図1Bは、シリアル超遠心分離21によってエキソソーム精製のステップを示しています。精製した後の手順で概説されるように、エキソソームは、実験的なプロテオーム解析の対象となっています。

図2Aは、プロテオミクスデータ21からの有意なタンパク質候補を決定するためのフローチャートです。選択された候補は次に下流のプロテオミクス分析のために使用されています。 図2Bは、SILACヒストグラムの例は、（この図では、Li ら<...

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ディスカッション

このホワイトペーパーで説明する手順では、ホストエキソソームプロテオーム上のHIV-1感染の影響を調査するためにSILAC技術の適用を実証しました。最初に、未感染およびHIV-1感染細胞を示差同位体標識されています。差別的に標識されたエキソソームは、その後、タンパク質抽出を行う前に精製されます。次に、液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析は、エキソソームのプロテオームを分析するために使用されます。最後に、得られた質量分析データ及び潜在的な候補タンパク質は、下流の生化学的解離の前に解析統計的及びバイオインフォマティクスに供されます。

プロトコル全体での重要なステップは、最適化された結果を達成するために続いする必要があります。プロトコルの初期段階では、SILAC標識は、細胞型及びラベリング媒体によって影響を受ける可能性があります。健康的かつ高増殖性細胞が高い標識効率を得るために使用されるべきです。批判的に、ラベリングメートルediumを新たに透析ウシ胎児血清（FBS）のではなく、通常のFBSを用いて調製されるべきです。透析したFBSは、アミノ酸およびペプチドの枯渇し、従って、SIL...

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開示事項

著者らは利益相反は宣言していない。

謝辞

この作品は、BRに寿命/タフツ/ブラウンCFAR、P30AI042853-13S1、NIH P20GM103421、P01AA019072、R01HD072693、およびK24HD080539にARRAサプリメントによってサポートされていました。この作品は、また、寿命パイロット研究基金（＃701- 5857）、ロードアイランド州財団医学研究助成（＃20133969）、およびMLへNIH COBRE URI / RIHパイロット研究助成（P20GM104317）によってサポートされていました。私たちは、原稿や図形に関するお手伝いのためにジェームズ未開のとVyのダンに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
H9細胞株ATCCHTB-176
Trypan BlueThermo Fisher15250061
MTT assay kitThermo FisherV13154
透析ウシ胎児血清 (FBS)Thermo Fisher26400044
SILAC Protein Quantitation Kit –RPMI 1640サーモフィッシャー89982DMEM バージョン (89983)
L-アルギニン-HCl、13C6、15>N4サーモフィッシャー88434
L-リジン-2HCl、13C6 SILACモフィッシャー88431
HIV-1 NL4-3NIH エイズ 試薬プログラム用2480
Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kitPerkinElmerNEK050001KT
冷蔵超高速遠心分離機Eppendorf22628045
冷蔵超遠心分離機Beckman Coulter363118100,000 x g
50 mL 円錐形遠心分離管Thermo Fisher14-432-22
超遠心チューブベックマン・コールター326823
SW 32 Ti ローターベックマン・コールター369694
RIPA バッファーサーモフィッシャー89900
プロテアーゼ阻害剤カクテルサーモフィッシャー 78430
サーモミキサー エッペンドルフ5384000020
BCAタンパク質アッセイキット サーモフィッシャー23250
分光光度計Biorad1702525
SDS PAGEゲル装置サーモフィッシャーEI0001
Novex 4-20%トリスグリシンミニゲルNovexXV04200PK20
ゲル染色試薬Sigma AldrichG1041
ケンシンググレード修飾トリプシンPromegaV5111
SpeedVac濃縮器サーモフィッシャーSPD131DDA
ヒトアネキシンに対する抗体 A5Abcamab14196
ヒト乳酸デヒドロゲナーゼB鎖に対する抗体Abcamab53292
グラフ作成および統計ソフトウェアSystat シグマプロット またはGraphPadプリズム
定量的プロテオミクスソフトウェアスイートマックスプランク生化学研究所Maxquant 
ソフトウェアとデータベースさまざまなベンダー詳細については、本文を参照してください
サーシー

参考文献

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