に神経変性を定量化するために、マス組織学<em&gt;ショウジョウバエ</em

サマリー

ショウジョウバエは広く神経変性を研究するためのモデル系として使用されます。このプロトコルは、脳内の空胞の形成によって決定されるように、定量化可能な変性方法を記載しています。それはまた、一つのサンプルとして処理し、切片化対照および実験ハエによる実験手順に影響を最小限に抑えることができます。

要約

アルツハイマー病（AD）またはパーキンソン病（PD）などの進行性神経変性疾患は、世界中のヒトの健康に増加脅威です。哺乳動物のモデルは病原性の基礎となるメカニズムに重要な洞察を提供してきたが、一緒に高コストの哺乳動物系の複雑さは、その使用を制限しています。したがって、シンプルだが十分に確立されたショウジョウバエモデル・システムは、これらの疾患に影響される分子経路を調査するための代替手段を提供します。行動障害のほか、神経変性疾患は、神経細胞死と軸索障害などの組織学的表現型によって特徴付けられます。神経変性を定量化するために、それが遺伝的要因と環境要因によって影響される方法を決定するために、我々は大人のハエの脳内の空胞を測定することに基づいている組織学的アプローチを使用しています。系統誤差の影響を最小限に抑えるために、直接制御とEXPからの切片を比較します1つの製剤でerimentalハエは、我々はパラフィン切片のための「カラー」メソッドを使用します。神経変性は、その後、ハエの脳に開発した空胞のサイズ及び/又は数を測定することによって評価されます。これは、いずれかの特定の関心領域に焦点を合わせることによって、または完全長に及ぶ連続切片を得ることにより脳全体を分析することによって行うことができます。通常の老化時に起こるようなので、この方法は、1が厳しい変性だけでなく、いくつかのセクションにのみ検出され、比較的穏やかな表現型だけでなく、を測定することができます。

概要

平均余命の増加に伴い、アルツハイマー病やパーキンソンなどの神経変性疾患は、一般人口の増大する健康への脅威となっています。国立衛生研究所によると、115万人が世界中で、基礎となる重要な進歩は、それらの多くは、これらの疾患のうちの少なくともいくつかに関与する遺伝子および危険因子を同定することにしたが2050年に認知症により影響を受けると予測されます分子メカニズムはまだ不明かよく理解しています。

線虫（Caenorhabditis elegans）およびキイロショウジョウバエのような単純な無脊椎動物のモデル生物は、短いライフサイクル、子孫の数が多いと、十分に確立し、時にはユニークな遺伝的および分子的方法^1の可用性を含む神経変性疾患のメカニズムを研究するための実験種々の利点を提供しています^-12。さらに、これらの生物は、公平に適しています神経変性の表現型に対するそれらの悪化または改善効果によって、これらの疾患の要因を特定することができる相互作用の画面。

そのような遺伝的相互作用を分析し、高齢化の影響を評価することは神経変性を検出するために、その重症度を測定するための定量的なプロトコルが必要です。数値性能値^{13から21を}提供するような嗅覚学習、負の走地性、または高速走光性ショウジョウバエにおける行動の側面を、測....

プロトコル

1.首輪にヘッドを固定し、パラフィンに埋め込み

注：固定プロセスの手順はすべて、ドラフト内で行う必要があります。安息香酸メチルは、健康上のリスクをもたらすものではないが、ドラフト内で処理されない場合は圧倒的なことができ非常に明確な臭気を持っています。

1. ハエを麻酔する前に、（クロロホルム及び酢酸を混在させないでください）99％エタノール30 mLに氷酢酸のクロロホルム5mLを15mLのを追加することにより、カルノア液の50ミリリットルを構成しています。カラーは平らでき、完全に解決策で覆われていることを確実にするために、このようなcrystalizing皿のように、平らな底部を有するガラス容器にそれを注ぎます。
2. CO ₂またはエーテルでハエを麻酔。
3. スレッドは、ピンセットを用いてカラーに首によって（ほとんどの襟付き20まで）飛びます。 図1Aに見られるように、同じ方向に頭の全てを合わせ、損傷が頭や目に発生しないことを確実にするために穏やかであることを忘れないでください。
4. ハエの順序を容易セクションで識別できるように、ランダムな位置での正弦oculisハエ （矢印、 図1A）を含みます。また、場合実験ハエが十分な顔料は、スライドを染色するために存在することを確認するために、それらの間のような野生型のようないくつかの赤い目ハエを、スレッド、光や....

結果

全体フライヘッドを包含する眼の色素³³によって染色された連続切片で説明した方法の結果を使用。この部分は、個々のヘッドのセクションが上から下に表示され、図1Bに示されています。別のハエのセクションは、この例では左から右に見られます。配向およびハエの識別を容易にする、アイレスフライ（正弦oculis）が 3位（矢印、 図1B）におけるマーカーとして挿入されています。

神経変性を定量するために、我々は、これらのセクションで検出することができる小胞の形成を測定します。液胞は、ラウンドのように定義され、緑色蛍光神経網内（ 図2の矢頭および3）であるか、または皮質とダークスポットは、ハエの脳の少なくとも2個の連続セクションに表示されます。によって神経変性を定量化測定液胞は、いずれの特定の脳領.......

ディスカッション

記載された方法は、 ショウジョウバエの脳における神経変性を定量化する手段を提供します。他の方法は、特定の細胞型を計数するように、神経変性を同定するために使用することができるが、この方法の利点は、より一般的に適用できることです。細胞を計数することは、これらの細胞が確実に特異的な抗体や、常に利用可能でない細胞特異的マーカーの発現、のいずれかを用いて同定することができることが必要です。さらに、劇的に異なる結果がおそらく標識および検出のために使用される条件に、その方法²⁴を用いて得られることが示されています。変性細胞を検出するための別の方法は、抗活性化カスパーゼ3のような細胞死マーカーの使用は、しかし、これは、積極的に細胞死を受けている細胞を特定していない細胞が死亡していると、それらはもはや検出可能です。ここで提案した方法の別の利点は、染色が原因でautofluに必要とされないことです時間を節約し、染色条件の変化に起因するアーチファクトを最小限に目顔料によって引き起こさorescence。この方法を使用する場合に、ハエの目のスライドを染色するのに十分な顔料を有することに留意することが重要です。目の色が薄す.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬/機器の名前		会社カタログ番号
カラー	Genesee Scientific	TS 48-100	私たちは、ジェネシーのもののように層ではなく、1つの金属片から作られたカスタムメイドのカラーを使用しています。首輪の作り方の説明は http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html  にあります。
埋め込み用ゴム製角氷トレイ	家庭用店		サイズは、追加の壁に接着することでフィットさせることができます
結晶化皿	フィッシャー・サイエンティフィック社	08-762-3
エーテル	フィッシャー・サイエンティフィック社	E138-1
エタノール	デコンラボラトリーズ社	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
氷酢酸	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	独特の臭い - ヒュームフードに使用!
低融点パラフィンワックス	フィッシャーサイエンティフィック	カンパニーT565	65°Cで余分な溶融を保つようにしてください。C ウォーターバス
ミクロトーム	ライカ バイオシステムズ	ライヒェルト ユング 2040 オートカット
顕微鏡 スライド	フィッシャー サイエンティフィック カンパニー	12-550D
顕微鏡カバー ガラス	フィッシャー サイエンティフィック カンパニー	12-545-M
セーフクリア	フィッシャー サイエンティフィック カンパニー	314-629	3 つの異なる容器 ウォッシュ用
垂直染色ジャーTed	Pella Inc.の表紙	432-1
パーマウント	フィッシャー サイエンティフィック	SP15-500
ポリ-L-リジン溶液 (PLL)	シグマ ライフサイエンス	P8290-500