表面パッド心電図を使用したマウスにおける心筋虚血および再灌流障害の確認

サマリー

マウスの心筋虚血/再灌流手術中、閉塞結紮の正しい配置は、通常、心筋蒼白の目に見える観察によって確認されます。本明細書では、観察された心筋蒼白を補うために、虚血および再灌流を心電図で確認する方法が、雄のC57Bl/6マウスにおいて実証される。

要約

多くの動物モデルが、世界中の死亡原因のナンバーワンとしての地位のために、心筋リモデリングと心不全の研究のために確立されています。ヒトでは、冠状動脈に病理学的閉塞が形成され、その閉塞した動脈の再灌流は、リスクのある心筋の生存能力を維持するために不可欠であると考えられています。心筋の回復には不可欠ですが、虚血性心筋の再灌流はそれ自体で組織損傷を引き起こします。虚血/再灌流障害の生理学的反応と治癒は、慢性閉塞損傷とは異なります。心筋虚血/再灌流障害は、心筋梗塞研究の臨床的に重要なモデルとして認識されつつあります。このため、虚血/再灌流の並行動物モデルは、心筋損傷に関する知識ベースを前進させる上で不可欠です。典型的には、左前下行(LAD)冠状動脈閉塞後のマウス心臓の虚血は、閉塞(結紮)の下の心筋の目に見える蒼白によって確認されます。ただし、これは、異なる心筋領域に蒼白を引き起こす可能性のある複数の主要な動脈があるため、正しいまたは一貫した結紮糸の配置を確認する主観的な方法を提供するだけです。正しい結紮位置とその結果生じる虚血、および再灌流を評価するために心電図の変化を記録する方法は、観察された心筋蒼白を補うために、マウスモデルで一貫した梗塞サイズをもたらすのに役立ちます。これにより、使用するマウスの数を減らすことができます。さらに、心電図の変化は、手術後も時間依存的に非侵襲的に記録し続けることができます。この記事では、心筋虚血と再灌流をリアルタイムで心電図で確認する方法を紹介します。

概要

心臓病は、世界中の死^1,2の主要な原因のまま。だけでなく、それは一般的な心臓の損傷部位心筋梗塞後⁴体全体³に、心臓から血液をポンピングする責任左心室（LV）ほとんどの筋肉室、です。左心室組織死は、多くの場合、収縮期心不全になります。心臓病の動物モデルは、生物医学、心血管研究の発展のために不可欠です。マウスのC57BL / 6系統は、その迅速な繁殖時間、低コストのために、動物モデルのための普及した選択されていると遺伝的変化に容易にしています。心臓病の研究のためのほとんどのマウスの外科的モデルは左冠動脈のLAD枝の閉塞を伴います。 LADは左鈍角限界^5,6と呼ばれることもあります。 LADは、左心室の前部と前外側の壁に血液を供給する。 LAD閉塞の研究は、時々、前部梗塞を誘発int型を拡張することを目的としています劣ると側壁領域⁷ O。

心筋梗塞の研究のために頻繁に使用される2つのモデルは、慢性閉塞心筋梗塞や心筋虚血/再灌流傷害を含みます。慢性閉塞は、外科的にLADを通る血流をブロックの周りに、永久に縫合することによって作成されます。虚血/再灌流障害にのみ過渡、通常は30〜60分間、虚血期間と同じように多くを作成されます。一過性虚血を達成するために、再灌流期間が続く心臓の心外膜表面上のLADに対して平行に配置されているLAD周囲に閉塞縫合関係と小さなPE-10管は、管と閉塞縫合糸を除去し、血液がある場合再び動脈を通って心筋内に流入させます。虚血/再灌流手術が原因PROMを含む、ヒト梗塞の治療を並列再灌流傷害の性質に臨床的に関連するとみなされていますptの冠動脈血管形成術およびステント留置動脈の、または冠動脈バイパス。一般的に、これらの手術中に、マウス心臓におけるLVの虚血は、心筋壁の可視蒼白によって確認されました。しかし、単純に常時監視条件下心電図（ECG）パッド上に手術を行うことによって、目に見える変化は、それによってマウス心筋の虚血および再灌流を確認し、ECG波形を観察することができます。

マウスの心臓は、その4つのチャンバー構造を含む多くの点で人間の心に似ていますが、心にも違いがあります。成人のそれに対し、分（BPM）あたり700拍れる〜60-100 BPMの^8,9 - 1つの明らかな違いは、成体マウスの平均安静時の心拍数は600です。さらに、マウス再分極波のように、JおよびTは、多くの場合、脱分極のQRS群^10を識別する明確なSTセグメントを困難と合併します。 electrocardiographicallのプロセスを複雑にするには心筋虚血を確認yが、それは臨床的にSTのE levation mのiが nfarction yocardialまたはSTEMIと呼ばれるヒトにおける虚血および心筋梗塞傷害の診断のためのマーカーとして使用されるT波およびSTセグメントの上昇です。ヒトおよびマウスの波形間の主な違いの一つは、S波がすぐに陰性T波に直接転送J-波で続いているです。マウスにおける急性心筋虚血中にS波の振幅が減少し、直接異常J波と逆T波¹¹が続きます。 T波は、マウス¹¹で再分極のかなりの部分を占めるようには見えません。人間の違い対命名法およびマウスにもかかわらず、マウスの心筋虚血および再灌流のECG確認はまだ実現可能と比較的簡単です。波形の解釈を簡単にするために、SJT間のセグメントは、ST-segmeと呼ばれntは、本明細書。

2013年に公開されたSTEMIガイドライン未満90分¹² .Thisの患者ドア・ツー・バルーンの時間をお勧め動脈が再び開かれるまで、患者の冠状動脈閉塞の識別からその時間枠を意味未満90分でなければなりません。鼓動する心臓が常に働いているので、高い酸化代謝および酸素消費³の高いレベルを有しています。これを提供するために、毛細血管のネットワークは、各筋細胞³に提供されています。それは酸素と栄養の供給を排気するために数拍の心を取るだけ。 90分ウィンドウでは、ヒトにおける虚血性心臓領域は、酸素を豊富に含む血液の価値は5400と9000心拍の間に受信することからブロックされています。その同じ90分ウィンドウで、マウスが54,000 63,000に心拍を持っているでしょう。マウス虚血/再灌流傷害の実験時間点は30〜60分の間、典型的です。

開発の重要性マウスモデルにおいて心筋虚血および再灌流を確認する補足的な方法をると、心筋虚血/再灌流研究におけるデータの一貫性と再現性に重大な意味を持っています。視覚的に組織の色の変化のために心を観察する現在の慣行は、スタンドアロン診断として適切ではありません。さらに、チューブおよび縫合糸を除去した後の再灌流は保証されません。動脈がもはやオフに接続されていますが、動脈は、手順の間に被害を受けなかったかもしれないし、再灌流が不可能になる場合があります。むしろ心筋蒼白と発赤（赤色）の観測に頼るよりも、再灌流を確認するために心電図の変化の記録を持っていることが有益であろう。虚血/再灌流傷害のマーカーが表示されませんハーツは、その後すぐにフラグを立てることができ、続行する方法についての決定は、研究者によって作製することができます。

最後に、心電図の記録を確立することは目を通してベースラインからの変化します虚血性および再灌流期間eは研究者は、最初の手術後の心臓の監視を継続することができます。研究者らは現在、すぐに手術が完了すると、心臓の視力を失います。 ECGは、手術後の日に心筋の時間に起こる変化への洞察を得るための簡単な方法です。手術後の時点で記録されたECGは、継続を示すか、組織死を悪化後期開発Q波を開示する可能性があります。しかし、効果的に新規または悪化心電図マーカーをゲージには、ベースラインECGは、比較のために利用可能でなければなりません。

12週齢の雄のC57BL / 6マウス - このプロトコルは、準備取得、および8を使用して、マウスの心臓の虚血および再灌流を確認するために、ECGを解釈する方法について説明します。

プロトコル

動物で実行されたすべての外科的処置は、管理と使用実験動物の¹³または他の適切な倫理ガイドラインのためのガイドに従って行われるべきです。プロトコルは、先に進む前に、適切な機関で動物福祉委員会によって承認されなければなりません。

1. ECGの準備

注：開始する前に、手袋、眼鏡、きれいな白衣や使い捨てガウンを含む個人用保護具を着用。

1. 非アルコールおよび非漂白剤ベースの除染液を使用して、ECGパッドを清掃してください。優しく繊細なタスクを使用した電極パッドが破損しないことを確実にするために過剰の溶液をオフにブロットするワイプ。
2. ECGパッドが加熱機能を持っている場合は、それを使用しています。麻酔したマウスは急速に体の熱を失う傾向があります。手術¹⁴を通じて37℃の正常体温体温を維持するために、40〜42℃にパッドを加熱します。体の気性を監視します直腸温度計を使用してature。体温〜37℃を維持するために、必要に応じてパッド温度を調整します。
3. 最もthoracotomiesは、マウスがそのバック（仰臥位）の上に横たわるを用いて行われるように、トグルは「仰向け」設定に反転していることを確認します。多くのECGパッドが発生しやすいと仰臥位の位置の間で切り替える機能を持っています。右の向きを選択しないと、心電図のイベントの不実表示をもたらすことができます。
4. 5％吸入イソフルランおよび1リットル/分の酸素を用いてマウスを麻酔。マウスを麻酔されると、ECGパッドへの転送マウスは、麻酔ノーズコーンを搭載し、2％および1リットル/分の酸素にイソフルランを減らします。マウスの足をピンセットで挟まれたときにマウスが反応しない保証することによって、適切な麻酔を確認してください。
5. 麻酔をかけながら乾燥や角膜の損傷を防止するために、マウスの目の上に目の潤滑軟膏の薄いコートを適用します。
6. すべての可視寝具を除去するためのウェットワイプでマウスの足をきれいにしてくださいそれは足に貼り付けてもよいし、ECGパッドに足からの電気インパルスの伝達を妨害することができます。ワイプとドライ足。
7. ECGパッド上の4つの金属電極のそれぞれに高導電性電解質ゲルの（米ドルダイムより若干小さい）少量を適用します。
   注：あまりにも多くのゲルは、それが困難なテープを使用してパッドに足を抑制することが可能になるようにのみ少量のゲルを適用するようにしてください。さらに、足は、彼らがテープを適用する前に湿った場合は、手術中に拘束から抜け出す可能性があります。
8. 仰臥位でマウスを使用すると、それに対応する電極（ 図1）に各足を拘束する明確な医療用テープを使用します。最初のテープのその片に各足を押し、ECGパッドにテープを接着。各拘束足が電解質ゲルと電極と接触していることを確認してください。

2. ECGを取得

1. ECG取得、confのために使用される機器に応じて、機械igure ECG波形をリアルタイムで可視化することができるようになっています。心エコー検査のマシン上の生理学的監視設定を使用して、心電図記録のために、ライブBモード画像は、画面の下部に沿って実行されているECG波形を持つことになります。
   注意：最高のその機器を構成する方法を決定するために、個々のマシンのユーザーガイドを参照してください。
2. 心エコー検査機や他のECG記録デバイス上同等にBモードキーを押して、ECG波形のリアルタイム可視化を有効にします。
   1. 振幅の違いを考慮して、解像度を調整します。 Q波のR波またはトラフ（谷）のピークは視覚フレームの外にある場合は、波形の全体の高さを観測することができるまで、解像度を調整します。
      注：これは、心エコー検査機に生理設定]タブの下で行うことができます。波形全体が表示されるまで増減の矢印をクリックします。
3. 画像はOBTされるべき任意の時間ained、ツールのECGパッドをオフにします。鉗子や指でECG記録時にマウスをタッチすると、波形を乱すます。マウスは、任意の心電図を記録する前に、ECGパッドの上に静止画および手つかずであることを確認してください。
4. マウス上の任意の外科的切開を行う前に、マシンの「記録」または「ストア」機能を使用します。この画像は、後の比較のためのベースラインとして使用されます。

3.外科的手順と記録ECG

1. 開始する前に、鎮痛剤（ブプレノルフィン、1.5μgの、腹腔内）で麻酔したマウスを注入します。虚血/再灌流手術手順の詳細は、他の場所⁵見出すことができます。
2. 化学的または機械的に手術部位の周りの毛を削除し、ベータダイン溶液でエリアを消毒。食道と気管に垂直切開を平行にするためにメスを使用してください。気管を覆う薄い組織になるまで穏やかに切開部の各側にリンパ節に移動します露出しました。気管の白い軟骨リングが表示されるまで鉗子を使用して、静かに組織を分離します。
   注：私たちは、一般的にNairさんの脱毛ローションを使用しています。ローションは、約1分間の手術部位に適用されます。 Nairさんはその後、徹底的に生理食塩水または水を用いて洗い流します。 （毛包を検出することができる）、高分解能心エコー検査は、手術の前および後に行われるので、この方法は、我々の研究室で好ましいです。しかし、注意は、性器などの敏感な部分を避けるように注意する必要があり、その後、徹底的に潜在的な皮膚の火傷を避けるために、Nairさんを洗浄します。
3. 迅速ノーズコーンからマウスの鼻を削除して、マウスのと喉に向かって口の中に換気チューブを挿入します。換気チューブの先端が露出した首のエリアを介して表示されている場合には、気管の開始とチューブの位置を合わせます。視覚トンに確認することができる気管にチューブをスライドするまで、上向きの圧力をかけながらゆっくりと左右にチューブ側を小刻み半透明の気管hrough。
4. マウスが挿管処置の間に麻酔をかけたままであることを確認してください。挿管から一時停止し、攪拌を開始した場合にノーズコーンにマウスを返します。
5. 文字列のループを使用して、ループを介してマウスの2前歯をフックし、文字列がマウスの頭部を安定させ、手術中に動かない換気チューブを確実にするために、ECGパッドに終了テープで固定します。迅速げっ歯類換気装置に換気チューブを接続し、マウスの体重に応じて換気設定を調整します。代わりにテープ換気チューブ。
6. 乾燥から組織を維持するために温かい生理食塩水に浸したガーゼでマウスの露出した気管をカバーしています。
7. 胸骨の左側に沿ってメスを用いて縦切開を行います。
8. 鉗子を使用して、静かに筋肉層から筋膜層を分離します。慎重に目に見える血管を切断することなく、基礎となる筋肉層を切ります。
9. 鉗子を使用して、第三リブとプルをつかみます上向きにやさしく。片手で肋骨のグリップを維持し、慎重に第三及び第四肋骨の間の肋間組織を切断する手術用はさみを使用しています。肺が損傷していないことを確認してください。
   注：肺が原因で圧力勾配の損失にほとんどすぐに胸腔を外科的切開によって穿刺された後、深い胸の空洞内に収納されます。肺は続行する前に退避するまで待ちます。
10. つかみ、静かに心を囲む心膜の薄層を分離するために鉗子を使用してください。
11. 開創器を挿入するか、手動で心臓が肋骨の間見える位置にリブを移動するために、リブリトラクタとして鉗子を使用しています。
    注：合字の配置中に右下の足をオーバーラップされるように、マウスの左下の足を移動するのが一般的です。これは、左心耳、または耳介は、合字の配置中に容易に見えるように心を配置するのに役立ちます。有効なECGワットがあることに注意してください左下の足は、電極から離れている間aveformsが得られません。この理由は、縫合結紮糸が心筋組織を通ったが結び目が締め付けられる前に渡された後、その電極に足を戻すことをお勧めします。
12. 左心耳の下に、視覚的にLADを探します。迅速LADの下を通過するのに十分深くなく、LVの空洞を貫通するように深くない心筋に7-0絹テーパー状縫合針を挿入します。縫合結紮の自由（非針）最後に残された縫合絹の約4cmがあるまでを通して縫合結紮糸を引き出します。
13. 単純な縫合糸の結び目を結ぶために開始します。縫合絹糸の自由端は結び目を形成するループを通して引っ張られた後、一時停止。
14. 鉗子で縫合絹の自由と針の両端を持ち、形成結び目の下と心外膜表面の上にPE-10チューブの〜1cmのセクションを挿入します。
15. マウスの左足を交差されている場合は、そのプロに足を戻します電極あたり。 PE-10チューブは心臓に縫合されるように結び目を締めます。心電図を記録できるようにするために、マウスを持つすべての物理的接触をリリース。
16. 〜10秒間を順番にECG波形を許可します。 「オクルージョンの時間」として視覚的にECG波形と記録波形を確認してください。 T波が1分以内に振幅が増加しない場合、合字の配置を見直します。
    1. T波の振幅が増加し、いずれの試験から動物を捨てるか、合字の配置を修正しようとしていない場合。
17. 視覚LVの虚血性杭を確認するために、心筋の色を確認してください。
18. ECG変化と心筋の色の変化は、虚血、ダブルノットPE-10チューブの周りに縫合糸を示している場合。
19. 温かい生理食塩水ガーゼでオープン胸腔をカバーしています。
20. 録音ECG虚血期間の期間ごとに5〜10分。

ECGを使用した再灌流の4確認

1. 生理食塩水ガーゼ入り江を削除します胸腔を鳴らすと心を視覚化します。
2. PE-10チューブの上に縫合シルクをカットする刃を使用してください。結紮糸が切断されると、PE-10チューブの部分を削除して、静かに心筋から縫合結紮を削除します。
3. マウスを使って、すべての物理的接触を解除し、サイクルにECG波形〜10秒を可能にします。記録波形」再灌流の時間。」希望の実験時間点に到達するまでのECG波形ごとに5〜10分を記録し続けます。
4. 必要に応じて振幅の変化の解像度を調整します。 T波は、PE-10管結紮の除去時に変更されない場合は、再灌流が確認されていません。
   1. T波はチューブの除去の際に変更するには、研究から動物を捨てるか、合字の配置を修正しようとしていない場合。
5. 視覚さらに赤色への復帰によって再灌流を確認するために心筋を検査します。
6. 5-0で肋間スペースを縫合することによって閉じる胸腔絹縫合手術中に入った過剰空気を排出するためにマウスの胸に穏やかな圧力をかけながら。そして、筋肉層、そして最後に、皮膚を縫合。注：胸腔に圧力を適用すると、全てのマウスにおいて、空気の胸腔を排出するのに十分ではないかもしれません。このため、避難の注射器と針の方法は、すべての空気が追放されたことを確認するために使用すべきです。
7. 吸入麻酔をオフにし、電極からマウスの足を削除する前に、最後のECGを記録します。 2 L / minに酸素を増加させ、マウスが意識を取り戻すまで、換気を維持します。
8. マウスは梗塞の変動を回避するために、一定の温度制御された環境で例えば加熱パッドまたは暖かいインキュベーターを回復することを可能にします。マウスしかめっ面スケールによって示されるように、必要に応じて、その後、手術後ブプレノルフィン24時間でマウスを治療し。
   注：再灌流のための手順は、Xu らにより詳細に検討されている^5。

結果

正常マウスのECGは、電気イベントP、Q、R、S、JおよびT. Pためのアルファベットマーカーと、図2に表示され、初期の心房脱分極です。 QRSは心室を超える脱分極の波です。 Jは、早期再分極であり、Tは、リカバリ¹¹として知られている異種の再分極を表します。多くのラボはJ波の命名法を使用し、代わりにSTセグメント^10,15-17としてSJT-セグメントを参照していないことに留意すべきです。ここでは、結果および分析は、代表と40匹のマウスの実験室での観察のオフに基づいています。ほとんどのマウスは、手術の過程で同様の波形の進行を示しました。同様の波形を示さなかったマウスを、さらなる分析のためにフラグが設定され、非梗塞動物と考えられました。類似波形の結果はまた、ジョンら ¹⁵により報告されています。

マウスの心のsuLAD閉塞に局所虚血から...

ディスカッション

心筋虚血および再灌流を確認するための補助的な方法として、ECG変化を使用すると、閉塞リガチャーの正確な配置を保証します。合字配置の精度は、動物間のデータのばらつきを低減させるために重要です。マウス心臓におけるLADは、視覚化することが困難な動脈です。したがって、心電図変化に視覚蒼白を補充する結紮の正確な配置を確保し、組織損傷を生じるであろう。

ECGパッドは、心臓の非侵襲的なビューを提供していますので、複数のECGは、研究の過程で取得することができます。これは、中および手術後に起こる心臓の変化のより良い理解を提供するのに役立ちます。外科手術後の比較のために使用するベースラインECGを得るために重要です。後段組織死、さらに心室瘤は、電気生理学的信号のたわみ及びECG構成の変更により観察することができます。これは、洞察力を提供することができます心不全の進行に。

心エコー検査機を用いてECGを測定することの利点は、前または虚血/再灌流手術後の心臓の構造的および機能的パラメータの同時測定を含みます。レコードECGに対するシステムの制...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Vevo 1100	Fujifilm Visual Sonics		心エコー検査機
マウスハンドリングプレート	Fujifilm Visual Sonics		加熱心電図プレート
Signa-Gel			高導電性多
電極ゲル	パー	カー15-25	目的電解質
トランスポア医療テープ	3M	1527-0
PI-スプレーII	医薬品イノベーション	NDC 36-2013-25	電図プレート用洗浄剤
C57Bl6マウス	ジャクソン研究所	000664	男性、8〜12週間
IsoThesia-Isoflurane	ヘンリー・シャイン	NDC 1169-0500-1
Excel	マイクロソフト
シスタン 夜間潤滑剤 眼軟膏	アルコン	65050935
7-0 パーマハンド シルク縫合糸	エチコン	640.O32
5-0 パーマハンド シルク縫合	エチコン	K809.O32
外科用ハサミ	ROBOZ	RS-5881
鉗子	ファインサイエンスツール	11052-10
ガーゼ	バイオ核診断株式会社	DIS-022B
ニードルホルダー	ファインサイエンスツール	12565-14
ブプレネックスCIII	パターソン獣医	0-891-9756	ブプレノルフィン塩酸塩鎮痛薬
Betadine	Purdue製品	67618-150-08
Nair	Church and Dwight Co.	NRSL-22339-05

心