腎間のステロイド合成組織とゼブラフィッシュにおけるその血管微小環境の可視化

Summary

ゼブラフィッシュにおける間腎腺は、哺乳動物の副腎の硬骨魚類の対応です。酵素活性アッセイ、開発ゼブラフィッシュでは、分化ステロイド産生細胞を検出し、このプロトコルは、3-βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ^{（3β-HSDΔ5-4イソ}メラーゼ）を実行する方法を紹介します。

Abstract

このプロトコルは、シンプルなホールマウント酵素活性アッセイを通じて分化した腎間ステロイド産生細胞を検出する方法を紹介します。3-β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ/^Δ5-4イソメラーゼ(3β-Hsd)活性陽性細胞の発色組織化学染色を通じて分化したステロイド産生組織を同定することは、哺乳類および魚類の副腎皮質組織の形態および分化をそれぞれモニタリングするために重要です。ゼブラフィッシュモデルでは、発生中の胚と幼生の光学的透明性と組織透過性により、3β-Hsd活性のホールマウント染色が可能になります。この染色プロトコルは、発生中の前腎細胞および内皮細胞をマーキングするトランスジェニック蛍光レポーターラインで実施され、腎臓および隣接する血管系に加えてステロイド産生腎間組織の検出を可能にします。ビブラトーム切片作製、免疫組織化学、共焦点顕微鏡と組み合わせることで、腎間ステロイド産生組織の血管微小環境を可視化し、アッセイすることができます。3β-Hsd活性アッセイは、ゼブラフィッシュの腎間腺の細胞生物学を研究するために不可欠です。なぜなら、これまでゼブラフィッシュのステロイド産生細胞を標識するための適切な抗体は存在しなかったからです。さらに、このアッセイは迅速かつ簡便であるため、副腎(腎臓間)遺伝性疾患を標的とする変異体スクリーニングや、医薬品または毒物学的研究におけるステロイド産生に対する化学物質の破壊効果を決定するための強力なツールを提供します。

Introduction

副腎、視床下部 - 下垂体 - 副腎軸の重要な要素は、ステロイドを分泌し、ステロイドの恒常性とストレスに対する身体の応答を調整します。副腎は、カテコールアミンを合成するゾーン特異的にステロイドを分泌する外皮質、および内側髄質を含みます。硬骨魚で間腎腺はそれぞれ^1-3、哺乳動物における副腎のカウンターパートであり、副腎皮質と髄質の機能的等価物であるステロイド産生腎間の及びクロム親和性細胞から構成されています。ゼブラフィッシュモデルを使用して行われた研究では、両方のステロイド産生およびクロム親和細胞系統が高哺乳類^1,2のものと似た分子・細胞メカニズムによって形成されていることを報告しています。したがって、ゼブラフィッシュは、遺伝性疾患、神経内分泌制御、および視床下部 - 下垂体 - 副腎（腎間の）軸のシステム生物学を研究するための潜在的に強力なモデルです。

、3β-HSDはプレグネノロン、17α-hydroxypregneloloneから17αヒドロキシプロゲステロン、およびデヒドロエピアンドロステロン^4,5からのアンドロステンジオンからのプロゲステロンの変換を触媒します。 3β-HSDは、ホルモン、ステロイド、すなわちプロゲステロン、グルココルチコイド、ミネ、アンドロゲン、およびエストロゲンのすべてのクラスを生合成するために不可欠です。 2つのヒト3β-HSDはHSD3B1とHSD3B2を差動^6を発現しているアイソザイム。 HSD3B2の副腎皮質および生殖腺で発現されるのに対し、HSD3B1は、胎盤および末梢組織で発現されます。人間HSD3B1とHSD3B2は間腎組織および成体の生殖腺で発現されるゼブラフィッシュhsd3b1の共同オルソログです。ゼブラフィッシュhsd3b2は、その転写産物器官⁷の前に姿を消す母性発現する遺伝子です。ゼブラフィッシュのための全マウント3β-HSD酵素活性アッセイのプロトコルは、レヴィの方法を変更することによって開発されましたミラノらによって記載さsの。 、8硬骨魚種⁸の凍結切片上。そのため組織透過性と開発ゼブラフィッシュの光透過性の、ホールマウント3β-HSDの組織化学が正常に固定ゼブラフィッシュの胚および幼生のために使用され、特に区別腎間の組織を描写することができます。

この高感度かつ迅速なアッセイは、腎間の異常形態の異なる種類を実証する種々の変異体とモルファントに適用されています。腎間の3β-HSD活性は間腎組織の仕様はFf1b転写因子の特異的ノックダウンを介して破壊されると腎間の分化がFf1bの補調節因子PROX1 ^9,10のノックダウンによって影響されるように減少した胚には存在しません。特に、3β-HSD活性は、以下のような片目のピンヘッド 、重度の早期欠陥を有する変異体で検出することができ、どこ3β-H、 目を細めSD組織化学は、腎間の細胞遊走が^11をどのように影響されるかを描きます。間腎組織の分化があっても、血液や血管系の完全な不存在下で損なわれることはありません。したがって、内皮由来の信号が整形方法を開発腎間の臓器は^12,13を決定することができます。全体として、この組織化学的アッセイは、正常仕様、分化、およびゼブラフィッシュモデルにおけるステロイド産生細胞の遊走を研究するために使用されています。したがって、効率的かつ副腎および腎間の臓器障害をターゲットに任意の遺伝的または化学スクリーンのための信頼性の高いツールであるべきです。

Protocol

倫理文：ゼブラフィッシュのすべての実験手順は、（。101-12 IRB承認NO）東海大学の施設内動物管理使用委員会によって承認され、承認されたガイドラインに従って実施しました。

3β-HSD酵素活性染色1.株価ソリューション

1. トランスデヒドロ[ジメチルスルホキシド（DMSO）中に10mg / mlの]準備します。
2. β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド水和物（0.1 Mリン酸緩衝液中で1.2 mg / mlで、pHは7.2）を準備します。
3. ニコチンアミド調製（ビタミンB3を、50 mg / mlとでH ₂ O）。
4. 4-ニトロブルーテトラゾリウム（70％ジメチルホルムアミド中に50mg / ml）を準備します。
5. -20℃でマイクロチューブとストアに小分けし、これらすべてのコンポーネント。
   注：我々の経験では、上記の全てのソリューションのアリコートの凍結融解の繰り返しは、3β-HSD活性染色の強度に影響を与えません。

2. Wホールマウント3β-HSD活性染色

注：3β-HSD酵素活性が早ければ28時間後に受精（HPF）として培養される場合hsd3b1 ^2,7のmRNA発現の発症と一致している28.5°C、でのゼブラフィッシュの胚で検出可能です。本研究では、全マウント3β-HSD活性染色プロトコルは、前述の方法⁸に基づいており、最大7日後に受精⁹に開発ゼブラフィッシュで成功するために決定されました。 ^{ci5 15：14}であり、Tg（mCherryをkdrl）を ^S843：腎間のステロイド産生組織の血管の微小環境を分析するため、ホールマウント3β-HSD活性染色は、Tgが（EGFP kdrlが）などの内皮特異蛍光を発現するトランスジェニック系統、に適用されなければなりません。ゼブラフィッシュ腎臓の開発を検討腎間のステロイド産生組織を分析するために、3β-HSD活性染色はアプリすることができます^{LI1魚 16、}糸球体と前腎細管の形成が描写されている：Tgは（GFP wt1b）にエド。

1. 色素形成を阻害するために、12および24 HPFの間に段階から、卵の水中の0.03％のフェニルチオ尿素（脱イオン水中の0.06 mg / Lのリーフ塩）でそれらをインキュベートすることにより、開発ゼブラフィッシュを扱います。
2. で一晩、室温（RT）又は（B）の2％PFATで1時間、0.1％のTween 20（PFAT）を補充したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で（A）、4％パラホルムアルデヒド（PFA）でdechorionated胚または幼虫を修正4℃または室温で4時間、続いて4℃で2時間、のために。
   注意：PFAは、吸入、皮膚接触によって有毒です。それは、皮膚、粘膜、目、および上気道に破壊的です。
3. PBSで10分間胚を4倍を洗って、室温で0.1％のTween 20（PBST）を補いました。
   注：これは、洗浄溶液を変えながらサンプルを乾燥させないことが重要です。
4. たて駅を準備反応の前にining溶液（ 表1）。別々のチューブに、準備渦、および遠心分離器の部品AとB。
   注：ストレート1単一のチューブにすべてのコンポーネントを追加すると、重度の沈殿を引き起こすことになります。
5. 、パートBのソリューション全体に部品Aのソリューション全体を追加染色液を調製し、よく混ぜ、すぐに固定し、洗浄した胚を含む各マイクロチューブに1ミリリットルを配布します。
6. 回転子または室温で穏やかに振盪ためのロッキングプラットフォームのいずれかに光と場所からそれらを保護するためにアルミホイルでマイクロチューブを包みます。
7. 経験的には顕微鏡を通して発色性の信号を監視することにより、反応時間を決定します。若干の沈殿は時間をかけて開発します。しかしながら、それらは、反応過程を妨害しません。
   注：胚が4時間25℃で28 HPF、染色に固定するために間腎組織でクリア信号を生成します。
8. PBSTで10分間の4倍を洗浄することによって反応を停止させます。私Fはさらなる免疫組織化学（IHC）分析が必要とされない、後の修正RTで60分間、4％PFATで染色された胚を。それ以外の場合は、さらに使用するまで4℃で洗浄した胚を保存します。
9. 全体のマウント顕微鏡検査のために、染色後固定し、そしてPBS中50％グリセロールで胚を洗浄しクリアし、背側がスライド上に向けて、それらを向けると、明視野照明下で直立顕微鏡を用いて観察します。
   注：推奨される腎間の組織形態の高解像度画像は、3β-HSD活性染色とdeyolked胚の分析をフラットマウントにするには。腎間のステロイド産生組織が右卵黄嚢の上方に位置するように、間腎組織の腹側フラットマウント分析は、腎間の形態¹⁷の直接的かつ明確に観察できます。

3β-HSD活性染色胚の3 IHC分析

注：steroiの血管の微小環境を分析するためにdogenic組織は、トランスジェニック内皮特異的蛍光レポーターとの3β-HSD活性染色胚をビブラトーム切片化し、その後のIHC分析^12,18を横断するために供されます。

1. ポスト固定
   1. 3β-HSD活性染色の後の修正及びPFAは、4℃で1時間、1％トリトンX-100を補った、1％トリトンX-100（PBSTx）を含むPBS中で10分間、4倍の洗浄2％で胚を洗浄RTで。
2. 埋め込み
   1. 4％が95℃、4〜8℃でのマイクロチューブにアリコートし、店舗でPBSでアガロースを溶解させることによって低融点アガロース準備します。
   2. 70℃で10分間、アガロース4％低融点のアリコートを融解し、その後47℃で一定分量を保ちます。各胚を埋め込む溶融4％鋳型として働く1.5mlマイクロチューブの取り外したキャップ内に低融点アガロース、および固体になるまで冷却します。
3. ビブラトームセクショニング
   1. 乾燥Pに紙テープの一部をスティックビブラトームのlatform。
   2. カミソリの刃によって金型から硬化アガロースブロックを削除してください。プラットフォーム上の紙テープに瞬間接着剤を適用し、上向きにサンプルの前方側に、紙テープにアガロースブロックを修正。それぞれ約4ミリメートルと上下ファセットの各側に8ミリメートルで、台形プリズム形状にアガロースブロックをトリム。
   3. スポイトを使用して、0.5％トリトンX-100（0.5％PBSTx）を補充し、冷PBSでサンプルを含むアガロースブロックをすすぎます。
   4. ビブラトームの取扱説明書に従って、100μmの切片にアガロースブロックをスライス。常に乾燥を防ぐために、アガロースブロックをすすぎます。各スライスが切断されると、26 G注射針を使用して、ビブラトームからそれを削除し、冷たい0.5％PBSTx（500μL/ウェル）を含むスポットプレートに移します。
   5. 解剖顕微鏡下で確認することにより、3β-HSD活性の陽性組織切片を収集し、πによってセクションを転送冷たい0.5％PBSTx（150μL/ウェル）を含む96ウェルプレートにその端のカットオフ（開口部で約1ミリメートル、内径）とのpetteチップ。組織試料は、通常、このステップの後、アガロースブロックから解離します。
4. 透過処理と洗浄
   1. 6X RTで0.5％PBSTxで15分間、PBS中で10分間、そしてPBS中で10分間、4倍のスライスを洗浄し、1％ウシ血清アルブミン/ 1％DMSO / 0.1％トリトンX-100（PBDTx）を補充しました。
5. ブロッキング
   1. RTでPBDTx 2％ウシ胎児血清（FCS）中で1時間切片をインキュベートします。
6. 一次抗体反応
   1. 4℃で一次抗体（ 例えば 、ウサギポリクローナル抗ヒトフィブロネクチンおよびマウス抗ヒト焦点接着キナーゼ）を含むPBDTxで1.5日間のスライスをインキュベートします。
7. 洗浄
   1. スライスはRTでPBDTxで10分間、6倍速洗います。
8. ブロッキング
   1. PBで2％FCSで1時間のスライスをインキュベートRTでDTX。
9. 二次抗体反応
   1. 4℃での二次抗体（フルオロフォア結合ヤギ抗ウサギまたは抗マウスIgG）を含むPBDTxで1.5日間切片をインキュベートします。
10. 洗浄
    1. 切片を室温でPBST中で10分間、RTおよび4倍でPBDTxで10分間、6倍洗います。
       注：共焦点顕微鏡分析のために、PBS中50％グリセロールでサンプルをオフにします。

4.共焦点分析

1. 全体のマウント胚および10X / 0.5および20X / 0.75の対物レンズを搭載した共焦点顕微鏡により断面を観察します。
2. 次のように蛍光および3β-HSD染色の同時検出のために、マルチトラックモードを設定：488 nmのアルゴンレーザーとGFPの検出のための505から530 nmのバンドパスフィルタと、 543 nmのヘリウム - ネオンレーザーおよびmCherryを検出するための560から615 nmのバンドパスフィルター。そして、3β-HSD染色の検出のための光チャネルを送信しました。ピンホールのサイズは、1 Airey単位であり、解像度は1,024×1024画素です。
3. 3D投影として（6μmの間隔で）のzスタックを組み立て、そして内蔵の共焦点ソフトウェアを使用することにより、突起と明視野をマージします。

Results

34 HPFで^ci5胚 ：Tgは（mCherryをkdrl）; ^LI1：前腎腎臓糸球体とその新生血管系とステロイド合成間腎組織のcodevelopsは、3β-HSD酵素活性アッセイは、二重トランスジェニックTgは（GFP wt1b）で行った方法を決定するために、 （ 図1）。いくつかのステロイド産生細胞が正中線を横切って移行を開始し、背側のビューから突出したエッジを形成するのに対し、この段階では、3β-HSD活性陽性のステロイド産生組織は右正中線に位置しており、前腎腎臓の糸球体のすぐ尾。ステロイド産生組織は密接に背側大動脈（DA）と後部主静脈（PCV）と関連しています。

Tgは（kdrl：GFP）での3β-HSD酵素活性アッセイ^S843胚はDA、PCVを含め、周囲の腎間の血管の明...

Discussion

3β-HSD活性の信号強度は、反応の過程にわたって増加しました。 3β-HSD活性のクリア信号が以降28 HPFからの段階のための反応の4時間後に検出されました。しかしながら、反応時間は、アッセイの目的に応じて、経験的な決意を必要とします。染色は一晩処理を必要とする場合には、わずかに青みがかった背景には、サンプル上で開発する傾向があります。この問題は、3β-HSDの活性染色の前に固定期間（ 例えば 、室温で4％のPFATで4時間）を増加させることによって克服することができます。これとは対照的に、このようなRTで4％PFATで一晩固定などoverfixationは、非常に明確な背景につながります。しかし、より長い時間は、信号の望ましい強さを得るために必要とされるであろう。私たちは、3β-HSD活性染色は、一般的に、その後の蛍光レポーター観察またはIでより望ましい結果をもたらす前に、2％ではなく4％PFATで一晩サンプルを固定していることに気づきましたHC分析。しかし、4％PFATで胚を固定する（1日以内に完了）3β-HSD活性の迅速なアッセイを可能にし、したがって、腎間のステロイド産生組織を標的に遺伝的または化学的な画...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
共焦点顕微鏡	Carl Zeiss	LSM510
DMSO	Sigma	D8418
グリセロール	USB	US16374
ハイクロン子牛胎児血清	GEヘルスケアライフサイエンス	SH30073
ニコチンアミド	シグマ	N0636
&β;-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド水和物	グマ	N1636
4-ニトロブルーテトラゾリウム	プロメガ	S380C
ヌシーブGTG	ロンザ	50081
パラホルムアルデヒド	シグマ	P6148
フェニルチオ尿素シ	グマ	P7629
リン酸緩衝生理食塩水	Σ	P4417-100Tab
PYREX スポットプレート	コーニング	7220-85
リーフソルト	AZOO	AZ28001
トランスデヒドロアンドロステロン	Σ	D4000
トリトン X-100	σT8787
Tween 20	Σ	P9416
ビブラート	ライカ	VT1000M