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方法論記事

バイオフィルム除去窒素パージすることなく、二酸化炭素エアロゾルを使用します

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DOI:

10.3791/54827

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2016年11月6日

 , 
1School of Mechanical and Nuclear Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST)

この記事について

サマリー

表面上のバイオフィルムは、窒素パージなしで二酸化炭素エアロゾルの周期的なジェットを使用することで、効果的かつ迅速に除去することができます。

要約

Biofilmsは、多くのアプリケーションで深刻な問題を引き起こす可能性があります。経済的損失を引き起こすだけでなく、公衆衛生上の危険をもたらす可能性もあります。そのため、表面からバイオフィルムを除去することが非常に望ましいとされています。CO2エアロゾル洗浄に関する多くの研究では、洗浄中に発生する結露を減らすことにより、バイオフィルムの除去効率を高めるために窒素パージが採用されています。しかし、この研究では、窒素パージなしのCO2エアロゾルの周期的なジェットを使用して、研磨されたステンレス鋼表面からシュードモナスプチダバイオフィルムを除去しました。CO2エアロゾルは、固体と気体のCO2の混合物であり、高圧CO2ガスがノズルを介して断熱的に膨張すると生成されます。この高速エアロゾルを、24時間培養したバイオフィルムに塗布しました。除去効率は90.36%から98.29%の範囲であり、処理時間が16秒から88秒まで変化したため、バイオフィルムの蛍光強度を測定することによって評価されました。また、窒素パージの有無による除去効率を比較する実験も行いました。測定されたバイオフィルム除去効率は、互いに有意差はありませんでした(t検定、p > 0.55)。したがって、この技術を使用して、さまざまなバイオ汚染された表面を1分以内に洗浄できます。

概要

バイオフィルムは、細菌細胞が細胞外高分子物質の自己生成マトリックス内に埋め込まれ、一緒に保持され、外部環境から保護されている複雑な細菌群集構造です。バイオフィルムは、医療用インプラント材料やデバイス、食品加工機器、熱交換器など、さまざまな表面に形成されるため、公衆衛生上のリスクをもたらし、経済的損失を引き起こす可能性があります。実際、米国疾病予防管理センター(CDC)によると、バイオフィルムはヒトの全細菌感染症の65%に関連していることがわかっています1。

オートクレーブや塩素などの消毒剤は、一般的にバイオフィルムの不活性化に使用されてきました。ただし、オートクレーブの使用は、高温の蒸気に耐えられず、オートクレーブに配置されない表面に限定されます。消毒剤は、化学処理に敏感な表面や有毒な酸化生成物を収集しやすい表面には適していません2.さらに、バイオフィルムは不活性化されるだけでなく、表面への新しい細胞の付着を防ぐために除去されるべきであり、それによって新しいバイオフィルム3を形成するべきである。しかし、粘性流体せん断に基づく方法では、表面付近の流速がほぼゼロであり、通常、せん断力がミクロンおよびサブミクロンサイズの物質の接着力に打ち勝つことができないため、バイオフィルムの除去は困難です。さらに、バイオフィルムマトリックスは、物理的および化学的バリア1として機能することが知られている。

超音波振動1、電流4、レーザー照射5、高圧水噴霧6など、表面からバイオフィルムを除去するために多くの物理的および機械的技術が開発されてきました。各手法には、独自の長所と短所があります。超音波振動と電流を使用して、バイオフィルムの形成を制御することができます。ただし、それぞれ特定の構成と導電性表面が必要であり、追加のせん断応力1、4が必要です。レーザー照射は、限られた領域や硬い表面に適用できます。ただし、一部の生細胞と死細胞は表面に残ります5。高圧水噴霧はバイオフィルムを効果的に除去します。ただし、その高い運動量は、柔らかい基板に損傷を与える可能性があります6。

CO2エアロゾルを使用したバイオフィルム除去は以前に提案されています。それは、短時間で高い除去効率7-11で、有望な結果を示しています。CO2エアロゾルは、ノズルを介して高圧CO2ガスが断熱膨張することによって生成され、バイオフィルムで汚染された表面に適用されます。この洗浄技術は、固体CO2粒子の運動量移動と溶融したCO2液体の溶媒作用、続いてCO2ガス12の空力せん断力を利用します。高圧のN2ガスジェットと比較して、同じ停滞圧力のCO2エアロゾルジェットは、大腸菌のバイオフィルム7の除去にはるかに効果的です。また、バクテリアに送達される固体CO2の運動量はかなり高いが、固体表面に印加される全エアロゾルジェットの運動量は、ウォータージェットの運動量よりも大幅に低い。したがって、このCO2エアロゾル技術を使用して損傷のない洗浄が可能です。

このプロトコルでは、窒素パージなしのCO2エアロゾルの周期的なジェットを使用して、研磨されたステンレス鋼の表面からPseudomonas putidaバイオフィルムを除去しました。実際、窒素パージは、ホットプレートまたは赤外線ランプによる加熱やドライボックスの採用も採用されているにもかかわらず、洗浄中に発生する水分凝縮を減らすことにより除去効率を高めるために、多くのCO2エアロゾル研究で使用されてきました12。表面のバイオフィルム形成と最適化された洗浄手順を以下に説明します。除去効率は、表面上のバイオフィルムの蛍光強度を測定することにより評価しました。

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プロトコル

バイオフィルム形成のための表面の調製

  1. 機械式カッターでチップ（10×10ミリメートル2）に1 mm厚の304ステンレス鋼板をカットします。
  2. 10分ごとに、アセトン、メタノール、および脱イオン（DI）水を順次内のチップの超音波洗浄を行ってください。有機汚染を除去するために、ガラスのような物質で作られた耐溶剤性容器を、使用してください。
  3. 3-5秒間DI水を流しながらチップを洗浄します。
  4. 3~5秒間N 2ガス流を用いてチップを乾燥させます。

細菌培養物の調製

  1. P.を取りますプチダ KT2440（親切教授宋東国李、UNIST、韓国によって提供される）-80°Cディープフリーザーに保存されている株式。
  2. 1分後に室温で解凍し、凍結した原液の最上層はスラッシュになります。原液の溶融層にループを浸し。
  3. ルリア上にストリークに細菌をこのループを使用します1.5％寒天を含む-Bertani（LB）プレート。
  4. 細菌コロニーを成長させるために30℃で一晩プレートをインキュベートします。
  5. 新鮮なループを使用してプレートから単一コロニーを採取。
  6. 単一の細菌コロニーを含むループで50ミリリットルコニカルチューブにLBブロスの10ミリリットルを接種します。
  7. 30℃で16時間および160 rpmで振とう培養器で培養液をインキュベートします。

表面上3.バイオフィルム形成

  1. 各チップの表面を殺菌するために、1-2秒ごとに5回をピンセットで準備された各チップをピックアップし、70％エタノールでそれらを浸し。チップは浸漬中にピンセットで開催されていることを確認してください。
  2. 、オートクレーブ滅菌DI水にし、LBブロス順次に各チップを浸し1-2秒ごとに、5回、残りのエタノールを除去します。
  3. 2チップを搭載した6ウェル培養プレート中でこれらのチップを置き、ウェルあたり5ミリリットルのLBブロス。
  4. LBブロスが到達中の濃度まで、細菌培養物を希釈8×10 8細胞/ ml（600 nmの波長での光学密度：〜0.8）。
  5. 希釈した細菌培養物の50μlの各ウェルに接種します。
  6. バイオフィルムの形成のために24時間振盪せずに30℃で培養します。

4. CO 2エアロゾルクリーニング

  1. ゆるく取り付けられ浮遊細菌を除去するために、10mM酢酸アンモニウム緩衝液中のバイオフィルム形成のチップ（揮発性に）5回浸します。
  2. 空気は穏やかに流れて安全キャビネットでこれらのチップを乾燥させます。
  3. 乾燥直後に、ジェットの軸に沿ってCO 2ノズルから20ミリメートルである積載場所、上のチップを配置します。 40°の角度にジェット軸を傾けます。
  4. ガス圧力調整器を使用して、それぞれ5.3 MPaで0.7 MPaのにCO 2とN 2ガスの停滞圧力を設定します。
  5. チップの中央部にエアロゾルジェットを適用します。固体CO 2を含むホワイトエアロゾルはすべき見えるように。 5秒間のCO 2用の電磁弁を「オン」にしてから、3秒間「オフ」に回し：定期的に手動で制御されるスイッチを使用して（サイクル8秒）。窒素パージを使用する必要がある場合、N 2の連続的な供給のための電磁弁をオン。
  6. 窒素パージでとすることなく、CO 2 16のためのエアロゾル、40、および88秒でチップを扱います。陰性対照として処理せずにチップを保持します。

除去効率5.分析

  1. 制御およびエアロゾル処理されたチップ上の細菌の細胞を染色するためにDI水中：1μM緑色蛍光核酸染色（500分の480 nmの励起/発光波長）を準備します。
  2. 染色液にチップを置きます。
  3. 37℃で30分間光せずにインキュベータ内のチップをインキュベートします。
  4. インキュベーション後、穏やかに過剰な蛍光色素を除去するために流れるDI水でチップを洗浄します。
  5. チップのwiを乾燥目のN 2ガス流量。
  6. 落射蛍光顕微鏡、40X対物レンズ、CCDカメラを使用して、各チップのためのビューの5ランダムフィールドの蛍光顕微鏡像（321×240μmの2）を取ります。
  7. 例えば、ImageJのような画像処理ソフトウェアを使用して各画像の蛍光強度を得ました。 ImageJのでは、「プロセス」メニューの「減算背景」機能を使用し、「分析」メニューの「測定値の設定」ウィンドウ内の「統合密度」を選択します。蛍光強度を得るために、「分析」メニューの「測定」を行います。
  8. 以下の式に従ってバイオフィルム除去の効率を計算する：100％×（制御チップのIを -処理されたチップのIを ）/ Iが計算された蛍光強度である（制御チップのI）。
  9. 平均除去効率と標準偏差を取得します。で使用してください各ケースの少なくとも4チップ。

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結果

CO 2エアロゾルは、Pを除去するために使用されましたSUS304の表面（ 図1）からプチダバイオフィルム。表面の大部分は、成長の24時間後にバイオフィルムで覆った。バイオフィルムの大部分はCO 2エアロゾル（ 図2）を用いて除去しました。予想されるように、 図3は、増加したCO 2エアロゾル処理時間などのバイオフィルム除去効率の増加を示します。 88秒の処理時間のために、除去効率は97.74％であり、とはそれぞれ、窒素パージなしで98.29％と高いことが決定されました。空気温度は23〜24℃であったクリーニング実験を行った時の相対湿度は26-50％でした。

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ディスカッション

以前、CO2エアロゾル洗浄におけるCO2ガス圧、ジェット角、固体表面までの距離に関する最適化研究を行ってきました7。これまでの研究とは異なり、本研究では、エアロゾルに窒素パージは含まれていませんでした(図1)。さらに、304ステンレス鋼は最も一般的なステンレス鋼の1つであり、食品業界で広く使用されているため、このプロトコルで使用されました。研磨された表面は、焦点距離が均一で光散乱が低減されるため、蛍光分析に有益です。細菌種 P. putida バイオフィルム研究の分野でも一般的に使用されています。表面に付着したバイオフィルムの量を定量化するために蛍光強度が使用されました。2次元蛍光画像を使用して、表面のバイオフィルムの量を定量化しました。この方法は、24時間成長した薄いバイオフィルムには十分かもしれません。ただし、厚いバイオフィルムには共焦点3D画像を使用する必要があります。この方法は簡単で、細菌細胞の生物学的認識を可能にします。染色は細菌膜を貫通し、細胞生存率に関係なく核酸を染色するため、緑色の蛍光はすべての生きた細菌...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この研究は、科学・情報通信・未来計画省（#2015R1A2A2A01006446）の資金提供を受けて、韓国国立研究財団（NRF）を通じて基礎科学研究プログラムによって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
304ステンレス鋼Steelni
(韓国)		研磨およびさいの目に切ったもの
超音波洗浄機Branson
(米国)		5510E-DTH
Luria-Bertani(LB)Becton、Dickinson and Company
(米国)		244620500 g
天ベクトン、ディキンソン、およびCompany
(米国)		214010500 g
6ウェル培養プレートSPL Life Sciences
(韓国)		32006
酢酸アンモニウム緩衝液Sigma-Aldrich
(米国)		667404 10 mM
デュアルガスユニットApplied Surface Technologies
(米国)		K6-10DGCO2 gas
& 8 nozzles for N2
syto9Thermo Fissher Scientific
(USA)		InvitrogenExcitaion: 480 nm
Emission: 500 nm
落射蛍光顕微鏡 ニコン(日本)Eclipse 80i
40X対物レンズNikon
(日本)		Plan FluorNA:0.75
CCDカメラ Photometrics
(USA)		Cool SNAP HQ2モノクロ
寒

参考文献

  1. Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24 (5), 393-443 (2007).
  2. Bott, T. R. Biofouling control with ultrasound. Heat Transfer Eng. 21 (3), 43-49 (2000).
  3. Meyer, B. Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. Int. Biodeterior. Biodegradation. 51 (4), 249-253 (2003).
  4. Hong, S. H., et al. Effect of electric currents on bacterial detachment and inactivation. Biotechnol. Bioeng. 100 (2), 379-386 (2008).
  5. Nandakumar, K., Obika, H., Utsumi, A., Ooie, T., Yano, T. In vitro laser ablation of laboratory developed biofilms using an Nd:YAG laser of 532 nm wavelength. Biotechnol. Bioeng. 86 (7), 729-736 (2004).
  6. Gibson, H., Taylor, J. H., Hall, K. E., Holah, J. T. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol. 87 (1), 41-48 (1999).
  7. Kang, M. Y., Jeong, H. W., Kim, J., Lee, J. W., Jang, J. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols. J. Aerosol Sci. 41 (11), 1044-1051 (2010).
  8. Cha, M., Hong, S., Kang, M. Y., Lee, J. W., Jang, J. Gas-phase removal of biofilms from various surfaces using carbon dioxide aerosols. Biofouling. 28 (7), 681-686 (2012).
  9. Dwidar, M., Hong, S., Cha, M., Jang, J., Mitchell, R. J. Combined application of bacterial predation and carbon dioxide aerosols to effectively remove biofilms. Biofouling. 28 (7), 671-680 (2012).
  10. Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols. Biotechnol. Bioprocess Eng. 19 (3), 503-509 (2014).
  11. Singh, R., Monnappa, A. K., Hong, S., Mitchell, R. J., Jang, J. Effects of Carbon Dioxide Aerosols on the Viability of Escherichia coli during Biofilm Dispersal. Sci. Rep. 5, 13766(2015).
  12. Sherman, R. Carbon Dioxide Snow Cleaning. Particul. Sci.Technol. 25 (1), 37-57 (2007).

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