カポジ肉腫ヘルペス ウイルスによる細胞変換を勉強するための in Vitroモデル

サマリー

カポジ肉腫 (KS)、発癌性ウイルス ヘルペス ウイルス 8/KS ヒトヘルペス ウイルス (HHV-8/KSHV) 感染により誘導される腫瘍であります。ここで説明した内皮細胞培養モデルは KSHV が宿主細胞を変換するメカニズムを研究するため一意に適しています。

要約

カポジ肉腫 (KS) ですが KSHV、血管内皮細胞 (EC) の感染によって開始され、免疫抑制の設定で最もよく開発する異常な腫瘍増殖の紡錘形細胞から成る。研究の数十年にもかかわらず KS の最適な治療の定義が不十分なままし、臨床転帰、リソース制限の設定に特に有利です。KS 病変、病的血管新生、慢性的な炎症と発癌、によって駆動され、これらのプロセスを研究する様々 な生体外で細胞培養モデルが開発されました。EC 系細胞は紡錘細胞前駆体の最も適切な体外サロゲートを提供するので、KS は内皮由来の KSHV 感染細胞から発生します。ただし、EC体外限られた寿命を持っているので、KSHV で採用されている発癌機構が他の発癌性ウイルスのものより効率が悪い、それされているプライマリの変換のプロセスを評価することは困難またはテロメラーゼ不死化理事会したがって、新規 EC 文化モデルは容易に KSHV 感染、次の変換をサポートする開発されました。ヒトパピ ローマ ウイルス 16 型の E6、E7 遺伝子の異所性発現の年齢と経過一致モックと KSHV-感染 EC 拡張の文化を可能にし本当に変形の開発をサポートしています (つまり、発癌性) 感染細胞培養における表現型.KS のこの扱いやすい再現性の高いモデルは、臨床の現場への翻訳の可能性が高いいくつかの本質的なシグナル伝達経路の発見を促進しています。

概要

カポジ肉腫 (KS) は、高度な免疫抑制¹の設定で最もよく開発する多焦点 angioproliferative 腫瘍皮膚や粘膜、内臓のサイトに影響を与えるです。4 疫学的フォームに記載されている: 古典的な地中海および中東遺産の高齢者に影響を与える通常無痛性フォーム医原性、臓器移植後免疫抑制薬による治療に起因伝染病、エイズの定義の癌の場合。風土性、アフリカの風土性の地域で子供たちに共通する HIV に依存しない形式です。HIV の治療のための効果的な組み合わせ抗レトロ ウイルス薬療法の出現で、流行の KS あまり一般的に発展途上国で診断されます。しかし、臨床的に積極的な風土病や伝染性の形態のまま最も一般多くのアフリカ諸国^2,3,4で診断された癌。したがって、KS の治療のための効果的な病因標的薬剤の同定は研究の優先順位です。

組織学的, KS 病変は EC 起源の紡錘形細胞が不連続な血管網⁵を形作るという広範な異常な血管新生によって特徴付けられます。これらの異常な血管 (「血管スリット") は、病変の特徴的な色を与える赤血球漏出を許可します。また、病変は慢性炎症 (すなわち、リンパ球、マクロファージ、形質細胞) を特徴付ける多くの白血球を含みます。KS 病変の免疫再構築、次の回帰を説明したが、KS ハイパー増殖性病変と、真の腫瘍^6,7,8,9の両方の機能があることを示唆しています。

KS ヘルペス ウイルス (KSHV)、カンザスの原因となるエージェントは、1994年¹⁰で確認されました。以来、多くの in vitro細胞培養モデルが開発されている病態研究を有効にするには、腫瘍生検材料プライマリから仔細胞を含むまたはテロメラーゼ発現 EC 感染 KSHV体外^{11,12,13,14,15,16,17,18}. 現在利用できるモデルのどれも完全に KS 腫瘍微小環境を繰り返すが、すべては KSHV 感染症の病態を理解するための貴重な知識を貢献しています。異なり、他知られている発癌性ヒトヘルペス ウイルス エプスタインバー ウイルス (EBV)、KSHV 容易に変換されません次のde novo感染^19,20,21,培養細胞²²ですただし、この制限は、E6 と微小血管やリンパ管の起源を混合のいずれかのプライマリ人間 EC を伝達で克服されているとヒトパピ ローマ ウイルスから E7 遺伝子 KSHV^{23,24 の感染前に 16 を入力。}.これらの外因性の遺伝子の発現は大幅に KSHV生体外の変換の可能性をさらに網膜芽細胞腫タンパク質および p53^23,24の抑制を提供することによって増加の一部。この EC トランスダクション法が細胞遺伝子発現 KSHV 感染によって引き起こされるが、KS の細胞の生存・増殖^25,26を容易にする表示されるホストでのキーの変更を識別するために複数の研究所を許可します。^{,27,28,29,30,31,32}. 記載プロトコルは簡単で、再現性の高い、および KSHV 感染 EC の年齢と経過一致と一次電池よりはるかに長いために培養することができます、モック感染コントロールの世代になりますKSHV で採用されている発癌性発現機構の解明を可能にします。プロトコルには、プライマリ胸水リンパ腫細胞株 BCBL-1 E6 E7 不死化 EC から KSHV が非常にしやすいも野生型の製造方法が含まれていますが、遺伝子組換えバクミドの感染は KSHV BAC16³⁰を派生します。BAC16 の準備のためのプロトコルは別の場所で説明^33,34。

プロトコル

注: このプロトコルで説明したすべての手順は、BSL 2 の条件下で行わなければならない

。

1。 KSHV 在庫準備

1. 準備 TNE バッファー: ddH ₂ O 292.24 mg EDTA を溶解、225 mL にもたらすと pH 8 に調整します。605.7 mg トリス ddH ₂ O に溶解、225 mL にもたらす、pH 8 に調整します。EDTA とトリスのソリューションを組み合わせて、4.38 g 塩化ナトリウムを加えて、500 mL に最終的な音量を調整、フィルター、殺菌し、4 ° c ^. 保存
2. 文化 KSHV 正、EBV 否定的な一次貯留リンパ腫細胞株 BCBL 1 37 ° C プラス 10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS) と約 1 に抗菌剤添加 RPMI で 5% CO ₂ 加湿のインキュベーターで1.2 mL あたり ⁶ セルを 10 倍にします
。 KSHV 生産を誘導する
3. 新鮮な培地で培養 1:2 の分割 20 ng/mL の最終的な集中にホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) を追加し、5 日間の文化を孵化させなさい。代わりに、ウイルス複製を誘発する 3 日間の酪 (NaB; 0.1 mM) で細胞を治療します
。
4. ウイルス粒子を収穫する遠心培養セルをペレットし、新鮮なチューブに上清を転送するために室温で 5 分間 300 x g で上清が最初
。 4 10 分 2,500 × g で遠心分離機細胞の残骸の転送を避けるために上清をさらに明確に
5. ° C
   注: として明確化培養上清の濾過滅菌 0.45 μ m のフィルターを実行することができますを介して高速遠心分離に代わる。ろ過装置を使用して抗体価の有意な低下を観察しています。したがって、我々 日常的に 2 回目の遠心分離のステップ代わりに実行します
。
6. 約 30 ml の明確化培養 6 遠心チューブに上清中の TNE バッファーで 25% ショ糖溶液の 5 mL を次に、オーバーレイします
。
7. 遠心バランス チューブ真空下で 4 ° C で 2 時間 75,000 x g で
。
8. 培養上清をデカントし、可能な限り上清およびショ糖ソリューションを削除する各管の縁をしみ、150 μ L の TNE バッファーに表示できない場合がありますウイルス ペレットを再懸濁します
。
9. プールのすべての再停止ウイルス、よく、混合し、-80 ° c ^. 25 μ 因数を凍結

2。EC E6 と E7 ヒトパピ ローマ ウイルス遺伝子の伝達

注: 私たちは日常的に主な理事会の成長のための標準培養フラスコを使用ただし、EC の不十分な成長が得られた場合、商業文化フラスコ使用見なす必要があります

。 EC 培地に

1. 文化主なひと皮膚微小血管やリンパ管 EC 37 ^° C プラス 5% で加湿のインキュベーターで CO ₂ (EGM; EC の基本培地 [EBM] [引受を含む EGM 2 BulletKit で補完が含まれていますヒドロコルチゾン、ひと線維芽細胞成長因子 B、血管 EC 増殖因子、インスリン様成長因子-1、アスコルビン酸、ひと上皮成長因子、抗生物質、およびヘパリン]) 約 50% 合流するコート t75 フラスコ細胞培養用フラスコで
。
2. の伝達、文化 PA317 LXSN 16E6E7 セルの 37 ^° C で加湿のインキュベーターで ^{24 , 35} プラス 10 %fbs と抗菌剤で DMEM で 5% CO ₂T150 細胞培養フラスコまでは約 90% 合流。16 mL の培地で一晩インキュベートし
。
3. 室温で 5 分間 300 × g で遠心分離して PA317 媒体を明確します
。
4. 12 ml の明確化 PA317 培地の EC 文化とオーバーレイ セルから、EGM を削除してインキュベートする 4 h
   注: は明らかに清 12 mL の慎重にそれに続く除去に邪魔されない小型ペレット 5 分結果の 300 x g で馴化培地の 16 mL を遠心分離。ただし、プライマリ EC 文化への PA317 LXSN 16E6E7 セルの転送 (包装細胞ラインが EC を脱却してすぐに) 重要では場合、転送する前に 0.45 μ m のフィルターを通してエアコン上清の濾過実行できます
。
5. 新鮮な EGM の PA317 媒体の 6 mL を交換し、一晩インキュベートします
。
6. 12 mL で再フィード EC 新鮮な EGM し, さらに 48 h.
7. EC は、サブカルチャーに培地を取り除き、12 mL の陽イオン、ない PBS で洗浄しによって (例えば TrypLE) 商業酵素分解溶液 3 mL を追加し、37 ° C で 3 分間インキュベート
8. 細胞懸濁液を 15 mL の円錐管に転送し、室温で 5 分間 300 × g で遠心。新鮮な EGM の結果細胞ペレットを再懸濁し、3 x T75 フラスコ フラスコあたり 12 mL EGM の最終巻に均等に分割します
。
9. E6 と E7 で導入した EC の選択、2 つの通路、導入された EC の感染症のためメッキまたは液体窒素で凍結後の 200 μ G/ml の最終的な集中に G418 を追加します
。

3。KSHV と EC の導入の感染

1. 感染前に日に前述のように商業酵素解離ソリューションを使用して酵素消化によって EC を収穫します。EGM の 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します。トリパン ブルー色素の 1/10 倍の希釈液を準備するのにには、セルの 5 μ L を使用します。診断を使用して生きているセルをカウントし、シード 10/6 ウェル プレートのウェル EGM の 2 mL で ⁵ 生きているセル x 2.5
。
2. 感染の日削除 EGM と好評につき、3 ml の PBS のカルシウムとマグネシウムの細胞を洗浄し、追加 2 mL EBM
   。 注意: それは EGM のヘパリンはウイルス粒子の結合とターゲット理事会の後の感染を抑制する、感染、EGM ではなく、EBM を使用するが重要です
KSHV、細胞に感染する
3. は各ウェルに 5 に 20 μ L ウイルス ストックを加えてミックスするプレートを旋回します。モック感染細胞は、各ウェルに TNE バッファーの等しいボリュームを追加します
。
4. 室温で 30 分間 400 x g でプレートを遠心し 90 分の 37 ° C でプレートをインキュベーションして
5. 研究の目標は、同期ウイルス感染、例えば、de novo 感染の初期イベントを必要とする初期のイベントを調査する場合は、この時点で接種ウイルスを削除します。2 mL の細胞を再フィードをすすいで新鮮な EGM。そうでなければ、2 mL EGM を追加し、文化を一晩インキュベートします
。
6. 感染と一日おきに、後日 2 mL EGM で細胞を再フィードします
。
7. 細胞が約 90% の合流、前述のように、市販の酵素分解溶液を用いたタンパク質分解酵素で収穫し、合計通路番号と通路の両方に注意、T75 に 3 つの井戸から細胞のプール感染後
。 モック-KSHV-感染と EC 細胞の実験で使用されるまたは液体窒素で凍結する時に、少なくとも 2 つのより多くの文章の 1:3 分割
8. を展開します
   。 注: E6 と E7 で導入した EC の分割とモックと KSHV 感染細胞のメンテナンス文化を分割する合流 (~ 85 ~ 90%) に達する前に

。

4。 確認感染抗体法による KSHV

注: KSHV 潜時に関連核抗原 (ラナ-1/ORF73) の検出は、感染症の信頼性の高い定量的測定を提供します。反ラナ抗体が市販

。

1. 染色、前日あたりでモックや KSHV-感染 EC 1 x 10 の ⁵ 時 24 ウェル プレートに各セル板 2 井戸 1 mL EGM でよくし、一晩インキュベートします
。
2. 500 で 2 回洗浄セル PBS とカルシウムと magniseum μ L。30 の洗浄ロッキング プラットフォーム上の s.
3. Ventillated-外部からの発煙のフードでは、室温で 15 分間 4% パラホルムアルデヒドの 500 μ L でセルを修正します
。
4. 洗浄洗浄バッファー (0.1% トリトン X-100 プラス PBS プラスの陽イオンで 0.02% ヤギ血清) の 500 μ L で 3 回セル
。
5. 室温で 30 分間洗浄バッファーで 2% ヤギ血清 500 μ L で細胞をブロックします
。
6. 洗浄洗浄バッファーの 500 μ L で 3 回セル
。
7. ラベルのモックや KSHV-感染した一次抗体の 200 μ L で EC 希釈 1:10 1 つの井戸ロッカーの部屋の温度で 30 分間洗浄バッファーの 0。200 μ L の洗浄バッファーのみで残りの 2 つの井戸をインキュベートします
。
8. 洗浄洗浄バッファーの 500 μ L で 3 回セル
。
9. ロッカーの室温で 30 分間洗浄バッファーで希釈した二次抗体 1: 100 の 200 μ L ですべての 4 つの井戸のラベルします
。
10. 洗浄洗浄バッファーの 500 μ L で 3 回セル
。
11. も取付中含む DAPI と観察の 20 μ L を適用し、倒立蛍光顕微鏡を用いた染色を評価します
。
12. は、少なくとも 200 セルのラナ陽性核の数を数えることによって KSHV 感染細胞のパーセント感染を決定します。感染組換え KSHV Bac16 は、GFP の表現のための文化の観察を介しても監視できます
。

結果

主な EC の形態は古典的な「石畳」として記述されて、ヒトパピ ローマ ウイルス E6 および E7 遺伝子 (図 1 a) の式によってこの形態は変わらない。単独での E6、E7 遺伝子の発現を変換された表現型; 誘発しません。したがって、細胞は抑制に連絡を受けやすい、分割文化の合流点に到達すると停止します。しかし細胞は増殖し、trypsinization とモック感染コントロールとして使用するため同年、通路文化の維持を可能にする低密度で replating に合流するために再生します。

KSHV と E6 ・ E7 導入 EC の感染は、KS 病変 (図 1 b) にみられる「紡錘細胞"の表現型を連想させる文化の劇的な形態変化を引き起こします。変換された表現型もあるマニフェスト一部接触阻止の損失によって細胞が培養後合流 (図 1) および足場非依存成長軟寒天培地 (...

ディスカッション

発癌は、生物³⁶内で重要な保護手段を回避するマルチ ステップ プロセスです。KS 病変存在真の肉腫に慢性的な炎症のスペクトルに沿って、KSHV を介した特定の病態生理学的プロセスの解明は変換⁹をサポートする細胞培養モデルにおけるいくつかの研究を実施することが必要です。接触阻害とアンカレッジ依存性増殖、細胞のがん化を示す表現型の損失を容易に開発しないことに注意してください次のプライマリの EC または EC テロメラーゼの発現によって不死化の感染。したがって、KS 腫瘍微小環境のすべての側面または explanted KS 細胞の挙動を KS ここで説明の生体外モデルは要約しない、一方は、感染による宿主細胞遺伝子発現の変化を研究するため一意に最適です。KSHV KS 腫瘍形成に貢献します。

最初の報告ここ説明培養系を用いた遺伝子発現 KSHV 感染細胞²⁵変換された表現型に貢献として受容体チロシン キナーゼ c キットを識別...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BCBL-1細胞	NIH AIDS 試薬プログラム	3233
PA317細胞	ATCC	CRL-2203
新生児経皮微小血管内皮細胞	ロンザ	CC-2505
EBM-2 基礎培地	ロンザ	CC-3156
EGM-2 BulletKit	ロンザ	CC-3162
抗 KSHV LANA/ORF 73	アドバンストバイオテクノロジー	13-210-100
TrypLETMExpress、フェノールレッドなし	ThermoFisher	12604013
RPMI
DMEM
PBS with カルシウムおよびマグネシウム