ここでは、HBVのライフサイクルの初期段階をモニターするために新たに開発されたB型肝炎ウイルス（HBV）レポーター系を記載します。 インビトロ系簡略化これは、高スループットの戦略を用いて、抗HBV薬のスクリーニングに役立ちます。
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この記事について
サマリー
要約
現在、ヒト免疫不全ウイルス1(HIV-1)やC型肝炎ウイルス(HCV)など、ゲノムにレポーターやマーカータンパク質などの外来遺伝子を持つ様々なウイルスの組換え型を構築することが可能です。これらの組換えウイルスは、通常、感染細胞内の元のウイルスのライフサイクルを忠実に模倣し、同じ宿主範囲依存性を示します。組換えウイルスの開発により、阻害剤の効率的なスクリーニングと特定の宿主因子の同定が可能になります。しかし、これまでB型肝炎ウイルス(HBV)の作製は、様々な実験的限界のために困難でした。主な制限は、HBVのコンパクトなゲノムサイズと、1.3ゲノムサイズを超えないかなり厳密なゲノムサイズであり、ビリオンにパッケージ化する必要があります。したがって、挿入する外来遺伝子のサイズは、ゲノムDNAの欠失を行わない場合、0.4kb未満にする必要があります。したがって、このサイズ制限を克服するためには、一部のHBV DNAの欠失が必要です。本稿では、HBVのコアコード領域の一部をレポーター遺伝子に置換し、HBVのpolコード領域の一部をレポーター遺伝子に置き換えることにより、HBV複製サイクルの初期段階を監視するために、レポーター遺伝子をコードする組換えHBVの構築について報告する。レポーターの活動によってモニターされる組換えHBV感染の検出は、HBV感染を評価するために現在利用可能な従来の方法を使用した検出よりも感度が高く、安価でした。このシステムは、抗HBV阻害剤、宿主因子、ウイルス感受性細胞の同定のためのハイスループットスクリーニングなど、多くのアプリケーションに役立ちます。
概要
B型肝炎ウイルス（HBV）による慢性感染は、慢性肝疾患1の主要な危険因子です。現在の治療戦略は、HBV polで機能および/または感染した個体における免疫反応を活性化するだけでなく、間接的にインターフェロン刺激遺伝子機能2を介して、HBVの増殖を抑制するI型インターフェロンの投与を阻害するヌクレオチド類似体に基づいているが、これらの治療は、HBVを排除することはできませんDNA完全に3。さらに、抗POL剤に対して耐性であるHBVSの出現が懸念4です。直接ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、またはC型肝炎ウイルス（HCV）のライフサイクルの異なる段階を標的と組み合わせた抗ウイルス剤の投与は、正常抑制またはウイルス（ES）を根絶することが示されました。この考え、Hの異なるステージに直接作用する抗HBV剤の開発に類似BVのライフサイクルは、将来のHBV療法を確立するために重要です。
一般的に、標的ウイルスの単純なインビトロ培養系の確立は、抗ウイルス剤の開発を容易にします。しかしながら、抗HBV剤をスクリーニングするためのin vitro培養系の開発に少なくとも二つの障壁があります。第一は、HBV感染/増殖のための便利なインビトロ細胞培養系の欠....
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プロトコル
レポータータンパク質をコードする組換えHBVの1.生産
- HepG2細胞の調製
- 細胞培養培地を準備し（10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、及び100 U / mlの非必須アミノ酸）。
- 培養液10mlのトランスフェクションの前日で10 cmのコラーゲンコートディッシュでプレート4×10 6 HepG2細胞。加湿5％CO 2インキュベーター中37℃でHepG2細胞をインキュベートします。
注：約4×10 6個のHepG2細胞を培養培地10ml中10cmのコラーゲンコートディッシュに播種されている場合、それらは次の日に70〜90％コンフルエントとなります。
- トランスフェクション
- トランスフェクションを使用してpUC1.2HBV / NL 15のpUC1.2HBVデルタイプシロン15および5μg5μgのでトランスフェHepG2細胞製造元の指示に従って試薬。
- 翌日、培地を除去し、新鮮な培養培地10mlを追加します。
- 一週間は、トランスフェクション後、....
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結果
図1は、ゲノム上のHBVゲノム、転写されたRNA、ウイルスタンパク質およびそのコード領域の概略図を示します。ゲノム中のレポーター遺伝子とその位置も示されています。 図2は、レポーター遺伝子を含むHBVレポータープラスミドとヘルパープラスミドを示します。 pUC1.2HBV / NLレポーターはpUC1.2HBV 16のプレコアmRNAの転写開始部位から223から811ヌクレオチド位置を削除した後、レポーター遺伝子を挿入することによって構築しました。キャプシド形成シグナル配列における点突然変異を有するpUC1.2HBVdeltaは、部位特異的突然変異誘発PCRによって生成されました。レポータープラスミド（pUC1.2HBV / NL）とヘルパープラスミド（pUC1.2HBVdelta）はヒン DIIIおよびEcoRIで消化し、次いでゲル電気泳動に供しました。 pUCプラスミドのための3.0キロバイトと1.2HBV / NL.......
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ディスカッション
HBVゲノムは、コア、ポリメラーゼ、表面、およびXのORF（ 図1）を含む4つの主要なオープンリーディングフレーム（ORF）を有します。エンハンサーI 18を含むエンハンサーII、S1プロモーター、S2プロモーターおよびXプロモーターを含むプレコア/コアプロモーター：これら四つのHBVのORFの転写はしっかり4プロモーターによって調節されます。 3.5キロバイトと3.4キロバイトのmRNAは、それぞれ、プレコアおよびCoreタンパク質に翻訳されています。大エンベロープタンパク質（L）が最大のサブゲノムのmRNA（2.5キロバイト）、中（M）から製造され、小さな表面タンパク質（S）が短い転写物（2.1キロバイト）から翻訳されています。 0.8キロバイトの転写物は、Xタンパク質19、20の翻訳のためのテンプレートです。プレゲノムRNAの5 'および3'末端は、ダイレクトリピート1（DR1）、DR2およびパッケージングシグナル<.......
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
この研究は、日本医療研究開発機構(AMED)の肝炎研究プログラムと、日本の文部科学省(MEXT)の科学研究費助成によって部分的に支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Nano-GLOルシフェラーゼアッセイリージェント | プロメガ | N1110 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン混合溶液 | Nacalai tesque | 09367-34 | |
| MEM 非必須アミノ酸溶液 | サーモフィッシャー サイエンティフィ | 11140050 | |
| DMEM | サーモフィッシャー サイエンティフィック | 11995065 | |
| Opti-MEM I 還元血清培地 | サーモフィッシャー サイエンティフィ | 31985070 | |
| 100mm/コラーゲンコーティングディッシュ | いわき | 4020-010 | |
| リポフェクタミン 3000 トランスフェクション試薬 | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | L3000001 | |
| ポリエチレングリコール(PEG)6000 | Sigma-Aldrich | 81255 | |
| ポリエチレングリコール (PEG) 8000 | シグマ・アルドリッチ | 89510 | |
| NaCl | ナカライ テスク | 31319-45 | |
| 0.5 mol/L EDTA 溶液 | ナカライ テスク | 06894-14 | |
| Tris-HCl | ナカライ テスク | 35434-21 | |
| Millex-HP, 0.45 μm、ポリエテルスルホン、フィルター | メルクミリポア | SLHP033RS | |
| ジメチルスルホキシド(DMSO) | シグマアルドリッチ | D2650 | |
| コラーゲンコーティング 96ウェルプレート | コーニング | NO3585 | |
| パッシブ溶解 5倍バッファー | プロメガ | E1941 | |
| グロマックス96マイクロプレートルミノメーター | プロメガ | E6501 | |
| ショ糖 | Nacalai tesque | 30403-55 | |
| Luminometer plate | Greiner bio-one | 655075 | |
| HepG2-NTCP1-myc-clone22 | - | - | Reference 15 |
| pUC1.2HBV Delta epsilon | - | - | Reference 15 |
| pUC1.2HBV/NL | - | - | Reference 15 |
| 50 ml tube | Violamo | 1-3500-02 | |
| Anti-Myc抗体 | Sigma-Aldrich | C3956 | |
| HBIG | 日本血液製剤機構 | - | |
| IFN-&β; | 持田製薬 | 14987224005413 | |
| ヘパリン | シグマ-アルドリッチ | H3393 |
参考文献
- Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127 (5), Supple 1 35-50 (2004).
- Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure....
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再版と許可
