複製サイクルの初期段階を監視するためにB型肝炎ウイルスのレポーターシステムの開発

B型肝炎ウイルス（HBV）による慢性感染は、慢性肝疾患¹の主要な危険因子です。現在の治療戦略は、HBV polで機能および/または感染した個体における免疫反応を活性化するだけでなく、間接的にインターフェロン刺激遺伝子機能^2を介して、HBVの増殖を抑制するI型インターフェロンの投与を阻害するヌクレオチド類似体に基づいているが、これらの治療は、HBVを排除することはできませんDNA完全に^3。さらに、抗POL剤に対して耐性であるHBVSの出現が懸念⁴です。直接ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、またはC型肝炎ウイルス（HCV）のライフサイクルの異なる段階を標的と組み合わせた抗ウイルス剤の投与は、正常抑制またはウイルス（ES）を根絶することが示されました。この考え、Hの異なるステージに直接作用する抗HBV剤の開発に類似BVのライフサイクルは、将来のHBV療法を確立するために重要です。

一般的に、標的ウイルスの単純なインビトロ培養系の確立は、抗ウイルス剤の開発を容易にします。しかしながら、抗HBV剤をスクリーニングするためのin vitro培養系の開発に少なくとも二つの障壁があります。第一は、HBV感染/増殖のための便利なインビトロ細胞培養系の欠如です。株化細胞内で増殖しているようなHIVおよびHCVなどの他のウイルス、とは異なり、原因狭い宿主範囲を含む実験的な制約のため、in vitroで HBVを育成することは困難です。このようなHBV感染^、5,6に対して感受性であるヒト肝癌細胞株HepaRG、などの特定の細胞培養系の使用は^{、 図7は、}これらの問題を克服するために開発されました。また、ウロキナーゼ-TYから分離されたPXB細胞、PEプラスミノーゲンアクチベーター、トランスジェニック/一次ヒト肝細胞（PHH）を接種したSCIDマウスに、HBV感染および複製⁸に感受性であることが示されました。しかし、HepaRGにおけるHBV複製のレベルは、HBV感染/複製レベルの一貫性がなく、再現性のない結果が発生する可能性があり、培養後の細胞分化状態に依存しています。 PXBは、一般に、HBV感染実験に使用されているが、その利用可能性によって制限されます。テトラサイクリン誘導HBV発現細胞株、HepAD38は、また広くHBVの複製を研究するために使用されてきたが、このシステムは、転写後ではなく、HBV感染⁹の入口段階で評価することができます。最近、HBVのための機能的受容体としてタウロコール酸ナトリウムのcotransportingポリペプチドの同定（NTCP）は、変数HBV培養システム¹⁰の開発を可能にしました。実際、このようなHuh7細胞などの非感受性の肝細胞におけるNTCP発現とHepG2細胞は、HBV感染^10を可能^にし 、従って、HBV感受性の細胞株の選択は、実験的制限の多くを解決する、拡張されました。第二の問題は、HBV感染および複製を評価するための単純なアッセイ系の欠如です。 HBV感染の評価は、通常、HBV DNA、RNAおよびタンパク質を分析することによって行われます。しかし、これらのウイルスマーカーの定量化は、多くの場合、費用がかかり、必ずしも簡単ではない時間がかかります。したがって、単純なアッセイ系の開発は、このようなレポーター遺伝子を使用するなど、HBVアッセイ系に関連する問題を克服する可能性があります。

しかしながら、HBVキャプシドにパッケージングすることができるゲノムサイズが制限されるため、 - 3.7未満kbの¹¹ -レポーター遺伝子の大きさはできるだけ短くあるべきです。また、ウイルスの複製に必須であるゲノム全体に散在複数のシスエレメントの存在が、中に利用可能な位置を制限しますゲノムへのレポーター遺伝子のsertion。いくつかの報告は、HBVゲノム^11、12、13に、HIV-1 Tatの、緑色蛍光タンパク質、およびDsRedを含む、外来遺伝子を挿入することを試みてきました。しかしながら、これらの組換えHBVSはHBV感染/複製をスクリーニングするための、またはHBV感染/複製に影響する因子のハイスループットスクリーニングのために有用ではありません。これは主に、組換えウイルスの低い生産性と非効率的なウイルス産生によって引き起こされるレポーター遺伝子の発現の低減強度です。

これらの問題を克服するために、我々は、ウイルス産生の高収率でレポーターHBVを構築しました。このウイルスは、エントリからの転写に、HBVの複製サイクルの初期段階を監視するのに非常に敏感です。それは小さい（171アミノ酸）であるため、これを達成するために、NanoLuc（NL）をマーカー遺伝子として選択した蛍光レポーターを操作クラス= "外部参照"> 14。また、NLは約ホタルまたはウミシイタケルシフェラーゼよりも明るく150倍、および発光反応が偽ヒット率が高スループットスクリーニングのために低くなることを示唆し、ATP非依存です。組換えHBVの生産効率は約1/5、親HBVの、および以前のHBV組換えウイルスについて報告されたレベルに似ています。それは、抗HBV剤のマススクリーニングのために使用することができるように、しかし、NLの輝度は、ウイルス生産性の問題を克服します。

初代肝細胞を用いて抗HBV剤のスクリーニングは、HepaRG、HepAD38とNTCP形質導入した肝細胞は、従来の方法（複数可）による抗HBV剤のスクリーニングに有用であるかもしれません。しかしながら、ここで説明するシステムは、簡単な取り扱い、高感度、およびスクリーニングのための低コストのような種々の利点を有します。これらの利点は、治療目的のために新たなHBV剤を開発し、同定するためのハイスループットアッセイに適しています。

レポータータンパク質をコードする組換えHBVの1.生産

1. HepG2細胞の調製
   1. 細胞培養培地を準備し（10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、及び100 U / mlの非必須アミノ酸）。
   2. 培養液10mlのトランスフェクションの前日で10 cmのコラーゲンコートディッシュでプレート4×10 ⁶ HepG2細胞。加湿5％CO ₂インキュベーター中37℃でHepG2細胞をインキュベートします。
      注：約4×10 ^6個のHepG2細胞を培養培地10ml中10cmのコラーゲンコートディッシュに播種されている場合、それらは次の日に70〜90％コンフルエントとなります。
2. トランスフェクション
   1. トランスフェクションを使用してpUC1.2HBV / NL ¹⁵のpUC1.2HBVデルタイプシロン¹⁵および5μg5μgのでトランスフェHepG2細胞製造元の指示に従って試薬。
   2. 翌日、培地を除去し、新鮮な培養培地10mlを追加します。
   3. 一週間は、トランスフェクション後、50ミリリットルチューブに組換えHBVを含む培地を転送し、1.3.1に進みます。トランスフェクトされた細胞を含むプレートに新鮮な培養培地の10ミリリットルを追加します。
      注：組換えHBVの産生は4週間維持されます。組換えHBVを含む培養培地は、1ヶ月間、4℃で保存することができます。
3. 組換えHBVの精製
   1. 遠心分離による組換えHBV（5分間、2300×gで）を含有する培養培地から細胞破片を除去します。
   2. 0.45μmのメンブレンフィルターを通して上清を渡します。
   3. 培地に26％PEG / 1.5MのNaClを（130 gのNaClを49 gの0.5 M EDTAをpH8.0の1mlの1 M HEPES pHを5 mlの7.6 500 mlのポリエチレングリコール6000）の等量を追加含有する組換えHBV、穏やかに混合します。 4℃で一晩インキュベートします。
   4. 4℃で20分間、2300×gで遠心分離します。
   5. 上清を捨て、TNE（10mMトリス、50mMのNaCl、1mMのEDTA）0.5mlにペレットを溶解します。
   6. 5分間、2300×gで遠心分離することによってゴミを取り除きます。
   7. TNE 0.8 mlの20％スクロースにロード組換えHBVを含むTNEの0.5ミリリットル。
   8. 15℃で3時間、100,000×gで遠心分離します。
   9. できるだけ上清の限りを捨て、ペレットを保存します。培地を開始40mlのあたりの無血清DMEM 1ml中に再懸濁します。
   10. 4℃で一晩インキュベートします。
   11. 0.45μmのフィルターを通して濾過。 -80℃で0.5ミリリットルのアリコートとストアを準備します。
       注：元のウイルスサンプルのレポータータンパク質の汚染が観察された場合、2時間を100,000×gでTNE 5〜30％のショ糖密度勾配超遠心分離によってウイルスを精製する、または往復のCsCl密度平衡化し、遠心分離50時間150,000×gでメートル1.1〜1.6グラム/ミリリットル。

組換えHBVの2.感染

1. 10％FBS、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、250 / mlのG-418及び100 U / mlを補充したDMEM中のHBV感染に感受性である安定NTCP（HepG2細胞/ ^NTCP）15を発現^する培養HepG2細胞加湿5％CO ₂インキュベーター中で37℃で非必須アミノ酸。
2. 感染の1日前に、プレートは約5×10 ⁴のHepG2 /培地の0.1ミリリットルで96穴コラーゲンコートプレートにNTCP細胞^14。
3. 37℃の水浴中で解凍組換えHBVバイアルに残っている氷の小さなビットがあるまで。
4. 以下を組み合わせることによって感染するための媒体を準備：1×リン酸で40％PEG800010μlの緩衝生理食塩水（PBS）、ジメチルスルホキシド（DMSO）2μlの、組換えHBV10μlの、新鮮な培養液の78μlの96ウェルプレートのウェルあたり。
5. 96ウェルプレートの1ウェルに組換えHBV溶液100μlを加えます。
6. ある日感染後、ウイルス画分から汚染レポータータンパク質を除去するために、ウェルあたり300μlのPBSに感染した細胞を3回洗浄します。
7. 1週間またはそれ以下の場合は2％のDMSOを含む培地200μlに感染した細胞をインキュベートします。

3.分析

1. 一週間感染後、PBSに感染した細胞を3回洗浄します。
2. 感染細胞を溶解緩衝液50μlを加えます。
3. 5分間培養プレートをロックし、その後5分間2000×gで遠心します。
4. ルミノメータープレートにレポーター基質50μlのを追加します。
5. レポーター基質を含むルミノメータープレートに細胞溶解物の20μlのを追加します。簡単にボルテックスで混和します。
6. ルミノメーターでプレートを置き^、15を読ん^で開始します。

図1は、ゲノム上のHBVゲノム、転写されたRNA、ウイルスタンパク質およびそのコード領域の概略図を示します。ゲノム中のレポーター遺伝子とその位置も示されています。 図2は、レポーター遺伝子を含むHBVレポータープラスミドとヘルパープラスミドを示します。 pUC1.2HBV / NLレポーターはpUC1.2HBV 16のプレコアmRNAの転写開始部位から223から811ヌクレオチド位置を削除した後、レポーター遺伝子を挿入することによって構築しました。キャプシド形成シグナル配列における点突然変異を有するpUC1.2HBVdeltaは、部位特異的突然変異誘発PCRによって生成されました。レポータープラスミド（pUC1.2HBV / NL）とヘルパープラスミド（pUC1.2HBVdelta）はヒン DIIIおよびEcoRIで消化し、次いでゲル電気泳動に供しました。 pUCプラスミドのための3.0キロバイトと1.2HBV / NLまたは1.2HBVdelta用3.5キロバイトである期待のバンドは、 図に示されていますUREの2B。 図3は、組換えHBVに感染しNTCPを発現しているHepG2細胞を示しています。安定NTCPを発現するHepG2細胞を確立するために、HepG2細胞をpCAN-NTCP-MYCエンコーディングNTCP-mycおよびネオマイシン耐性遺伝子でトランスフェクトしました。 G418耐性細胞クローンを選択し、増殖させました。 HepG2細胞-NTCP-MYC-clone22は、HBV感染に感受性です。 HepG2細胞またはHepG2細胞-NTCP-MYC-clone22の溶解物をウェスタンブロッティングに供しました。 NTCPは2つのN結合型グリコシル化部位（Asn5及びAsn11）を含む細胞外N末端で349アミノ酸の糖タンパク質です。非グリコシル化NTCPの43 kDaのバンドおよびグリコシル化された10の65 kDaのバンドは、図3Aに示されています。 HepG2細胞-NTCP-MYC-clone22 NTCPを発現する細胞ではなく、HepG2細胞は、組換えHBV感染に感受性でした。 図4は、組換えHBVに感染したHepG2-NTCP-MYCクローンにおけるレポーター遺伝子の動態（A及びB）、ウイルスRNAおよびDNA（A）のレベルを示します図22（A）またはヒト初代肝細胞（PHH）細胞（B）。 HBV RNA、レポーター活性のレベルは、HepG2細胞-NTCP-MYC-clone22またはPHH細胞における感染後3日目に上昇しました。組換えHBVは細胞内のDNA複製経路において重要な役割を果たしている機能コアおよびpolために欠損しているのでこれとは対照的に、感染後9日目にDNAレベルでの変化はなかったです。 図5は 、B型肝炎免疫グロブリン（HBIG）、ヘパリンおよびIFN-βによる組換えHBVの阻害を示します。 IFN-βが1000 U / mlの50％未満によってレポーター活性を抑制しつつ、そのようなHBIGおよびヘパリンなどの侵入阻害剤が強く、それぞれ、75 U / mlおよび150 U / mlの10％未満によってレポーター活性を抑制しました。これらの阻害剤の阻害効果は、用量依存的でした。 図6は、HBVのライフサイクルを示しています。

Fiのグレ1：HBVゲノムとゲノム上のウイルスRNAとタンパク質の相対的な位置の概略図。 HBVのDNAは、黒でアークによって示されています。円弧上のウィルスRNAの転写のためのエンハンサーおよびプロモーターの位置は黄色で示されています。ゲノム上のウイルスRNAおよびタンパク質の位置はそれぞれ、点線の青い線（RNA）で着色矢印（タンパク質）と矢印で表されています。ウイルスRNAはサイズによって区別される：3.5キロバイトと3.4キロバイトのmRNAはそれぞれ、プリコア/ CおよびプレゲノムRNA /コアを示し、2.5および2.1 kbのRNAはそれぞれ、プレS1およびプレS2 / Sを表し、0.8 kbのRNAは、X遺伝子17を示しています。レポーター遺伝子は、コアコード配列の関連するサイズで置換されています。レポーター遺伝子は、エンハンサーIIを含有するコ​​アプロモーターによって駆動されます。プロ：プロプロモーター、EnhI /：エンハンサーI /プロモーター、EnhII /プロ：EnhancerII /プロモーター、ポル：ポリメラーゼ、S：表面抗原。ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：組換えHBVの生成のための回路図。 （A）ブルーラインは、プレゲノムのRNAを示しています。 ""ストレッチは、3 '末端にポリAを表します。青いボックスは、それぞれのウイルスタンパク質のコード領域を示します。赤いボックスは、独自の開始コドンから翻訳レポーター遺伝子を示しています。レポータープラスミドは、プレコアとポルを生成することはできません、およびキャプシド信号に2変異を含むヘルパープラスミド（CTATGTCへCTGTGCC）は、すべてのHBVタンパク質を発現します。 E：キャプシド信号。 （B）レポータープラスミド、ヘルパープラスミド及びpUCプラスミドは、 エコ RI及びヒン DIIIで消化しました。これらの消化されたプラスミドをゲル電気泳動に供しました。広告/ 54849 / 54849fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3：組換えHBVはHepG2細胞NTCPを表現するに感染します。 （A）は、NTCPを発現する安定な細胞株は、3週間のG418を500μg/ mlの選択に続くMyc標識NTCPコードするプラスミドとHepG2細胞のトランスフェクションによって設立されました。 HepG2細胞におけるNTCP-mycのレベルの安定NTCP（HepG2細胞、NTCP-MYC-clone22）を発現する細胞を、抗Myc抗体（1,000倍希釈）を用いてウェスタンブロッティングによって決定しました。 （B）のHepG2-NTCP-Mycを-clone22細胞を、2％DMS​​O、4％PEG8000の存在下で、組換えHBVに感染させました。感染後72時間で、レポーター活性のレベルは、レポーターアッセイによって決定しました。結果は、3回の独立した実験を代表するものであり、エラーバーは番目の表示します手段の電子標準偏差。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4：組換えHBV感染の時間経過。 （A）のHepG2-NTCP-Mycを-clone22細胞を、2％DMS​​O、4％PEG8000の存在下で、組換えHBVに感染させました。 HBV感染のレベルは、感染後3,6または9日目にレポーター活性（黒線）により決定しました。 HBV RNA（青線）とDNA（オレンジ色のライン）のレベルは、同時に各感染の時点で、それぞれ、RT-PCRおよびPCR 15によって測定しました。 （B）PHHを接種したウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータートランスジェニック/ SCIDマウスから単離し、presenc組換えHBVを感染させた初代ヒト肝細胞（PHH）、2％DMS​​O、4％PEG8000の電子。 HBV感染のレベルは、感染後3,6、または9日目にレポーター活性によって決定しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5：組換えHBV感染上の既知の抗HBV剤の効果。 HepG2細胞-NTCP-Mycを-22細胞は、組換えHBIG、示された用量でのヘパリンおよびIFN-βの存在下でHBV、ならびに2％DMS​​O、4％PEG8000を感染させました。 HBV複製（A）及び細胞生存率（B）のレベルは、6日目、感染後にレポーター活性によって決定しました。 HBIGは、HBV感染を中和し、ヘパリンがエンベロープウイルスの阻害剤である抗体です。結果は、3回の独立した実験、およびエラーバーの代表であります平均の標準偏差を示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6：HBVのライフサイクルの模式図。 HBVはNTCPなどのウイルス受容体を介して細胞内に入ります。キャプシド関連弛緩した環状DNA（rcDNA）がコーティングされていないで、核内の共有結合閉環状DNA（cccDNA）に変換します。 mRNA転写のためのテンプレートとしてcccDNA機能。ゲノムRNAは、コア及びpolのためのタンパク質で組み立てることによってウイルスキャプシドへキャプシドに包まれています。 HBSタンパク質と組み立てる前に、さらに、カプシドはプロセスによってHBV DNAを増幅に関与しているcccDNA複製プロセスと呼ばれます。 HBSタンパク質と組み立てられたウイルス粒子は、最終的に細胞外に放出されます。オム/ファイル/ ftp_upload / 54849 / 54849fig6large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。