方法論記事

定量的3Dインシリコモデリング（q3DISM）

DOI：

10.3791/54868

⸱

2016年12月26日

 ,  , 
1Zilkha Neurogenetic Institute, University of Southern California (USC)

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、アルツハイマー病のげっ歯類モデルにおいて単核食細胞によって脳アミロイドβ（Aβ）食作用のインシリコモデリング （q3DISM） で定量的な3Dのための方法論を開発しました。この方法は、 インビボで実質的に任意の食イベントの定量のために一般化することができます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神経炎症は現在、神経変性疾患の主要な病因因子として認識されています。単核食細胞は、破片や残骸の食作用およびクリアランスを担当する自然免疫細胞です。これらの細胞は、CNS常駐ミクログリアとして知られるマクロファージ、および周囲から浸潤性単核食細胞が含まれます。光学顕微鏡は、一般に、齧歯類またはヒトの脳標本で食作用を視覚化するために使用されています。しかし、定性的な方法は、in vivo食作用の決定的な証拠を提供していません。ここでは、 シリコモデリング（q3DISM）、げっ歯類アルツハイマー病（AD）モデルにおける単核食細胞によるアミロイドβ（Aβ）食作用の真の3D定量化を可能にする堅牢な方法で定量的な3Dを説明します。この方法は、蛍光齧歯類の脳切片におけるファゴリソソーム内にカプセル化Aβを可視化することを含みます。大型のz次元共焦点のデータセットは、その後、3Dは、A＆の定量のために再構築されます＃946;空間的にファゴリソソーム内で共局在。我々は、マウスおよびラットの脳にq3DISMの適用が成功を実証したが、この方法論は、任意の組織で事実上すべての貪食イベントに拡張することができます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

アルツハイマー病（AD）、最も一般的な加齢に関連する認知症1は 、「老人」βアミロイド斑、慢性低レベルの神経炎症、タウオパチー、神経細胞の喪失、および認知障害2などの脳アミロイドβ（Aβ）の蓄積によって特徴付けられます。 （末梢起源対それらの中心は依然として不明であるものの、ミクログリアと呼ばれる）は、AD患者の脳では、神経炎症がAβ沈着物3を取り囲む反応性星状細胞および単核食細胞によって計上されています。 CNSの自然免疫番人として、ミクログリアは中心部の脳Aβをクリアするように配置されています。しかし、Aβプラークのミクログリアの募集は、もしあれば、非常に少ないのAβ貪食4,5を伴っています。 1つの仮説は、ミクログリアがAβの小さなアセンブリをphagocytozingことで、最初は神経保護的であるということです。しかし、最終的にこれらの細胞は圧倒的なAβ負荷および/または年齢関連機能dと神経毒性になりますecline、神経毒性および認知機能の低下6に貢献し、機能不全の前炎症性表現型へのミクログリアを引き起こします。

最近のゲノムワイド関連研究（GWAS）貪食8-11を調節コア先天性免疫経路7に属するADのリスク対立遺伝子のクラスターを同定しました。その結果、脳アミロイド沈着に対する免疫応答は、ADの病因を理解するという点で、および12月14日 、新しい治療法を開発するために、両方の、関心の主要なエリアとなっています。しかし、 生体内でのAβ食作用を評価するための方法論のための重要な必要性があります。この満たされていないニーズに対処するために、我々は、アルツハイマー様疾患のげっ歯類モデルにおいて単核食細胞によって脳のAβ食作用の真の3D定量を可能にするためにシリコモデリング（q3DISM） で定量的な3Dを開発しました。

それらは、動物モデルは、疾患を有する再現する程度によってのみ制限ADのpathoetiologyを理解するために、実験治療法を評価するための貴重な実証済み。プレセニリン（PS）及びアミロイド前駆体タンパク質（APP）遺伝子における変異は、独立して、常染色体優性ADを引き起こすという事実のため、これらの変異導入遺伝子は、広範ジェニック齧歯類モデルを生成するために使用されてきました。同時に「スウェーデン」変異ヒトAPP（APPのSWE）と加速脳アミロイドーシス及び神経炎症15,16を備えた本Δエクソン9変異ヒトプレセニリン1（PS1ΔE9）を共発現するトランスジェニックAPP / PS1マウス。さらに、我々は、（フィッシャー344背景にラインTgF344-AD）のAPP SWEとPS1ΔE9構築物で同時注入二重トランスジェニックラットを生成しました。脳アミロイドーシスのトランスジェニックマウスモデルとは異なり、TgF344-ADラットはタウオパチー、神経細胞のアポトーシス損失、および行動障害17の前脳アミロイドを開発します。

本稿では、IMMのためのプロトコルを記述しますミクログリア、APP / PS1マウスとTgF344-ADラットからの脳切片におけるファゴリソソームおよびAβ沈着物、および大のz次元共焦点画像の取得をunostaining。 シリコ世代とミクログリアのファゴリソソームにAβの取り込みの定量化を可能にする共焦点データセットから真の3D再構成の分析で私たちは、詳細。より広義には、ここでは詳細を、我々の方法は、 インビボでの食作用の実質的に任意の形状を定量化するために使用することができます。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

研究倫理の声明：本明細書に詳述動物に関わる全ての実験は、南カリフォルニア制度動物実験委員会（IACUC）の大学によって承認され、研究室の評価および認定協会からの国民健康ガイドラインの研究所や勧告に厳密に従って行きましたアニマルケア国際。

1.齧歯類の脳の単離と免疫染色のための準備

1日目：

  1. 連続深いイソフルラン麻酔（4％）の下で（12ヶ月齢）エージングTgF344-ADラット（14ヶ月齢）またはAPP / PS1マウスを置きます。つま先のピンチと引っ込め反射の欠如によって麻酔の深さを評価します。
  2. 胸郭の両側を切断し、心臓を露出するように持ち上げます。心臓の左心室に23 G針を挿入し、右心房に小さな切開を行います。氷冷リン酸緩衝生理食塩水でtranscardial灌流によって放血に進みます（PBS）蠕動ポンプ（マウス用の30ミリリットル、150 - ラットでは200ミリリットル）を使用。
  3. 皮膚に尾側正中切開を行い、脇の皮膚や筋肉を動かします。正中線に沿って頭蓋骨の上部を通過し、目の間にカットします。骨プレートを取り外して、頭蓋骨から脳全体を隔離します。
  4. 冠状齧歯類の脳マトリックス中に脳を置き、四半期にそれをスライス。 4℃でパラホルムアルデヒド固定液（PBS中の4％PFA）で後部四半期O / N（16時間）インキュベートします。その後、洗浄PBSで3倍、および70％エタノールに移します。注意：PFAは毒性があり、適切な個人保護装置を有する化学フードの下で処理する必要があります。

2日目：

  1. カセットを埋め込むに脳の四半期を置き、次第に順次より濃縮1時間エタノール浴中の組織（70％、80％、95％、および100％×3）を脱水。
  2. 3つの連続した100％のキシレン浴（1時間毎）で組織から明らかエタノール。注意：キシレンは、毒性およびSHであります適切な個人保護装置を有する化学フードの下に扱うことウルド。
  3. 2溶融パラフィンワックス槽後のパラフィンブロックに埋め込む組織（56から58°C、90分ごと）。

3日目：

  1. ミクロトームを用いてパラフィン包埋脳の10μmの厚さの切片をカット。ディップセクション水浴（1分間50°C）へとスライドを顕微鏡に適用されます。スライドに組織接着性を確保、O / Nを乾燥させるためにスライドを残します。

2.免疫染色

注：抗体の異なる組み合わせは、後述する染色手順のために利用することができます。ラットおよびマウスの脳組織と適合する抗体カクテルは、 表1に記載されています。

4日目：

  1. 2×100％キシレン浴（12分毎）を用いて脱パラフィン脳切片。
  2. 連続エタノール浴中で脳切片を再水和 - 100％10分間、5分間、95％、10分間、80％、および15分間、最後に70％ - followe3倍PBS洗浄[光攪拌しながら室温で5分、]により、D。一方、95への熱の抗原回復溶液 - 磁気攪拌棒でホットプレート上で97°C。
  3. 30分間97°C - 95での抗原回復溶液に脳切片をインキュベートします。その後、PBSで3回洗浄（光攪拌しながら室温で5分間、）。
  4. 組織の乾燥を避けるため、および疎水性バリアペンで組織領域の周りに疎水性の障壁を描画するために繊細なタスクワイパーを使って素早く乾燥スライド。ブロッキング緩衝液で囲まれた組織領域を埋める[PBS 0.3％トリトンX-100および10％正常ロバ血清（NDS）を含む]、加湿チャンバー内で室温で1時間インキュベートします。
  5. 単核食細胞を標識し、加湿チャンバー内で4℃でO / Nインキュベートし（ブロッキング緩衝液で希釈）IBA1一次抗体でブロッキング緩衝液交換してください。抗体のホストと作業希釈液については、 表1および材料の表を参照してください。

5日目：

  1. リンス3倍PBS風呂で一次抗体（光攪拌しながら室温で5分）。 3倍PBS浴場（光攪拌しながら室温で5分間）に続いて（暗所で室温でブロッキング緩衝液中で）1時間（594 nm放射蛍光団と結合した）蛍光二次抗体とインキュベートします。このとき、蛍光シグナルの漂白を避けるために、暗闇の中でセクションを維持します。

DAY 6から7：

  1. 繰り返しは、ファゴリソソームを標識するCD68（ラット脳）またはLAMP1（マウス組織）抗体および（488nmの発光蛍光体で結合された）適切な二次抗体を用いて2.5＆2.6を繰り返します。

DAY 7から8：

  1. 繰り返しは、Aβ沈着を標識する（647 nmの蛍光団に結合された）OC（ラット組織）または4G8（マウスの脳）抗体および適切な二次抗体と2.5＆2.6繰り返します。
    注：また、6E10抗体は、マウスおよびラット組織で正常に両方を使用することができます。適切な抗体の組み合わせについては、 材料の表を参照してください。 オング。
  2. セクションでは、暗所で室温で完全に乾燥O / Nすることを可能にします。その後、DAPIを含む蛍光マウント媒体によって封止されたカバースリップで標本をカバーしています。

大Zスタック共焦点データセットの3買収

注：このプロトコルは、60X対物レンズと405 nmの、488 nmの、594 nmの、および647 nmのレーザーを搭載した完全に自動化されたレーザー走査型共焦点顕微鏡を必要とします。すべての装置は、画像及びレーザ制御ソフトウェアで制御するコンピュータです。撮影プロトコル、コンピュータの電源をオン、落射蛍光ランプ、顕微鏡、レーザーとカメラを開始する前に。

DAY 9：

  1. 60X顕微鏡の対物レンズを選択します。レンズにイマージョンオイルを追加し、顕微鏡ステージのスライドホルダーにサンプルを配置します。オイルがスライドに接触するまで目的を上げます。接眼レンズを通して落射照明を使用して、海馬や大脳皮質におけるアミロイド斑を見つけるために焦点面を調整します。
  2. 共焦点イムを買収共焦点顕微鏡によって、げっ歯類の海馬や大脳皮質におけるアミロイド沈着を囲む活性化した単核食細胞の年齢（60X倍率、zスタックのステップ：0.25μmの

4. q3DISM

注：有意な結果を得るために、我々は、関心のある動物/領域当たり3画像の最小値を分析することを示唆しています。各画像について、分析する細胞の存在量は、実験パラダイムによって異なる場合があります。この報告書に示されている代表的な結果では、我々は（ 例えば 、単核食細胞から離れまたはプラークに関連した、 図1Cを参照してください- Dおよび2C - D）3細胞/条件を分析しました。

DAY 10：

  1. 科学的な3D画像処理と解析ソフトウェア共局在（coloc）同時にすべてのz平面でIBA1 / CD68（ラット組織）またはIBA1 / LAMP1（マウス組織）染色の空間的に近接するためのモジュールとの共焦点データセットを分析します。伊庭+ / CD68 +または活性化単核食細胞内のファゴリソソームに対応伊庭+ / LAMP1 +共局在化チャネルを作成します。
    1. チャネルB（CD68または488 nmの蛍光体で結合されたランプ1染色に対応する）のために、チャネルA（594 nmの蛍光体で結合されたIBA1染色に相当）およびFITC用のTRITCを選択します。 「モードチェック、「選択」のしきい値を、 'のとするためのソフトウェアのウィンドウの右側には「coloc強度、' 'ソースチャンネル」を選択します。
    2. ソフトウェアのウィンドウの右側にある「coloc色」を選択する[編集]をクリックします。
    3. 独立チャネルごとに、特異的な染色を含み、バックグラウンド/非特定の信号を除外するようにしきい値を調整します。調整後は、公平な分析を確実にするために、画像間のしきい値を変更しないでください。共局在ボクセル（すべてのz-スタックからのピクセル）は、すべてのzスタックSIMのステップ4.1.2で選択した色で表示されますultaneously。
    4. 「colocチャネルを構築する」をクリックします。作成された共局在チャネルが表示調整ウィンドウに表示されます。
    5. チャネル統計を開くためにcolocチャンネルをクリックします。 「共局在閾値以上のボリューム/材料Aの％は、「LAMP1またはCD68のシグナル（488 nmの蛍光団に対応するボクセル）と共局在IBA1信号（594 nmの蛍光団に対応するボクセル）の％を表します。より簡単には、これは、ファゴリソソーム（ 図1Cおよび2Cを参照）によって占有される単球の体積です。
      注：「共局在した閾値以上のボリューム/材料Bの％は「IBA1と共局在LAMP1またはCD68シグナルの％に相当します。ファゴリソソームは細胞内構造であるので、これは、100％に近いものでなければなりません。値は、共局在しきい値以上のすべてのz-スタックからの信号の比に基づいています。
  2. colocモジュールを使用して、OC（ラットTIと空間的に近接するため、ステップ4.1で作成したcolocチャネルを分析しますssue）または4G8（マウス組織）Aβ信号。これは、ファゴリソソーム内にカプセル化Aβの定量を可能にします。
    1. （647 nmの蛍光団に結合されたOCまたは4G8染色に対応する）チャネルBのためのチャネル（ステップ4.1で作成したIBA1 / CD68またはIBA1 / LAMP1のcolocチャンネルに対応する）colocデータセットおよびCy5を選択します。
    2. ステップ4.1.5に4.1.2で説明したようにcolocチャネルを構築します。
    3. チャネル統計を開くためにcolocチャンネルをクリックします。 「共局在閾値以上のボリューム/材料Aの％は「IBA1 / LAMP1またはIBA1 / CD68の％を表す（ステップ4.1.5で構築されたcolocチャネルに対応するボクセルを。）OCまたは4G8信号と共局在（647に対応するボクセルnmの蛍光団）。これは、Aβ（ 図1Dおよび2Dを参照）によって占有されるファゴリソソームボリュームです。
      注：「共局在した閾値以上のボリューム/材料Bの％は、「ファゴリソソームと共局在総Aβシグナルの％に相当します。これは、ファゴリソソーム内でカプセル化された総Aβ沈着物（本代表的な結果は示されていない）の一部を評価することができます。
  3. 共焦点画像スタックを再構築し、単球のファゴリソソーム内に封入されたAβの3Dモデルを生成するために上回るモジュールを使用してください。
    1. 「表示調整」ウィンドウで、（のみIBA1染色を示すために）TRITCを選択します。 「ボリュームのプロパティ」ウィンドウで、「新しい面を追加」をクリックします。
    2. 「1/5のアルゴリズム」、ステップで「設定」、「表面を]を選択します。また、中に「色、 '（赤が図1Bおよび図2Bに60％の透明度に設定されている）、パレットまたはRGBの色の種類を選択して、透明度を調整します。ボックスにチェックを入れ「関心領域を選択します」。 [次へ]をクリック。
    3. ステップの関心の2/5の領域、「xは、yの調整することにより、目的の細胞の周りに窓を描き、z座標は、（ 図1A中の白いボックスを参照してくださいおよび2A）。 [次へ]をクリック。
    4. ステップ "3/5ソースチャンネル」では、TRITCのソースチャンネルを選択します。 '、スムーズ」ボックスをチェックし、0.4μmの表面積の詳細レベルを設定します。 「しきい値、 'の絶対強度を選択します。 [次へ]をクリック。
    5. ステップ "4/5しきい値、「作成されたボリュームは、TRITCチャネル信号と完全に重なるようにしきい値を調整します。 [次へ]をクリック。
    6. ステップに含めるか、または作成されるボリュームから除外されるように、その大きさに応じてオブジェクトを選択」、フィルタタイプ」セクションの「5/5の表面を、分類します」。 、[完了]をクリックし、すべての創造のステップを実行し、ウィザードを終了します。
    7. 繰り返しは、FITCチャネル（LAMP1 +またはCD68 +ファゴリソソーム）用の3D表面を作成するために、4.3.6に4.3.1を繰り返します。
    8. 繰り返しは、Cy5のチャネル（OC +または4G8 +Aβ沈着）のための3D表面を作成するために、4.3.6に4.3.1を繰り返します。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

上記で詳述しq3DISMのための多段階方法論を使用して、我々はAPP / PS1マウス（ 図1）とTgF344-ADラットの脳における単球のファゴリソソーム（ 図2）にAβの取り込みを定量化することができます。したがって、q3DISMの方法論は、ADのマウスおよびラットモデルにおける単核食細胞の解析を可能にしました。興味深いことに、CD68 +ファゴリソソームの占有体積を大幅APP / PS1マウス（ 図1B、C）およびTgF344-ADラット（ 図2B、C）の両方のプラークから遠くに比べに関連付けIBA1 +単核食細胞で増加します。これらのデータは、プラークの近くに、単核食細胞が離れたプラークから位置する細胞に比べて食作用のために態勢を整えていることを示しています。異なるAβ配座異性体を染色からのデータの範囲を示すために、我々は、マウスおよびラットの組織における様々な抗体を用い...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々は、単核食細胞によりin vivoでのAβ食作用の真の3D定量化のために、この報告書に記載したプロトコルは、特定の細胞と細胞内区画の標識だけでなく、Aβ沈着に依存しています。具体的には、脳単核食細胞を染色するためにIBA1（イオン化カルシウムの結合アダプター分子1）、細胞の活性化18、19時に細胞膜の波打ち現象および食作用に関与するタンパク質を、使用しています。 IBA1 +細胞は、一般的に脳常駐ミクログリアとみなされているが、それは末梢浸潤性単核食細胞は、免疫標識細胞のサブセットを含んでいる可能性が残っています。 LAMP1 20またはCD68 21：細胞内のファゴリソソームは、リソソーム/エンドソーム関連膜糖タンパク質（LAMP）ファミリーのメンバーを認識する抗体を用いて明らかにされています。後者は主として細胞sに循環小さい画分と、リソソームおよびエンドソームに局在していますurface。 （ 表1参照）LAMP1およびCD68抗体は、正常ラットお...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M-V.G-S.は、BrightFocus Foundation Alzheimer's Disease Research Fellowship Award(A2015309F)およびAlzheimer's Association, California Southland Chapter Young Investigator Awardの支援を受けています。TMWは、ARCS財団とジョン・ダグラス・フレンチ・アルツハイマー財団のマギー・マクナイト・ラッセル・JDFAFメモリアル・ポスドク・フェローシップの支援を受けています。本研究は、National Institute on Neurologic Disorders and Stroke(1R01NS076794-01、T.T.へ)、Alzheimer's Association Zenith Fellows Award(ZEN-10-174633、T.T.へ)、American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research(M11472、T.T.へ)の支援を受けました。この作業を可能にしてくれたZilkha Neurogenetic Instituteからのスタートアップ資金に感謝しています。 

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
イソフルランAbbottNDC 0044-5260-05
解剖ハサミVWR82027-582
解剖ハサミ ブラントチップVWR82027-588
ピンセットVWR94024-408
23 G 針VWRBD305145
蠕動ポンプ FH10Thermo Scientific72-310-010
PBS 10xBioland ScientificPBS01-02リン酸緩衝生理食塩水;作業濃度 1x
成体マウス脳マトリックス、冠状スライス、ステンレス鋼 1 mm ケントサイエンティフィックRBMS-200C
成体ラット脳マトリックス、冠状スライス、ステンレス鋼1 mm ケント・サイエンティフィックRBMS-305C 
32%パラホルムアルデヒド水溶液(PFA)EMS15714-S注意:有毒。使用濃度:PBS
エタノールVWR89125-188様々な濃度、プロトコル
Tissue-TekユニカセットSakuraVWR25608-774
Embeddingおよび浸透パラフィンVWR15147-839
Microtome Leica RM2125Leica Biosystems
使い捨てミクロトームブレード VWR25608-964
ウォーターバス ライカ HI 1210ライカ バイオシステムズ
マイクロ スライド スーパーフロスト プラスVWR48311-703
キシレンシグマ-アルドリッチ534056-4X4L注意: 有毒 
ターゲット検索ソリューション 10xDAKOS1699作業濃度 1x
KimWipesVWR21905-026
疎水性PAPペンVWR95025-252
Triton X-100VWR97062-208
ノーマルロバ血清(NDS)ジャクソンイムノ017-000-121
カバースリップVWR48393081
DAPIライフテクノロジーP36935
ガラススライドラック
バ1抗体(ポリクローナル、ウサギ)ワコー019-19741 作業集中力 1:200
Iba1抗体(ポリクローナル、ヤギ)LifeSpan BioscienceLS-B2645使用濃度1:200
ラットCD68 [KP1]抗体(モノクローナル、マウス)Abcamab955使用濃度1:200
マウスCD68 [FA-11]抗体(モノクローナル、ラット)Abcamab53444使用濃度1:200
マウスCD107a(LAMP1)抗体(モノクローナル、ラット)Affymetrix14-1071使用濃度 1:100
ベータアミロイド、17 - 24 (4G8) 抗体 (モノクローナル、マウス)コーヴァンスSIG-39220使用濃度 1:200
ベータアミロイド、1 - 16 (6E10) 抗体 (モノクローナル、マウス)コーヴァンスSIG-39320使用濃度 1:200
OC 抗体 (ポリクローナル、ウサギ). H. Cribbs および C. G. Glabe (カリフォルニア大学アーバイン校)使用濃度 1:200
Alexa Fluor 488 マウス二次抗体InvitrogenA-11001使用濃度 1:1,000
Alexa Fluor 488 ラット二次抗体InvitrogenA-11006使用濃度 1:1,000
Alexa Fluor 594 ウサギ二次抗体InvitrogenA-11037使用濃度 1:1,000
Alexa Fluor 594 ヤギ二次抗体InvitrogenA-11080使用濃度 1:1,000
Alexa Fluor 647 マウス二次抗体InvitrogenA-21235使用濃度 1:1,000
Alexa Fluor 647 ウサギ二次抗体InvitrogenA-21443使用濃度 1:1,000
イマージョンオイルニコン 
A1 共焦点顕微鏡ニコン 
NIS Elements 先端研究用ソフトウェアニコン 
Imaris:Bitplaneソフトウェアバージョン7.6Bitplaneの「coloc」および「supass」モジュールを使用しています。 あるいは、オープンソースのフリーウェア ImageJはコローカライゼーションに使用できます 共焦点Zスタックデータセットの分析。
中の4% ズVWR100492-942イD

参考文献

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