修正されたMicroSecureガラス化：人間の胚盤胞のための、安全なシンプルで非常に効果的な凍結保存手順

Summary

MicroSecure ガラス固化は、FDAの適正製造および組織取り扱い慣行に準拠した非商用の無菌閉鎖ガラス固化装置システムとして開発されました。疎水性のプラグ付き胚ストローが業界から撤退したため、ガラス化手順は、標準の内部綿プラグの前に内部シールを含めるように変更されました。

Abstract

臨床胚ガラス化は、「オープン」システム（ すなわち、直接LN ₂接点）での超急速冷却がガラス化の成功を最適化するために必要であったことを^21世紀のユニークなガラス化装置の開発をし、誤解と進化しました。冷却速度の重要性を取り巻くドグマは、重要な品質制御因子（ 例えば、使いやすさ、再現性、信頼性、ラベリングセキュリティ、およびストレージの安全性を）無視技術的変化へとガラス化装置の作成の対象と危険な慣行につながりました。イントラおよびインター技師変動を最小限に抑えることを目的と、安全・安心、再現性、および信頼性の高いμS-VTF法の開発のために許可された他の機器の品質管理の欠陥を理解します。内在化、2色、改ざん-pの1）0.3-mLのアイオノマー樹脂胚わら：同様に重要な、それは2つの既存のFDA準拠デバイスの可用性を組み合わせました反復可能な溶接シール可能性のある屋根の標識;直接非常に効果の高いグローバルなガラス化デバイスを作成するために、胚（複数可）をロードすると、2）短く、一般的に使用され、300μmのID滅菌flexipettes。他の無菌と同様に、ガラス固化システム（ 例えば、高セキュリティガラス化（HSV）、ラピッドI、およびVitriSafe）効果的に生殖医療で使用される閉じ、microSecureガラス化（μS-VTF）が、それが高いポスト温暖化の生存と妊娠を達成することができることを証明しましたそのシンプルさへのこだわり、そして縮小技術的な変化と成果。内部の疎水性のプラグを含む0.3 mLの胚のストローは、商業的に綿ポリビニルピロリドン（PVP）のプラグを有する標準精液ストローで置換したが、溶接密封を確実にするために、そのアイオノマー樹脂組成物を維持しました。しかし、綿プラグが接触した際にflexipettesの流体胚の内容を吸い上げることができます。修正されたμS-VTF方法は、追加の内部溶接部を含むように適合されましたデバイスの負荷側のプラグの前に密封します。高い生存率（> 95％）と妊娠率が今日続けるようμS-VTF手順に追加された技術的なステップは、その成功のアプリケーションに影響を与えていません。

Introduction

ガラス化は、細胞質内精子注入の開発以来、 体外受精（IVF）業界で単一の最も影響力の生殖補助技術です。今日では、胚盤胞は、以前に、従来の低速凍結方法¹に関連付けられた胚の生存率の損失なしに凍結保存します。信頼性の高いポスト温暖化胚の生存と、不妊の業界は、従来の新鮮胚移植よりも同等以上の妊娠の転帰をもたらす凍結保存した胚移植サイクルの好ましい使用に転換されます。胚盤胞の生検および着床前遺伝子スクリーニング（PGS）との関連では、ガラス化が正倍数体の単一胚移植^2、3を介して健康的な出生の成果を最適化するために不可欠な臨床ツールとなっています。

マウス胚のガラス化は^、1980年代半ば⁴で開発されました ⁵年と1990年⁶により畜産に適応。ガラス化溶液は、氷結晶形成を損傷のない、準安定glasseous状態を形成することを前提に基づいて、より効率的に胚の完全な細胞の完全性を維持することが証明されています。興味深いことに、ヒトの発生学へのガラス化の有望な受け入れは^、21世紀までに実現することを開始しませんでした。ガラス化の利用を促進する初期の刊行物は、ユニークな「オープン」システム・デバイス^7、8、9の開発と一致しました。それは遅い胚盤胞の凍結の改善にも発生した時に来たとしてしかし、臨床診療へのガラス化の採用は、遅かったです。成功し、従来の遅い速度の凍結は、ガラス化に加えて、だけでなく、incorporatで、胚培養システムの改善と整列させましたその後、栄養外胚葉の両方の全体的な生存を強化し、胞胚-崩壊のアプローチのイオン、注入^10。

最後の10年間で、ガラス固化技術が急速に従来の凍結慣行に取って代わりました。大幅に、これは特殊なガラス化デバイスの開発によるものでした。これらのデバイスのいくつかは、IVF産業¹¹内で使用されているデバイスに固有の設計上の欠陥を導入することにより、臨床ガラス化の全体的な安全性、効率性及び有効性をハンディいます。実際に、異なるデバイスのニュアンスは、一般に「技術的な署名^」12と呼ばれるプログラム間の重要な技術的変化を、ご紹介します。このように、科学雑誌は、可視化実験のジャーナル（Joveの）のように、結果のばらつきを低減するのに役立ちます技術的な詳細を、実証するための貴重な資源としての役割を果たすことができます。もう一つの継続的な問題は、sであります青梅胎生学者は、「オープンガラス化システム」における胚または卵母細胞の「超急速冷却（液体窒素（LN _2）を持つ、すなわち、直接胚の接触は）最適化するための前提条件であるという主張に基づいて、今日でも、誤解され続け成功率。」明らかに、この信念は、無菌の実証済みの成功に基づいて、不正確であるシステム^{13、14、15を}閉じました。

ガラス化のcryobiological原理に基づいて、ガラス化の効果は速度^{16、17、18の}冷却に比べて温暖化レートに、より大きく依存します。一般に、使用されるガラス化装置の独立した、加温速度は、高い生存率を保証するために冷却速度を超えなければなりません。高い温暖化率は、任意の氷の成長（ すなわち、recrの機会を最小限に抑えます温暖化の失透フェーズ中にクライオソリューション）中の有核の不純物のystallization。確かに、ガラス化溶液（ すなわち、タイプおよび使用される凍結保護剤の濃度）の安定性は、交絡効果を有することができるが、これは別のパブリケーション¹¹で対処されています。冷却加温速度の問題を考慮すると、MicroSecureガラス化（μS-VTF）ガラス化の品質管理の側面を最適化し、安価な、非商用、FDA準拠法として2008年に開発されました。それは、耐タンパ性を、内在化、二重色の標識を提供していることで独特でした。さらに、ロードおよびピペッティングのために使用される滅菌flexipetteに直接胚を保存する（ すなわち、二次デバイス表面にピペッティングせず）によると、完全に溶接シールが自動化されたシーラーを使用して、アイオノマー樹脂製のストローを使用することにより、技術的な変動が効果的に除去されています。

Cを評価する場合潜在的な使用のためのガラス固化装置のompleteness、などの考慮すべきであるいくつかの品質管理の要因がある：1） 標識化の可能性 -CANラベルが確実に接着させることは？彼らは不正開封防止していますか？彼らは、デュアル色識別の可能性を提供していますか？それは、二次ラベルを必要としない、とラベルは簡単に記録保持の目的のために取り外すことができる（ すなわち、患者確認）後の温暖化？ 2） 技術的な使いやすさ -CAN胚は簡単にタイムリーにデバイスに/にロードされ、簡単に識別され、後の温暖化を追跡することが？ 3） 手続きシンプルさ/再現性は、技術者（内部）とプログラム（外部）間の変動を最小限に抑えることが容易に再現することが可能ガラス化法オファーシンプルさと信頼性を、-Does？ 4）LN ₂の記憶容量を容易にかつ安全に取り扱われ、識別されるデバイスをれる-CAN？そのSTOです効率的な潜在的な空間を激怒？無菌閉鎖システムなどの物理的な損傷または可能な汚染物質からのデバイスのオファーのセキュリティと安全性をしていますか？ 5） 回復の可能性/耐障害 -Isデバイス胚の保証回復における潜在的な問題になりやすいデザイン、そして、彼らは確実にガラス化し、完全な細胞の完全性ポスト温暖化を維持するのだろうか？後者は特定の品質上の問題、回収率は、実際には、驚くべきことに公表された報告に最小化されています。これは、一般に、典型的に、良好な生存率の不利な結果（ すなわち、失われた胚または卵子を）隠すことによって行われます。一貫性のない回復（<99％）になりやすい任意のデバイスは真剣に欠陥があると手続き負債を構成しています。

私たちの無菌は、μS-VTF方法は戦略的に各品質管理対策を考慮して開発された閉じました。しかし、優れた臨床的成功と検証¹⁴の5年後、手続きはトンを持っていましたO修正すること。 （疎水性プラグを有する）元の0.3-mLの胚のストローは、IVF業界から除去し、標準的な綿/ PVP栓を有する0.3-mLの精液ストロー（ すなわち、精液/胚のストローとして再度ラベル付け）に置き換えられました。この手続き論文では、安全に、簡単に、かつ効果的μS-VTFを実装するために必要な具体的な手順と戦略の概要を説明します。代替理想的なわらのコンテナが臨床検査室に戻って再導入されるようにさらに、我々はそのような時間まで、確実に供給制限を考慮するために必要な修正（複数可）をハイライト表示します。

Protocol

μS-VTF手順の開発は人間の卵母細胞および胚の凍結保存に2008年から2009年（熱望IRB、サンティー、カリフォルニア州）で承認された治験審査委員会（IRB）の研究の一環として行われました。手順は、以来、定期的にインフォームドコンセントフォームに署名した不妊患者の臨床治療に応用されています。

1.品質管理の考慮事項

1. 患者を区別するために異なる色（ 例えば、ペン、ラベル、または識別（ID）ロッドまたはプラグ）を使用する場合は日中の胚の凍結保存に複数のグループが。
2. 患者ごとに異なる料理やピペットを使用してください。別の溶液から胚盤胞を移動するときに転送媒体の体積を最小化します。
3. わらまたはデバイスごとに1胚盤胞を凍結保存。無菌/滅菌技術を維持し、全ての安全注意に準拠しています。
4. 医師紹介フォームを確認し、initiatin前に患者の同意を締結グラム手続き。インベントリに患者の胚（複数可）の配置を確認してください。
5. 胚盤胞が別の施設に移送される場合、「トランスポートのための責任と同意のリリース "を使用してください。すべての署名がオンサイトまたは公証目撃されていることを確認してください。
6. バイオアッセイ、エンドトキシンの測定、および有効期限/ロット番号の確認と追跡を含め、必要に応じて、適切な媒体のための品質管理対策やタンパク質のサプリメントを確認してください。
7. <95％、生存率：<80％、および単一正倍数体胚盤胞を用いた臨床妊娠率：<50％、そのような回収率などの臨床凍結保存の成果のモニタリングと評価のための許容限界（懸念すなわち、低レベル）を、確立します。

2.凍結保存手順

1. 準備
   1. ワークシートと凍結保存データベースとインベントリログにデータを入力するなど、適切な事務処理を完了（S）。
   2. 新鮮凍結保存液を調製または商業的供給源（メーカーの推奨ストレージおよび貯蔵寿命条件を遵守）を使用します。
   3. わらの準備。
      1. 個別滅菌パケットのラベル側を開きます。パッケージに対してそれを把握し、部分的に持ち上げてわらを引き出すことにより、従来の0.3-mLの胚のストローで見つかった充填ノズルを外します。ストローは、プラスチックパッケージ内に無菌的にかかっている一方で、これは周囲条件にラベルの端を公開します。
         1. 0.3-mLの精液/胚のストローについて（変形）は、ダウン0.5cmにプラグを押してください。基本的な卓上インパルスシーラーを使用することにより、綿-PVP栓の前に内部シールを適用します。
         2. ちょうどプラグの正面に、電極のテフロン表面上にわらを設定します。熱を活性化するためのハンドルを押し下げます。赤色光が表示されたら、ハンドルを放します。十分フラッテ温度で完全な溶接シール、熱を確実にするために、nsの対向面は、その後、180°にわたってそれを反転し、必要に応じて反対側の面^19を再密封します。
   4. cryomarkerを使用して、各ストロー/デバイスにラベルを付け、患者名、一意のID番号（ 例えば、SSN、DOB、または患者ID番号）、および凍結の日付とcryogoblet。各ストロー/デバイス（ 例えば、1、2、3、 など ）に固有の番号が含まれます。
      1. 0.3-mLの胚のストローの中に挿入し、密封する色加重IDロッド上に（好ましくは着色された）ラベルを固定します。使用するまでその個々の滅菌包装にわらを返します。
         注：のみ30ミリメートル色加重IDロッドはIDロッドの各側に隣接する、2つのボールベアリングの追加挿入が必要とされ、利用可能な場合。
   5. ユニーク内接ID番号を持つ各杖を識別します。 LN ₂貯蔵タンクの数および各患者の検体（複数可）は、STとすることができるキャニスタ番号を識別する論理和、長期的。
   6. 液滴ID（ 図1A）を保持/患者名、ソリューションのID、および胚で底面を標識することにより、新鮮な凍結皿（100ミリメートル）を準備します。等張HEPES緩衝培地（上）、V1（平衡溶液（ES））、V2（中間体溶液（IS））、V3（;底ガラス化溶液（VS））：具体的には、液滴の4行を設定します。列ラベル右上側の胚のIDを記述します。
      注：50-μLの25-一連の小滴を洗浄する（N = 3）を15μL保持滴/溶液の種類に対する各個々の最後の10-（ すなわち、V1、V2、またはV3）が純粋であることを保証するために使用され、かつ希釈されていません。 5個々の胚まで、このアプローチを使用すると、単一の皿を使用してガラス化しすることができますによって。使用中の液滴の任意の室温蒸発/脱水​​を避けるために、ないときに覆われた各皿にしてください。
   7. その基端（「VTFのヒント」という。）から3センチメートルを切断することにより、無菌flexipettesを準備します。個別にそれらを挿入しますピペット（3μLに設定）と発泡スチロールのチューブラック（ 図1B）に直立ピペットVTFのヒントを設定します。
2. 胚の選択
   1. 患者/検体識別を確認してください。
   2. 倒立顕微鏡の使用（200 - 400倍の倍率）を、グレードとそれぞれ、胚盤胞を斜線のために早期のために1〜6の数字の分類を使用して、ガードナーグレーディングシステム^20、および割り当てられたA、B、またはC等級に応じた胚盤胞を分類内部細胞塊（ICM）と栄養外胚葉（TE）へ。
      注：胚盤胞の生検および正倍数性分析のための準備では、透明帯は、TEの早期ヘルニアを促進するために、3日目のレーザーアブレーションによって事前の斜線であり、したがって、修正された等級分類^2が必要です。斜線の50％、およびグレード5孵化胚盤胞は> 50％TE extrusioを持っている - 10％TEヘルニアまで簡単に、グレード3の完全な胚盤胞の展示では、グレード4は、胚盤胞が10であり、展開しましたN（ 図2A-C）。
      注意：私たちの好みは、しかし（グレード1または2個の胚盤胞への後期桑実胚などの初期段階での低品質（C）およびポスト圧縮胚のガラス化した胚盤胞を5日目または6に≥BB品質のグレード3以上の胚盤胞を凍結保存することです）確かに完全に無傷で温め生き残るためには、出生を達成することができる実行可能な胚を得ることができます。
   3. 低モル濃度のガラス化ソリューションを使用している場合cryodilutionプロセスの開始に先立って、栄養外胚葉接合をmicropuncturingしたり、栄養外胚葉細胞²¹のレーザーパルスアブレーションを行うことにより、各胚盤胞の胞胚を折りたたむ（<6.5 Mまたは40％v / v）でした。
      注：胚盤胞を崩壊させる必要がデバイスに依存しないです。 μS-VTF（2008年）の私たち自身の初期の開発では、我々は最初にエチレングリコール（EG）/卵母細胞で成功したDMSO溶液（1 1満期妊娠のうち）を使用しますが、次善（<80％）マウス胚盤胞¹⁶の生存/開発は、他の人²¹が経験しました。 （7.9 Mを超える）高モルのグリセロールベースのソリューションは、（2009年以降）当社の現在のVTFシステムで使用されているので、物理的な胞胚の崩壊は不要です。しかし、孵化した胚盤胞の選択ハッチングは、一般的にはお勧めします。
3. Cryodilutionと胚盤胞のロード
   1. インキュベーターから患者の培養皿を取り外し、ガラス化する胚（複数可）を削除する前に、（二次ソースによって目撃すなわち、）別の人の患者/検体識別を確認します。
   2. クライオ皿の等張性保持液滴に培養皿からステップ2.2.2あたりの胚盤胞の発達を確認し、クライオデータシートを更新し、そして、実体顕微鏡下で、ピペットの胚盤胞（複数可）。
   3. ガラス化flexipette（ すなわち、VTFチップ）を使用して、個々の保持液滴に各胚盤胞を移動します。
   4. それぞれを移動V1（ES）溶液に胚盤胞。
      1. V1溶液（3μL）でflexipetteをあらかじめ入力し、胚の上半分の内容を配置します。
      2. 吸引除去胚と胚、3 ​​V1洗浄滴（ステップ2.1.6で呼ばれる）の最初のピペット2に移動 - 外周の周囲に3回、液滴にピペット内容を消去（気泡形成を回避する）またはオン皿表面。
   5. 次V1ウォッシュドロップでVTF先端を記入し、胚（複数可）の吸引を繰り返します。三回目を繰り返し、ドロップを保持している個々のV1に胚盤胞（複数可）を移動します。希釈/洗浄工程は、30〜45秒を取る必要があります。次の溶液（ 例えば、V2）と各VTFチップをプリロード、ラックにピペットを挿入し、次のピペット（ステップ2.1.7での設定に応じて）（ 図1B）を使用します。
      注：V1とV2の溶液を含む非ジメチルスルホキシド（DMSO）中の総露光時間は、5分毎であるので、INDIVIのピペットデュアル胚盤胞を均等に最終V3ステップが実行するために、胚盤胞あたり少なくとも1分を必要とするであろうことを考えると、その間隔内に互い違いに配置する必要があります。例えば、ガラス化群では4個の胚盤胞、ピペット胚盤胞75秒間隔で＃1-2-3-4がある場合。
      注：革新的なクライオ企業（ICE）の希釈プロトコルは、上記の一般DMSO含有溶液を伴う他のほとんどの市販のガラス化手順、より明らかに異なっています。これらのプロトコルは、緩やかを通じて同じ段階的希釈を達成するため、あまり制御され、洗浄溶液（ すなわち、等張培地）、ES、およびVSのマージ
   6. 繰り返しはV2（IS）ソリューションを使用して、2.3.4と2.3.5を繰り返します。
   7. 繰り返しはV3（VS）ソリューションを使用して、2.3.4と2.3.5を繰り返します。
   8. V3保持液滴内の各胚盤胞を配置すると、（液滴外）VTF先端残液や気泡をオフにして、胚の周りにきれいなV3で完全に先端を埋めます。経験エルおよその体積（1μL）の三分の一と完全にVTF先端に胚盤胞（複数可）、残りのV3をピペット。
   9. 、ピペットからVTFチップを取り外し、滅菌ガーゼパッドを使用して、外表面に残留V3の先端の乾燥を拭くと、前標識されたストローの開放端に先端-最初に挿入します。 「ドライ先端は「可能なインナーわらの付着を防止するために重要です。
   10. わらを反転（ラベルがダウンして終了）、内側のプラグまたはシールで先端を観察し、かつ安全にエアスペースから1cmと開放端をシールします。好ましくは、技術的な変動を排除するために、自動密封装置（ 例えば、シムズI）を使用します。
       注：アイオノマー樹脂、プラスチック（ 例えば、HSVまたはμS-VTF）から構成されているストローを使用することの利点は、ステップ2.1.3.1で述べたように、任意の適切作動ヒートシール装置を使用して、信頼性の高い「溶接」のシールを作成することです。
   11. いったん密封された、ステンレス鋼の中でLN ₂に直接閉じたストローを急落ESS鋼デュワーフラスコとストレージのための患者の杖に取り付けられたオープンゴブレットに藁（複数可）を配置します。
       注：μS-VTFストローが空気で満たされたわらの浮力を相殺するために40 mmの加重IDロッドを使用しているため輸送が関与している場合を除き、試料（複数可）をカバーするために反転ゴブレットまたは空のクライオバイアルの使用が必要とされていません。
4. 温暖化とクライオソリューション溶出/希釈
   1. ビトリファイド胚移植日、予定時刻、および胚の詳細（PGSは、試験した場合/転送、特定胚の数を解凍するための番号等 ）に関する医師紹介フォームを確認してください。
   2. 新鮮な温暖化ソリューションを準備します（1.0 Mショ糖ストック溶液）および/または商業的供給源を使用します（1週間1回、使用中の貯蔵寿命の月、4℃の保存をお勧めします）。
      1. スクロースGRA中のエンドトキシンの蓄積のリスクへの最初の開口部（ 例えば、毎週の供給源）の際に50-mLの滅菌フラスコにショ糖のアリコート17.1グラム繰り返し周囲の暴露時にnules。
      2. 溶液中に予め秤量した粒状スクロースをミックス（1.0 Mストック= 3.42グラム/ HEPES緩衝人間の卵管液[H-HTF]の10 mL）及び顆粒の溶解性を増大させるために37℃にソリューションをウォームアップ。繰り返しスピードアップを支援し、最終混合を完了するための容器を反転。
         注：濾過（0.22μmのフィルター）正圧濾過ユニットを使用して実行する粘性溶液（> 0.5 Mショ糖）または高ボリュームのために推奨されます。手の圧力ポンプは電動ポンプにノイズが多いのに対し、振動を起こし、単に必要とされていない、十分な、安価です。
   3. 暖かい（37℃）1 10 mLチューブμS-VTF温暖化槽用の患者あたり1.0 Mショ糖溶液とH-HTF培地の各。
   4. 患者名およびソリューションIDにカバー表面を標識することによって、新鮮な解凍皿（6ウェルプレート）を準備します。
      注：この場合、我々は使用：（1）T1洗浄（200μ;油オーバーレイなしLオイルとオイルとオイル1mLのと、（2）T1（100μL）、（3）T2（100μL）、（4）T3（100μL）、（5）T4（100μL）オイルオーバーレイなし油、及び10％のヒト血清アルブミン（HSA）または20％血清代替物（6）T5 / 200μL等張HEPES緩衝培地で。ユニバーサルショ糖溶液降圧プロトコル-T1 = 1.0 M、T2 = 0.5 M、T3 = 0.25 M、およびを適用T4 = 0.125 M-場合遅い凍結胚^22をするために提案されているように、ICEまたは他の商業的供給源は、利用できません。また、最初のT1の洗浄と最終T5のequilibrationsが30 mmのペトリ皿に行うことができ、4ウェルディッシュは、油オーバーレイを含む、上記の手順2-5に使用していることに注意してください。
   5. 一度に1人の患者のみの胚（複数可）を解凍します。
      1. 医師紹介フォームを確認し、指示された数（ すなわち、1または2個の胚盤胞を）温めサイクルを確認します。 SHR、すなわち （浸透圧の変化を観察することによって、生存/可能性の高い生存率を評価inkageと再水和）と、無傷の膜、及び、疑わしい場合は、別の胚盤胞を温める前に、医師および/または患者にお問い合わせください。
   6. （ すなわち、二次ソースによって目撃）同僚の患者/検体識別を確認してください。
   7. LN ₂を充填したデュワーフラスコ内で患者の杖を置き、温めべきわらを同定、単離。
   8. 実体顕微鏡のステージの中央に6ウェルの希釈皿を持参してください。 0.5 Mスクロース温暖化を作成するために、一方の側にオフを60mmペトリ皿（ すなわち、技術者の左側または右側の好みに応じて）、温めスクロース（1.0 M）を追加し、H-HTFソリューションを配置します浴（発見）。
      注：VTFヒントが唯一の胚は急速な温暖化²²時に放出されることはまれで、胚の生存能力の保持を確実にするために、QCの安全対策として、0.5Mのスクロース溶液中で温めています。
   9. 液面上の上部わらシールを保持します身元を確認し、[把握し、メイヨーはさみを使用して、内部プラグ以下のわらを確保する（VTFチップはまだLN ₂中に浸漬されなければなりません）。
      1. しっかりとQCの予防措置として、内側わらの側壁からVTFチップを除去するためにデュワーフラスコ（数回）にはさみをタップします。 VTFチップが付着している場合、タップは、先端ベースは、このように、プラグ端近傍の空気空間を提供、標識された端部と反対側の密封端に低下することを保証します。
   10. 水平位置（次のステレオスコープの表面に以下）で周囲空気中にハサミでわらを持ち上げ、非標識の端（右側にラベル）を把握。内側のプラグまたはシールでストローをカットし、温暖化槽皿の上に持ち上げます。それは完全に押出され、急速に暖めされるまで、60°の角度で温かいスクロース浴にVTFチップを注ぐ（> 6,000℃/分）。 flexipetteのベースは、皿の側壁の上に休むます。
       1. VTF tiのを許可します浴中に落下解放するのp。先端がすぐに現れていない場合は静かに上部わら表面をタップします。それは部分的にのみ表示された場合は、はさみや細かいピンセットでflexipetteのシャフトを把持することにより、押出を補助します。
   11. 5の後 - 10秒、ピペットベースを把握し、使い捨てのピペット装置に挿入。電球の穴は、挿入時に圧力を解放するように作用します。人差し指で電球の穴を覆い、静かに実体顕微鏡により見ながらT1ウォッシュ（＃1）にガラス化した胚盤胞を解放するために電球を絞ります。一度確認され、よく、中心に内容を退避、正の圧力により、未使用の廃棄を残留V3（VS）ソリューションや気泡をクリアします。 5分間のタイマーを起動します。
       注：すべてのショ糖希釈工程は、室温（21±2ºC）で行われます。
   12. VTFチップを取り外し、ピペットの上に置きます。 （ - 4分約3）残り時間のために油の下のT1＃2に胚を移動させることで進みます。 <オール>
   13. ステップ2.4.12を開始する前に患者から - 2番目の胚盤胞を転送するために必要な場合は、すぐに（2.4.11ステップ2.4.9を繰り返し）は、第2のわらとVTF先端を温めます。少なくとも3分のT1の最小溶出（1.0 Mショ糖）のために一緒に両方の胚盤胞を移動します。
5. 次の溶液をflexipetteを予め充填し、その後、3分間隔で、T2、T3、及びT4に胚盤胞（複数可）を移動し、希釈します。透明帯は、以前にレーザーアブレーション（ すなわち、斜線の）されていない場合は、T4でそう。倒立顕微鏡と画像コンピュータモニタ上の胚のステージ上に皿を置きます。指定された赤色の丸で透明帯を合わせ、開口部^2を作成するために、ダイオードレーザー（囲卵腔の縁で始まり、外側に移動する）の2または3インパルスを活性化し^、19。
6. 温かい表面（37℃）で5分間T5（ すなわち、等張培地）中で胚盤胞を平衡化します。
7. 核濃縮黒ずみを欠いても、半透明の細胞質と無傷の細胞膜の主要な存在に基づいて、初期胚の生存率を評価します。胚移植の前に6時間、その時点で、胚発生/生存が再評価され、文書化されるべきである - 2のための文化に胚（複数可）を配置します。
   注：1以上の実行可能な胚盤胞は、転写時に存在し、患者が1つだけの胚盤胞を続行することを選択した場合は、補足的な胚盤胞をして正常に再ビトリファイドすることができます（rVTF）、手順2.3.3繰り返して- 2.3.11を。我々は、単一のrVTFイベントを次のいくつかの確認出生を持っています。
   注：rVTFは、実験的に準安定グリセロールベースのソリューションにガラス固化体異数性のヒト胚盤胞の生存/生存率に有意な影響なしに5回まで行われてきました。

Results

1316が（98.1パーセント）が生存した1341ガラス固化体胚盤胞は、（100％）2014年6月に2012年の間に温め、1341胚を回収しました。生検胚盤胞は、99.5％の生存上で経験しました。主に単一の転送時には、遺伝的にテストされ、正倍数体、ビトリファイド胚、我々は米国で最も高い注入率と出生率のいくつかを達成することができました、年齢の独立した（ 図^3）20、センターによって報告された最近の国の統計によると疾病管理生殖補助医療学会（ 表1、表 2）のために。単独で凍結保存されたサイクルのための良好な予後患者集団（未満35歳）（ 表1）を評価する 、私たちの研究室では、両方の注入率の全国平均（ すなわち、妊娠を確立するために胚の効率）を上回りましたし、最終的に出生率を生きます 30％を超えることもできます。さらに、70の研究・承諾し、再ビトリファイド異数体胚盤胞を使用して、半ば2014年に私たちの修正されたストレージ・ストローの初期確認/検証は、回収率100％と100％の生存率をもたらしました。

1. MicroSecure VTFセットアップ図 。 VTF皿（A）は異なる、番号保持液滴に配置する前に、3洗浄液滴を利用するガラス化溶液の3つの異なる列で組み立てられます。また、短縮VTFのヒント（ すなわち、300μmのIDのflexipettes）を有する個々のピペットを確保し、秩序ある使用のために回転させることができる発泡スチロールのチューブラック（B）、で構成されています。代表的な使い捨てのマイクロピペットの電球のピペットアセンブリは発泡スチロールのラックに載っていることに注意してください。 ARGET = "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2は、 胚盤胞評価システムを変更しました。私たちの修正されたガードナー胚盤胞グレーディングシステムは、胚盤胞の生検を容易にするために、TE細胞の誘導さヘルニアを占めています。孵化胚盤胞（C）が 50％以上ヘルニアを有している：（グレード4 =最大ヘルニア50％B）：（グレード3 = 10％未満のヘルニアA）および拡張胚盤胞修飾は完全胚盤胞の早期ハッチングを考慮します^16。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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3.比較妊娠成果図。累積1.5年間隔で、妊娠のデータは、ガラス固化体温め正倍数体胚盤胞を転送の効果を評価するために比較された非PGSサイクルと比較した（n = 172サイクル/ 144転送）は、主に新鮮な関与た（n = 160サイクル/ 153転送） ^18を転送^します。我々の実験のために、このデータは、μS-VTF手順によってガラス化胚盤胞の生検は、それらの生存能力を維持することが明らかになりました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

情報元	＃サイクル	移植胚の＃を意味します	注入率（％）	ライブ出生率（％）
NBラボ*	144	1.2	74.00パーセント	74.50パーセント
全国平均	20423	1.7	39.60パーセント	44.10パーセント
※データは2008年にmicroSecureガラス化手順を設立し、現在オベーション不妊研究所（NBラボ）を使用して、オレンジ郡豊饒、南カリフォルニア不妊センターと生殖医療クリニックのための南カリフォルニアセンターの2014年のパフォーマンスに基づいて平均しました。

表1 2014年CDCは生殖統計を支援します。 3から35歳未満の女性の凍結胚移植妊娠データが450以上報告クリニックの米国2013年全国平均と比較して、私たちのNBラボを使用して、医師の診療所を報告します。

SART全国平均
クリニック - 国家	女性たち	女性たち	女性たち	女性たち
	<35歳	35-37歳	38-40歳	41-42歳
SCCRM-CA *	63.1パーセント	58.3パーセント	40.6％	32.3パーセント
CCRM-CO *	64.7パーセント	61.5パーセント	40.4パーセント	32.2パーセント
RMA-NJ *	63.2パーセント	59.7パーセント	34.6％	18.7％
全国平均	48.6パーセント	38.3パーセント	24.3％	12.3％
生殖医療のためのSCCRM-南カリフォルニアセンター。生殖医療のためのためのCCRMコロラドセンター;そして、RMA-Reproductive医学アソシエイツ
*これらの大手クリニックはすべて、主に移植胚あたりの出生の成功を最適化するために、患者ケアの彼らの標準的な実践に、着床前遺伝子検査に関連して、ガラス化した胚移植サイクルを実装しています。

他のいくつかの尊敬のプログラムと、だけでなく、SARTと対比ニューポートビーチ、カリフォルニア州で私たちのオベーション豊饒ラボを使用してSCCRMクリニックのための生殖補助医療のための協会によって報告されるように表2 2014累積出生率、（SART）、全国平均。

Discussion

今日では、完全な胚盤胞の生存率（> 95％）を達成し、新鮮胚のと同様の移植の成功を達成するための高い期待があります。いくつかのグループには、ガラス固化体胚移植サイクルの出生率は、無傷の凍結保存した胚は、健康な、非ホルモンで刺激された子宮に移植された新鮮胚盤胞よりもさらに高い、おそらくあることを示唆しています。我々のデータは明らかにガラス化が効果的かつ確実に新鮮胚の生存率を維持していることを示しています。さらに、我々は、無菌ことを証明した、MicroSecureガラス化（μS-VTF）と呼ばれる閉じた方法は、に匹敵するか、IVF産業で使用される市販の標準（ すなわち、オープンデバイス・システム）以上の最適な結果を達成することができます。

バリエーションは、ガラス化デバイス/多数の方法を使用して、個人間の技術的な再現性と信頼性に関連しています。今度は、これはinconsiをもたらしましたガラス化を適用するプログラム間stencies。したがって、デバイスの親しみは、実験室での習熟度と成功の成果に関する重要な要因であることは驚くべきことではありません。これは、プログラム間の再現性が問題となり得る理由を説明し、「技術的な署名^」11のこの概念です。ダース以上の商業機器の開発は、この現象を複雑にするだけでなく、品質管理上の問題を作成していました。幸いなことに、μS-VTF、ラピッドIのように、ガラス化システムを閉じ、そしてVitriSafeは、今のデバイス・システム^{12、13、14を}開くこと^が同等に有効であることが証明されています。

MicroSecure VTFは心の中で技術的な使いやすさ、信頼性、およびクライオセキュリティで開発された小説、無菌ガラス化技術です。 2以前に承認され、FDAに準拠したデバイスの使用を組み合わせることにより、非商用のガラス固化システムワットであります特殊なデバイスとは対照的に、確立された低コストを有することの明確な利点第i。また、独自の改竄防止や内在化2色ラベリングシステムと同様に、多数の他の品質管理の利点は、作ったμS-VTF魅力的なグローバルオプション^11。非商用VTF装置として、しかし、その広範な業界のアプリケーションがゆっくりと進化しています。のみ、その安全性、セキュリティ、および臨床有効性の継続的な出版物を通じて利用をμS-VTFゲイン成長します。

インナー、非ウィッキング疎水性プラグで製造オリジナルの0.3-mLの胚のストローを取得することができないことに直面したときに2014年8月では、我々は確実にμS-VTF方法を変更することができました。要するに、彼らの綿-PVPプラグを持つ新しい0.3 mLの精液/胚のストローを効果的に適合させました。これは、単にこのように接触し、流体ウィッキングを防止し、綿栓の前に内部シールを作成することによって達成されましたオープンエンドVTFの先端（ すなわち、胚や卵を含むflexipette）。 40 mmのIDロッドはアクセスできない場合はさらに、軽く30 mmの棒に関連付けられている浮力の問題は、2つのボールベアリングを使用してcounterweightedすることができます。

これらの追加の手順は、技術がわずかに少ないシンプル作ったが、まだ非常に効果的です。その正倍数性状態は、遺伝学のレポートで確認されるまで、生検の胚盤胞は、典型的には、個別にガラス化しているように今日では、経済性と有効性は、ますます重要な関心事になっています。確認された非生存異数性のステータスを持つ胚盤胞は、通常、数週間以内に、患者の同意を得て、破棄されます。したがって、VTFデバイスの大部分（> 50％）は、商用デバイスを使用する場合にエスカレート年間コストを引き起こし、短期保管後に廃棄されます。全体的に、μS-VTFは、人間の胚盤胞の凍結保存のために、非常に効果の高い信頼性、および反復可能な手順です。優れた品質・制御設計securelyのラベルや安全に回復の障害を排除し、胚のガラス化への普遍的なアプローチとして、システムの使用を正当化後の温暖化の生存および生存度を、最適化しながら、胚/卵母細胞を格納します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アルミケーン	IVM	XC055
ボールベアリング、3/32"	VXB.com	KIT15977	ステンレス鋼
CBS精液/胚ストロー、0.3 mL	CryoBioSystems	25292	個別滅菌
カラー、IDロッド、30 mm	CryoBioSystems	019021-26	重
培養チューブ、15 mL	Falcon	352099	Conical
培養チューブ、10 mL	Falcon	352057	Snap-cap
Cryosleeves	Nalgene	5016-001
Filter、250 mL	Fisher Sci.	09-740-2A	0.22 & ミュー;m
フラスコ、組織培養 50 mL	Falcon	353014
Flexipettes、300 μm ID	クックメッド。	K-FPIP-1300-10BS-5	滅菌、20/パック
鉗子、大型	Miltex	6-30TC
鉗子、スプリンター - ファイン	Miltex	17-305
ゴブレット	IVM	PA003
ヒートシーラー、SYMS 1	CryoBioSystems	16399	110 V または 220 V アダプター付き
Hepes-buffered media	Life Globalまたは	LGGH-100; 100 mL、または	2〜8ºで保存。C
	Irvine Scientific	H-HTF; 90126; 100 mL	with non-essential AA's
Labels, Cryo	GA International	CL-23T1	Various colors
Liquid Nitrogen Tank, 40 L	MVEまたはテイラーウォートン	各種	液体貯蔵
LN<サブ>2;デュワーフラスコ、0.5 L	ハンプトン リサーチ	HR4-695	ステンレス鋼
6 ウェル カスター ディッシュ	バイオジェニックス	015/020	プラスチック製品 ケース別
ピペット バルブ、マイクロ キャップ	ドラモンド	フィッシャー #13681451	バルブ アペ
ックス ペトリ ディッシュの穴、35 mm	ファルコン	351006
ペトリ ディッシュ、58 mm	ナンク	150288
ペトリ ディッシュ、100 mm	ファルコン	351029
ピペットチップ、ARTロング	フィッシャーサイ。	02-707-80	10 - 100 &L
Pipet Aid	Drummond or Falcon	各種	充電式
ピペッティング装置、Stripper	Cooper Surgical	MXL3-STR
Pipettes、Serological 1 mL	Falcon	357521
Pipettes, Serological 2 mL	Falcon	357507
Pipettes, 血清学 5 mL	Falcon	357543
Pipettes, 血清学 10 mL	Falcon	357551
はさみ、外科用メイヨー	ミルテックス	5-SC-16
実体顕微鏡	ニコン、オリンパス、ライカ	各種
滅菌ガーゼパッド、4インチ x 4インチ	Kendall Healthcare	6939
合成血清	Life Global、または	LGPS-20; 20 mL、または	2 - 8 & ordm;C
	Irvine Scientific	SS-99193; 12 x 10 mL	低エンドトキシンロット購入
スクロー	シグマ ケミカル Co.	#S9378	アリコートを50に mLフラスコ、1年; 17.1 g/フラスコ + ミディアムから 50 mL; 1 Mソリューションを作成します。 0.22µのフィルター。mユニット
タイマー	ナルゲン	5016-001
解凍液	イノベーティブ クライオエンタープライズ	BL-TS (≤1.0 m ショ糖)	T1, T2, T3, T4; 2 - 8 & ordm;&leのC
ガラス固化ソリューション*	Innovative Cryo Enterprises	BL-VS (≥7.9 M [グリセロール/EG])	V1, V2, V3; 2 - 8 & ordm;&leのC開封後1ヶ月
* 非浸透性の凍結保護添加剤には、ショ糖、フィコール、ヒアルロン酸ナトリウムが含まれます
** その他の市販の調製物は、典型的にはエチレングリコール (EG)/ジメチルスルホキシド (DMSO; 30% v/v; 4.8 M) ですが、EG/プロピレングリコール (32% v/v; 5.2 M) の場合もあります。混合溶液は通常、高モル溶液の凍結毒性の懸念を軽減するために使用されます。商用ソリューションには、通常、ES ソリューションと VS ソリューションが含まれます。市販の調製物の配合は、典型的には専有財産である。