方法論記事

動的光散乱顕微鏡による濁りソリューションにおける粒度分布の測定

DOI：

10.3791/54885

⸱

2017年1月9日

 , 
1Department of Chemistry, School of Science, University of Tokyo, 2Institute for Solid State Physics, University of Tokyo

この記事について

サマリー

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動的光散乱顕微鏡を用いて濃縮された溶液中で粒度分布の直接測定のためのプロトコルが提供されます。

要約

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動的光散乱を使用して濃縮ポリマー溶液の多分散性を測定するためのプロトコルが説明されています。動的光散乱は、ポリマー溶液またはコロイド粒子のサイズ分布を測定するために使用される手法です。この手法は高分子溶液の評価に広く使用されていますが、多重散乱効果や強い光吸収により、濃縮溶液中の粒子サイズを測定することは困難です。したがって、濃縮溶液は測定前に希釈する必要があります。動的光散乱顕微鏡1に共焦点光学部品を実装すると、この障壁を克服するのに役立ちます。このような顕微鏡系を使用すると、透明系と濁系の両方を、希釈せずに同じ実験装置で分析できます。代表例として、温度応答性ポリマー溶液の粒度分布測定を行った。水溶液中のポリマー鎖のサイズは、下限臨界溶液温度(LCST)より低い温度で数十ナノメートルでした。対照的に、LCSTを超えるとサイズが1.0μm以上に増加しました。この結果は、溶液がLCSTの上で濁ったという観察結果と一致しています。

概要

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粒子サイズは、コロイドおよびポリマー溶液の最も基本的な特性の一つです。粒子サイズを測定するために、さまざまな手法が使用されています。1.0μm以上の粒子径は、光学顕微鏡で直接測定できます。より小さな粒子には、レーザー回折、電子顕微鏡、原子間力顕微鏡などの代替技術が使用されます2,3。動的光散乱は、溶液4の粒度分布を測定するために一般的に使用される手法です。この手法を用いて得られる結果は、粒子の画像からではなく、散乱光強度の変動の特性時間から導き出されます。これらの揺らぎは、拡散定数によって特徴付けられるブラウン運動に由来します。サイズ分布は、アインシュタイン・ストークス方程式を使用した拡散定数の分布から得られます。動的光散乱は、そのシンプルさから、塗料や食品コロイドなどの溶液の日常的な評価に広く使用されています。

前処理は、溶液サンプルの粒子サイズ測定に使用されるほとんどの技術に必要です。電子顕微鏡や原子間力顕微鏡の場合、試料は真空条件下で分析する必要があります。そのため、サンプルを本来の姿で観察することは困難です。さらに、レーザー回折や動的光散乱では、多重散乱や光吸収のない希釈されたサンプルのみを測定できます。この困難を克服するために、希釈されていない濃縮溶液からの動的光散乱の測定について、相互相関分光法5,6、低コヒーレンス動的光散乱法7,8、拡散波分光法9,10、示差動的顕微鏡法11,12など、いくつかの新しい手法が提案されています。

動的光散乱顕微鏡1と呼ばれる新しい装置を開発しました。この装置は、ピンホールを用いて多重散乱を排除した共焦点光学系により、希釈せずに濁った試料を測定することができます。しかし、測定手順やデータ解析は、市販の機器に比べてやや複雑です。この動画では、温度応答性ポリマーであるポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)の分析を例に、測定手順とデータ解析について詳しく説明しています。

プロトコル

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1.試料の調製

  1. 温度応答性モノマーの精製
    1. トルエン100mL中のN -isopropylacrylamide 20gの（NIPA）を溶解します。
    2. ほこりを除去するために吸引ソリューションをフィルタリングします。
    3. 石油エーテル500mLでろ液を混ぜます。
    4. 氷水浴中で反応容器を置きます。
    5. モノマーは、（典型的には30分）を沈殿させるまで溶液をかき混ぜます。
    6. 沈殿したモノマーを得るために、吸引下でソリューションをフィルタリングします。
    7. 一晩、減圧（100 Pa）で下にモノマーを乾燥させます。
  2. 温度応答性高分子溶液の調製
    1. ドガダイヤフラムポンプを用いて1.0分間、脱イオン水20mL。
    2. 脱気し、脱イオン水9.5 mLの精製されたNIPAの780.8 mgの溶かします。
    3. 氷水浴中で反応容器を置きます。
    4. からの反応を保護アルミ箔で装置を覆うことにより、光。
    5. 優しくチューブとガスシリンダーに取り付けられたピペットチップを経由してArガスの適度な流れを導入しながら10分間、溶液を穏やかに攪拌します。
    6. マイクロピペットを介して溶液に、Nの11.9μL、N、N '、N' -tetramethylethylenediamineを追加します。
    7. ステップ1.2.5で述べたように、Arガスを導入しながら1.0分間溶液を撹拌しました。
    8. 試料を撹拌しながら、脱気および脱イオン水0.5 mLの過硫酸アンモニウム4.0ミリグラムを溶解します。
    9. （ステップ1.2.7）から試料溶液と（ステップ1.2.8から）、過硫酸アンモニウム溶液を混合します。
    10. ステップ1.2.5で述べたように、Arガスを導入しながら30秒間、溶液を撹拌しました。
    11. アルミホイルでソリューションをカバーし、一晩冷蔵庫（4℃）に保管してください。
  3. サンプルマウントの準備
    1. から（試料溶液の60μLを配置キャビティスライドステップ1.2.11）。
    2. 円形のカバーガラスで溶液をカバーしています。トラップ気泡に注意しないこと。
    3. マイクロピペットおよび実験ワイプを使用して余分な溶液を除去します。
    4. 接着剤でサンプルを密封します。室温（典型的には6時間）での接着剤の乾燥をしてみましょう。
    5. 手順1.3.1-1.3.4に従うことによって、0.1重量％のポリスチレンラテックス（100-nmの粒子径）懸濁液で満たされた別のスライドを準備します。このスライドは、標準として使用されます。

動的光散乱顕微鏡による2粒径測定

  1. 楽器の最適化
    1. 倒立顕微鏡のステージ上で（ステップ1.3.5から）ポリスチレンラテックス懸濁液のスライドを置きます。カバーガラス側が下を向く必要があります。
    2. 検出器の前のビームダンパー（アバランシェフォトダイオードと自己相関器）を配置します。
    3. 連続的な、レーザービーム（固体レーザ、λ= 488 nmの30 mWのを適用します対物レンズを通して試料に波）（10×）。反射された光の一部は、顕微鏡の打ち上げミラーを通過し、CCDカメラで観察し、顕微鏡（ 図1）のサイドポートに取り付けられています。
    4. ローからハイへの位置から対物レンズの高さをシフトさせることにより試料懸濁液に焦点を設定するために、対物レンズの高さを調整します。カバーガラスと試料との界面に、カバーガラスの表面に、サンプルと正孔スライドガラスとの界面でこの手順の間に、反射像を三回集光されます。第二と第三の点の間の焦点を設定します。
    5. レーザパワーを変化させることにより、散乱光強度を減衰させます。
    6. 検出器の前にビームダンパーを除去することにより、検出器に散乱光を導入します。このユニットは、光強度の時間相関を測定します。
    7. betwピンホール（φ= 50μm）を設定します共焦点効果を達成するために、顕微鏡、検出器をEEN。検出器での光強度を最大化するために、ピンホールの位置を調整します。
    8. コンピュータを介して相関器の動作を開始して30秒間散乱光強度の時間相関関数を測定します。測定された相関関数は、多くの場合、G（2）（t）と表現される- 1、tは相関時間4とfigure-protocol-1 。ここで、I（t）は時刻tにおける散乱光強度であり、（•••）Tは、時間平均です。減衰時間は約0.1ミリ秒となります。
    9. 時間相関関数の初期振幅のための広い範囲を得るために焦点を調整（G（2）、（T = 0） - 1）。
      注：初期振幅を強く反射された光の量によって影響されます。焦点トウを移動させることによりカバーガラス及びサンプル反射光の量が増加するとの間のインタフェースをARD。ポリスチレンラテックスのような強い光散乱体については、初期振幅が0から1に変更することができ、反射光の強度よりもはるかに高いので、より一般的なポリマー溶液のための1に近い初期振幅を設定することは困難です散乱光のこと。
    10. サイズ分布関数を取得するために取得した時間相関関数に（拘束正則プログラムCONTIN 13,14を使用）の逆ラプラス変換を適用します。初期振幅が0.2未満に設定されている例では、流体力学的半径の分布関数は（詳細については、議論を参照）を2回、実際の半径である100nmで、周りに鋭いピークが表示されます。
  2. サンプル測定
    1. 25°Cまでのステージ温度を設定します。
    2. ポリNIPA（PNIPA）solutを用いて調製したスライドを配置イオン顕微鏡のステージ上で（ステップ1.3.4）。
    3. 手順2.1.4-2.1.8に従うことによって、散乱光強度の時間相関関数を測定します。初期振幅が0.2より大きい場合、ステップ2.1.9に従うことによって、0.2未満の時間相関関数の初期振幅を作るために焦点を合わせます。小さな初期振幅は、分析を簡素化します。
    4. 35°Cまでのステージ温度を設定し、溶液が濁るまで待ちます。 PNIPA溶液の下限臨界溶液温度（LCST）は、32°C 15です。
    5. 以下の手順により、時間相関関数を測定2.1.4-2.1.8。可能であれば、時間相関関数が0.2未満の初期振幅を作るために焦点位置を調整します。濁った溶液は、その初期振幅は、反射光のそれは一定のままで散乱光が増加する強度は、増加する傾向にあります。
    6. 逆ラプラス変換transformatiを適用します得られた時間相関関数上にサイズの分布関数を得ることができます。実際のサイズは、初期振幅が0.2未満である場合に半求めた値であることに注意してください。

結果

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ポリスチレンラテックス懸濁液（粒子径：50 nm）のための散乱光強度の時間相関関数は、（a）は、図2に示すように、異なる焦点で測定しました。この相関関数は、逆ラプラス変換による流体力学的半径の分布関数に変換した（ 図を参照して、図2（b）及び（c））。同じ手順を使用して、PNIPA溶液の流体力学的半径の時間相関関数と分布関数は、それぞれ、25℃及び35℃で得ました。 図3（a）および（b）散乱光強度の時間相関関数、（25°C）以下PNIPA溶液の対応するサイズ分布関数を示し、（35°C）上記LCST。粒度分布関数は、続いて、逆ラプラス変換によって得られました部分的なヘテロダインの補正。 LCST未満の平均流体力学的半径は、ポリマー溶液のために典型的である数十nmです。これとは対照的に、LCST以上の流体力学的半径は約1.0μmです。この結果は、溶液がLCST上記混濁であるという事実と一致しています。解決策は、白濁した後、図3の赤と青の線はそれぞれ、PNIPAの直後に得られた溶液を、20分の大きさの分布を表しています。 図3（b）は、明らかに凝集の成長を示しています。

figure-results-1
図動的光散乱顕微鏡の1回路図。ピンホール（PH）、ビームスプリッタ（BS）、偏光子（ポル）、アバランシェフォトダイオード（APD）。 ご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。

figure-results-2
ポリスチレンラテックス懸濁液2.代表的な結果を図。 （a）は、ポリスチレンラテックス懸濁液のための散乱光強度の時間相関関数。公称半径は50nmであり、濃度は0.1重量％です。 2つのデータセットは、異なる散乱点から得ました。 （B）、（C）に対応するサイズ分布関数（A）の逆ラプラス変換により得られたポリスチレンラテックス懸濁液のため。赤い線は、その初期振幅は約1.0である時間相関関数に対応し、青い線は約0.2である初期振幅とに対応しています。横軸は、部分的なヘテロダイン（PHD）の効果を考慮して（B）を含まない、および（c）を用いて計算した場合<< ; 1. この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-3
図PNIPAソリューション3.代表的な結果。 （A）PNIPA液の散乱光強度の時間相関関数。 （b）は （A）の逆ラプラス変換により得られたPNIPA溶液のための対応するサイズ分布関数。横軸は、各データセットのための部分的なヘテロダインの影響を考慮して計算しました。黒い線は、25°Cで得られたデータを表します。赤い線は、溶液が濁った（35℃）になった直後に得られたデータを表します。青い線は赤い線の20分間の測定後に得られたデータを表します。/54885/54885fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

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図2（A）に示すように、時間相関関数の初期振幅は重く、焦点に依存します。これは、一見溶液8（界面における薄層を除いて）均一であるという事実と矛盾します。初期振幅のこの変化は、反射光の量の変化に起因します。部分的ヘテロダイン理論16は、初期振幅、A、散乱光の強度は、I S、および反射光強度、I Rは 、以下の式1を満たすことを予測します

figure-discussion-1

この式は、 私はrを大きくはなることを示し、小さいAになります 。従って、Aは、インタフェースに近い焦点位置を設定することによって低減されます。見かけの拡散定数D A CAnは、単分散液の場合には、時間相関関数をフィットさせることによって得られます。

figure-discussion-2

どこfigure-discussion-3 。ここで、nは溶媒（水、1.33）の屈折率であり、θは散乱角（180°）であり、λは光（514.5 nm）での波長です。我々は、後方散乱ジオメトリを適用するので、qの値が固定されています。しかし、この点は、異なる波長の光を使用することによって解決されます。連続波レーザ光源のいずれかの種類がDLS顕微鏡を構築するために利用可能であることに注意してください。小さい照射量のおかげで、コヒーレンスファクター17を超え150であると推定され、無視できる程度です。多分散溶液については、D Aの分布関数は、逆ラプラス変換することによって得られます。部分的なヘテロダイン番目eoryはまた、D Aは実際の拡散定数Dと同じではないと予測します。これら二つの拡散定数は、次式を満たします。

figure-discussion-4

拡散定数Dは、アインシュタイン-ストークス方程式4を用いて、流体力学的半径R Hに変換されます。 A = 1の場合には、この関係は、D A = Dとなります。この場合、データ変換処理は、一般的な動的光散乱用のものと同じです。 図2（B）に示す赤線がこの場合に相当します。対照的に、この関係は、によって示されるように、Aは 、（0.2よりも実質的に少ない）が小さいときにA→0の極限におけるD A = 0.5 Dは、従って、サイズは実際のサイズの2倍であると推定されてなります図2（b）は青線、Aが著しく小さいことがわかっている場合は、 図2（c）に示すように、横軸は、シフトさせることができます。原則的に、我々はAの任意の値のためにDにD Aに変換することができます。単純な近似DのA〜D 0.5 が成立するので、実際には、しかしながら、0.2未満の初期振幅を設定した方がよいです。

動的光散乱顕微鏡法の顕著な特徴は、PNIPA溶液を用いて実証されました。 LCST以下と上記PNIPAの立体構造が広く15,18を小角散乱中性子を用いて研究されてきました。対照的に、動的光散乱は、その濁度19のLCST上記PNIPAの分析に利用されていません。 図3（a）及び（b）に示すように、この問題は、動的光散乱顕微鏡によって解決されます。これらの凝集体の大きさは、いくつかあります＆＃181; M、小角X線/中性子散乱または従来の光散乱法のいずれかによって得ることができません。このシステムを用いた時間分解測定は、温度変化の間に凝集プロセスについての情報を与えます。

動的光散乱顕微鏡の欠点はまた、図3に示されています。 LCST以下の結果は、時間相関関数が強くダスト本非常に少量の（ 図3の黒線）によって影響されます。例えば、時間相関関数があっても1.0秒程度の相関時間で、完全に減衰しません。この装置（約1.0ミクロン）を照射量は、通常の動的光散乱装置（約100μm）とその照射よりも著しく小さいためです。散乱光の強度が弱い場合には、信号は、Sによって引き起こされるような、ノイズによって隠されています溶液中の塵のモールの量。サイズの一般的な順序は意味があるが、そのため、 図3（b）に示す三つのピークは、定量的な重要性を持っていないかもしれません。そのような弱い散乱体は、従来の動的光散乱装置によって測定することができることに注意してください。

我々は、動的光散乱顕微鏡は、同じ設定を持つ透明で濁ったサンプルの両方を測定することを可能にすることを実証しました。試料中の光路長が短いため、この技術は、カーボンナノチューブ懸濁液20のように、強い光吸収サンプルに適用することができます。さらに、その高い空間分解能のために、この技術は、生物学的細胞に適用することができます。生物学への応用のために、この方法はまた、蛍光およびラマンイメージングのような他の画像化技術と組み合わせることができます。したがって、我々は、動的光散乱顕微鏡は、研究分野の広い範囲のための強力なツールであると考えています。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、文部科学省科学研究費補助金(25248027号から修士号)によって財政的に支援されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
N-イソプロピルアクリルアミド 98%東京化学工業(株)I0401
トルエン、99%和光純薬工業(株)201-01876
石油エーテル、蒸留温度 30 ~ 60 °C;C和光純薬工業(株)169-22565<
em>N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン, 99%シグマT9281
過硫酸アンモニウム, 98%シグマ248614
ポリスチレンラテックス懸濁液, 1 wt%デューク・サイエンティフィック・コーポレーション3500A
アルゴン小池山荘工業純度 > 99.999 vol.%
ビティスライド松波硝子工業83-0336
倒立顕微鏡ニコンインステック(株)ECLIPSE Ti-U
サーモプレート東海ヒット(株TP-108R-C
固体レーザーコヒーレントOBIS 488LX
アバランシェフォトダイオードALV-GmbH ALV-GmbHALV-High Q.E. アバランチフォトダイオード
相関器ALV-GmbHALV-5000/EPP
キャ)

参考文献

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