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方法論記事

ラットにおける慢性心筋梗塞の組織学的定量

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DOI:

10.3791/54914

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2016年12月11日

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1Cardiology, Department of Medicine, University of Fribourg

この記事について

サマリー

げっ歯類の心筋梗塞(MI)の死後評価は、染色された心臓切片の梗塞の定量化に基づいています。本稿では、採取したラットの心臓の基部から頂点までの系統的サンプリングと、三色染色された組織切片の画像解析を用いて、梗塞の大きさを定量化する正確な方法を説明します。

要約

心筋梗塞は、長期にわたる虚血による心筋細胞の死亡と定義され、虚血性損傷の後に炎症反応と瘢痕形成(線維化)が起こります。初期の急性期に続いて、左心室(LV)の慢性的なリモデリングにより、心臓の構造と機能が変化します。小動物における永久冠状動脈結紮術は、心筋梗塞の慢性モデルの参照モデルとして広く使用されています。梗塞サイズの組織学的評価が一般的に行われます。それにもかかわらず、定量化の方法の標準化は欠落しています。実際、分析されたセクションの数やサンプリングおよび定量方法などの重要な方法論的側面は通常説明されていないため、調査間での比較が妨げられます。多くの場合、定量化は乳頭筋のレベルで得られた単一の切片に対して行われます。梗塞の拡大とリモデリングを抑えることを目的とした新しい戦略が研究されているため、正確な心臓サンプリングプロトコルの標準化が重要視されています。採取したラット心臓の体系的なサンプリングと、基部から頂点まで得られた三色染色組織切片の画像分析を使用して、梗塞のサイズを定量化する正確な方法について説明します。また、拡張指数(EI)の計算により、リモデリング全体の左心室の変化を考慮に入れた梗塞サイズ評価が可能になったという証拠も提供します。

概要

心筋梗塞（MI）は、世界中の死亡および障害の主要な原因です。冠状動脈性心臓病は、主な原因です。 MIは、閉塞などの冠動脈イベントの連続虚血に起因します。再灌流の最初の6時間以内に行われていない場合、虚血は、不可逆的心筋壊死を誘発します。患者では、MIの特徴付けは、臨床徴候、心電図、バイオマーカー、心エコー検査、MRIイメージングの血漿レベルの評価を含む様々な診断ツールに依存し、そして組織1を解析します 。急性および慢性MIは、冠動脈閉塞の時間に対する心筋壊死のタイミングに応じてけがの二つの異なる相として分類されています。最初の7日の間に起こる急性期は、心筋細胞の損失、大規模な炎症、および線維芽細胞の動員と関連しています。心臓組織の治癒および瘢痕の形成を特徴と亜急性期、発生し、1〜4から6週間。梗塞の拡大、心室壁の菲薄化、および心室の拡張は、慢性期を特徴づけます。左心室の大規模な改造が次第に重症心不全2になります。

永久左前下行枝（LAD）結紮によって誘導される心筋梗塞、慢性心筋梗塞の標準的なげっ歯類モデルを表します。冠動脈結紮を冠動脈閉塞を模倣します。梗塞の大きさは、合字のサイトに依存します。げっ歯類モデルにおける心筋虚血損傷の特徴付けは、古典的に、このようなトロポニンIおよびT 3、心エコー検査、MRI、および組織学4,5などのバイオマーカーの血漿レベルを用いて行われます。バイオマーカーのレベルは、心筋細胞死の程度と相関しています。心エコー検査は、局所壁運動異常に起因する左心室機能障害を評価します。例えばMRIや高解像度などの他に、非侵襲的イメージング技術、心エコー検査、壁運動の減少、減少した灌流および生存心筋と瘢痕領域の容量、および減肉の評価を可能にします。 LV寸法は梗塞サイズの正確な評価を可能にします。最後に、生存可能であり、死んだ心筋の定量化は、収穫の心の組織切片の特定の汚れを使用して、死後を行い、梗塞サイズ（IS）の検証を可能にすることができます。別の重要な特徴は、梗塞拡大指数（EI）6の評価です。 EIは、最初の3日以内に貫梗塞と開始と関連しています。 EIは、壁の厚さの漸進的な減少、LV腔サイズの増大、およびLV形状の結果として変化することを特徴とします。

新規の治療の治療効果を評価するために - 特に、再生戦略細胞、マトリックスに基づいて、および齧歯類におけるMIの遺伝子送達の正確な評価は極めて重要です。乳頭筋のレベルで得られた単一の断面で測定した場合、ISサイズは、LAD結紮後により梗塞発達に存在する大きな変動にバイアスされてもよいです。頂点梗塞は、その後、掩蔽されることがあります。重要なことは、決定MIサイズに、より正確な方法は、マウス7-9またはラット10について記載されています。それにもかかわらず、IS正確LVリモデリングやリモデリングの治療誘発される減少（または予防策）を定量化するには不十分です。実際、一般的に心臓の断面で評価総LV容積のパーセンテージとして表されています。この方法は、急性心筋梗塞のために有効ですが、改造中に発生したLV壁の菲薄化は、11,12評価の下で、残っています。梗塞サイズ、構造的な変更の完全な形態学的定量は、心内膜および心外膜の長さや直径、ならびに梗塞や健康分野などのいくつかのパラメータを、定量化する必要があります。私たちは、方法論的APPRを記述します正確慢性ラットモデルにおいてMIおよびリモデリングを評価するoach。

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プロトコル

すべての動物は動物ケアに関する欧州条約に準拠した人道的なケアを受けました。外科的手順は、フリブール、スイス連邦獣医局、スイスで承認され、国家獣医局の許可を得た後、スイスの動物保護法に従って行われました。

1.ハート収穫

注：すべての外科的介入は、イソフルラン麻酔下で実施しました。努力が動物の苦痛を軽減するために行われました。具体的には、全ての動物は、0.1ミリグラム/ kgのブプレノルフィン予め麻酔の皮下注射を受けました。心筋梗塞入校するための外科的プロトコルは、以前に他の場所13に記載されています。

  1. 麻酔下myocardially梗塞動物（挿管動物、2.5％イソフルラン、足のピンチ反射により確認し、適切な麻酔）に胸骨切開を行います。
    1. 皮膚を切断することにより、動物を開き、筋肉手術用ハサミで。左右のリブをカットしてから、胸を削除します。
    2. 以前の手術（LAD結紮）の後に、残りの癒着を削除します。大動脈をカットし、心を取り除きます。 （PBS中）1 MのKClに組織を入れ、その後、PBSで洗ってください。

2.組織標本

  1. アクリルラット心臓マトリックス中に縦方向に梗塞心を置きます。 1時間-20℃で保管してください。
  2. 横方向とカミソリの刃を使用して、マトリックスに直接心をカット。各スライスは2ミリメートルの厚さであることを確認してください。 ;（改造レベルに基づいて）各心臓のための7のスライド - 約5をカットこれは、体系的なサンプリングと呼ばれています。
  3. このステップでは、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC）染色を行うこと（心臓スライスのベース - 頂点の向きを保つ）は任意です。
    1. 37℃で50分間、PBS中の1％TTCでインキュベートします。 1時間20分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）でそれをインキュベートします。 betweeセクションを入れてnは2 mmのスペーサーを有する2枚のガラス板とは15X倍率でカメラに接続された立体顕微鏡で写真を撮ります。
      注意！パラホルムアルデヒドは有毒です。
  4. スライド凍結（1 番目のオプション）
    1. （金型の底に下り区間の頂点指向側を配置）方向を維持、cryotomy用培地（最適切断温度、10月）を取り付けたプラスチック金型（10×10×5ミリメートル）で、各スライドを置きます。 15分 - 10用の液体窒素冷却下、2-メチルブタン蒸気でブロックをフリーズします。最後に、-80℃で組織を保存します。
  5. パラフィン除去（2 番目のオプション）
    1. 24時間、4％PFAで各カセットを埋め込んでスライド（ダウンカセットの底の部分の頂点指向側を配置することによって方向を維持）とを配置します。ティッシュプロセッサマシンで一晩でそれを置きます。
      1. 2時間エタノール70％でそれをインキュベートします。イーサンでそれをインキュベート2時間95％をオール。 3時間エタノール100％でそれをインキュベートします。 4時間キシロールでそれをインキュベートします。 5時間（オーブンで60℃で溶融）パラフィンでそれをインキュベートします。最後に、パラフィンの各心臓スライドを埋め込むことにより、ブロックを作ります。

3.マッソン - ゴールドナートリクローム染色

  1. （：厚さ5μm）または-18℃に設定したクライオスタットと10月のブロックから（厚さ：7μm）のマニュアルミクロトームでパラフィンブロックから組織切片を作成します。
  2. マッソン-ゴールドナートリクローム染色で- （スライドあたり4横断セクション3）（ 附属書を参照 ）、各ラットについて各心部からのスライドを染色します。
    注：パラフィン切片について、このステップから開始します。
    1. オーブンで60℃でスライドを溶かします。ヒュームフードの下で、10分間ずつ二回キシロールでそれらを脱パラフィン。 3分ごとに100％エタノール、95％エタノール、70％エタノール、蒸留水に再水和します。
      注：凍結切片に対して、この手順から開始します秒。
    2. ブアン液に一晩でそれらを修正しました。 15分 - そして、10のために水道水でそれらを洗い流してください。蒸留水でそれらを洗い流してください。 3分間マイヤーのヘマトキシリンでそれらをインキュベートします。
    3. スライドを削除し、5分間蒸留水にそれらを残します。その後、5分間酸フクシン、ポンソーでそれらをインキュベートします。 1分間1％酢酸でそれらを洗い流します。
    4. 次に、1分間リンモリブデン酸オレンジGでそれらをインキュベートします。 、1分間1％酢酸でそれらを洗い流し10分間ライトグリーン色素でそれらをインキュベートし、1分間1％酢酸でそれらをすすぎます。
    5. 70％エタノール（30秒）、95％エタノール（30秒）、及び100％エタノール（5分）でそれらを脱水します。 、組織切片上の樹脂封入剤の1滴を入れてカバースリップでそれらをカバーし、それらを乾燥させてください。

4.梗塞サイズ分析

  1. カメラに結合された実体顕微鏡（15X倍率）上の各スライドから1つの画像を取得します。同じ設定で定規を撮影秒。
  2. 、梗塞の中間に隔壁厚さ、左心室（LV）腔面積、梗塞領域、およびLVの組織領域を使用して瘢痕の厚さを測定するために画像解析ソフトウェアを使用します。
    1. 定規の画像（ 図1A）とのスケールを設定します。
      1. セット変換係数を選択し測定をクリックします。キャリブレーションバー上に線を描画します。右の写真をクリックすると、エンド・キャリブレーションをクリックしてください。バー値をメモして、[OK]をクリックします。
    2. 染色されたハートの絵（ 図1B）からLVを選択します。 複数のセグメントのツールを使用します。 LVポイントバイポイントを選択し、右クリック コピー/どこにでも貼り付けます。
    3. 単一セグメントの測定ツールを使用して傷や隔壁の厚さを測定する（ 図1C ）。
    4. 自動LV腔、梗塞を検出し、LV領域はRGBモード（ 図1D）における自動面積測定ツールを使用して。
      1. ツールをクリックします。アクティブにのみ罫線と RGBモードでの連続 。最後に、それを検出するために、関心領域内をクリックします。必要に応じて、精密なツールを使用しています。
  3. LV面積に対する梗塞面積の割合としての梗塞サイズを計算します。
  4. 次のように拡張インデックスを計算します[LV腔面積/全LV面積] / [梗塞厚さ/隔壁厚さ]、LV空洞とLVの組織領域の両方を含む全LVエリアと。
  5. 次のように最後に、それぞれの心のための「平均」を算出：[梗塞スライドから拡張インデックスの平均] * [梗塞スライド/スライドの総数の数]。

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結果

6週間後のLAD結紮、心臓をLewisラットから採取しました。 2mmの組織切片は、頂部から基部に得られました。 TTC染色手順は、白で表示され、梗塞面積、および赤で表示され、健康な心筋（ 図2）を可視化するために行きました。 LADの結紮の部位に応じて、梗塞サイズが異なります。大MIについて、貫梗塞は、ベース（ 図2A）に頂点から観察されました。小さい梗塞、心臓（ 図2B）の中央部分に頂点から見える白い梗塞組織を提示しました。小さな非貫梗塞の場合は、線維性組織は、頂点（ 図2C）からの1つまたは2つのセクションで観察されました。

各心臓スライスから薄い5μmの切片を切り出し、マッソン - ゴールドナートリクロームで染色しました。心の全体の断面の写真でした実体顕微鏡下で取得（ 図3）。

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ディスカッション

プロトコル内の重要なステップ

線維性組織は正確に採取し、心臓や画像の系統的なサンプリングを使用して、慢性MIラットモデルで評価することができる頂点にベースから得た三色染色した組織切片の分析。 2つのステップが成功したプロトコル実装のために特に重要です。まず、心臓の収穫のためのKClを使用することは、心臓の筋肉が弛緩した状態に維持することができます。このステップは、異なる心臓から梗塞寸法の比較のために重要です。第二に、ブアン液中のセクションの一晩の固定は明るいトリクローム染色を得るために重要です。

修正およびトラブルシューティング

染色の不在は、このような減少インキュベーション時間として、ブアン液中のセクションの固定中に問題が原因であるか、ブアンソリューションを満了してもよいです。 TTC染色はオプションとcoulです急速が、非定量的な方法で、梗塞の大きさを可視化するために使用されるDはTTCは前10月...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、スイス国立財団[SNF 310030-149986 to MNG]、フリブール大学、およびフリブール病院の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アクリルラット心臓マトリックス2ミリメートル72-5015ドAppartus
Inspira高度なボリューム制御人工呼吸器ハーバード装置557058
カテーテルInsyte14 GBD381267
O.C.TBDHA361603EVWR
TTCT8877-10Gシグマアルドリッチ
メイヤーヘマトキシリンMHS32-1Lシグマ アルドリッチ
アシッド フクシン
CI 42685		F8129-50Gシグマ アルドリッチ
ポンソー キシリディン
CI 16150		P2395-25Gシグマ アルドリッチ
オレンジ G
CI 16230		O3756-100Gシグマ アルドリッチ
ライト グリーン
CI 42095		L5382-25Gシグマ アルドリッチ
KClP9333-500Gシグマ アルドリッチ
キシロール10315083ハネウェル
エタノール アブソリュート10303990ハネウェル
2-メチルブタンM32631-1Lシグマ アルドリッチ
立体顕微鏡SM2800ニコン
ホルムアルデヒド99340Reactolab
埋め込みカセットK113.1Carl Roth
Bersoft 画像測定ソフトウェアBersoft.comライセンスソフトウェア
ハーバー

参考文献

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