遠心重力によって脂肪由来幹細胞の軟骨形成分化誘導

サマリー

機械的ストレスは幹細胞の軟骨分化を誘発し、損傷した軟骨の修復のための潜在的な治療アプローチを提供します。遠心重力(CG)を使用して脂肪由来幹細胞(ASC)の軟骨形成分化を誘導するプロトコルを提示します。CGによるSOX9のアップレギュレーションは、軟骨原性表現型の発症をもたらします。

要約

障害のある軟骨は自然に治癒することができません。現在、軟骨の欠損に対する最も先進的な治療法は、サイトカインを用いて幹細胞から分化した軟骨細胞の移植です。残念ながら、サイトカインによる軟骨分化は、コストと時間がかかり、in vitro分化中の汚染リスクが高くなります。しかし、生体力学的刺激は、軟骨形成の重要な調節因子としても機能します。例えば、機械的ストレスは幹細胞の軟骨分化を誘導する可能性があり、軟骨障害の修復に対する潜在的な治療アプローチが示唆されています。本研究では、遠心分離によって容易な機械的ストレスである遠心重力(CG, 2,400 × g)が、脂肪由来幹細胞(ASC)の性決定領域Y(SRY)-box 9(SOX9)のアップレギュレーションを誘導し、軟骨原性表現型を発現させることを実証しました。遠心分離したASCは、アグリカン(ACAN)、コラーゲン2型α1(COL2A1)、コラーゲン1型(COL1)などの軟骨形成分化マーカーを高レベルで発現しましたが、肥大型軟骨細胞のマーカーであるコラーゲン10型(COL10)のレベルは低かった。さらに、遠心分離されたASCでは、軟骨形成の前提条件である軟骨形成凝集体形成が観察されました。

概要

関節軟骨の欠損は、自然治癒しません。したがって、幹細胞移植は、障害、軟骨の修復のための有望なアプローチとして提案されています。しかし、この方法は、幹細胞の十分な数の取得および軟骨形成分化を受けるため、これらの細胞の誘導の両方を必要とします。骨髄（BM）が広く、幹細胞の供給源として使用されているが、BMからの細胞の単離は、2つの主要な欠点があります侵襲性および不十分な収率。なぜなら取得が容易で、脂肪組織は、幹細胞の好ましい供給源です。以前の研究は、脂肪組織から幹細胞を単離し、例えば^{、TGF-β11、2}のようなサイトカインを用いたこれらの細胞における軟骨形成分化を誘導することの実現可能性を実証しました。これらの方法は有効であるが、高価です。

サイトカインに対する低コストの代替手段として、機械的応力をするために使用することができます軟骨形成分化を誘導します。機械的荷重は、関節軟骨³の健康を維持する上で重要な役割を果たし、それが種々の細胞における軟骨形成の表現型を誘導することができます。例えば、静水圧は、MAPキナーゼ/ JNK経路^4を介して滑膜由来前駆細胞における軟骨形成の表現型を誘導し、そして機械的圧縮は軟骨細胞の遺伝子^5をアップレギュレートすることによって、ヒト間葉系幹細胞（MSC）で軟骨形成を誘導します。また、せん断応力は、ヒトMSC ⁶における軟骨形成に関連した細胞外マトリックス（ECM）の発現に寄与する。遠心重心（CG）、遠心分離によって生成さ容易に適用され、制御機械的応力は、セル⁷で異なる遺伝子発現を誘導することができます。例えば、肺上皮癌細胞において、インターロイキン（IL）-1bの発現を遠心分離⁸によってアップレギュレートされます。 Therefore、実験的に誘導機械的応力として、CGは、幹細胞における軟骨の遺伝子発現を誘導するために使用することができます。しかし、CGは、幹細胞の軟骨形成分化を誘導することができるかどうかは不明のままです。

本研究では、CGは軟骨細胞の遺伝子の過剰発現の結果、人間のASCで、SOX9、軟骨形成のマスターレギュレータのアップレギュレーションを誘導したことがわかりました。また、我々は、TGF-β1のものと軟骨のCGの効果は、成長因子は、最も一般的には、幹細胞にインビトロ軟骨形成を誘導するために使用される比較しました。

プロトコル

この研究プロトコルは、カトリック大学校（KC16EAME0162）の施設内倫理委員会によって承認され、NIHガイドラインに従って実施しました。すべての組織は、書面によるインフォームドコンセントが得られました。

1.遠心重力ロードとペレット文化

1. 細胞培養および収穫
   1. 培養のASC（P2-P3、材料のリストを参照）を37℃で10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）を補充したダルベッコ変法イーグル培地 - 低グルコース（DMEM-LG）に5％CO _2を含む加湿インキュベーターです。
   2. 細胞が80％コンフルエンスに達したとき、培地を廃棄し、1×リン酸緩衝生理食塩水5mLの（PBS）で細胞を洗浄します。
   3. 1mMのEDTAを含有するPBSを1ml加え、5％CO ₂を含む加湿インキュベーター中、37℃で2分間インキュベートします。
   4. 静かに培養プレートをタップして、新鮮な培地の4 mLを加え、に細胞を移します15-mLコニカルチューブ、および室温（RT）で2分間、250×gで細胞を遠心します。
2. 遠心重力荷重
   1. 遠心分離（ステップ1.1.4）の後、ペレットを乱すことなく、上清を除去し、10％FBSを含むDMEM-LGの10 mL中にペレットを再懸濁。血球計数器を用いて細胞を数えます。
   2. CGのロードについては、15分間、2400×gで新しい15 mLコニカルチューブと遠心分離機に2.5×10 ⁵個^の細胞を移します。
3. ペレット培養
   1. 直ちに遠心分離後、上清を吸引し、定義された軟骨形成分化培地500μL（CDM、1％FBSを補充した高グルコースDMEM、1％ITS +プレミックス、100nMのデキサメタゾン、1×MEM非必須アミノ酸溶液を追加し、50μgの/ mLのL-プロリン、および1％ペニシリン/ストレプトマイシン）。すべての培地交換で新たに調製したL-アスコルビン酸を50μg/ mLの2リン酸を追加します。ポジティブコントロールとして、軟骨形成differentiatiを誘導追加することにより、遠心分離していない細胞内にCDMは、10ng / mLのTGF-β1を含みます。
   2. 立った姿勢でペレットを含むゆるくキャップチューブを置き、5％CO _2を含む加湿インキュベーター中、37℃でインキュベートします。
   3. 3週間一日おきに培地を変更します。
4. マイクロマス培養
   1. 直ちに遠心分離（ステップ1.2.2; 15分間、2400×gで）後、上清を吸引し、CDMの10μLにペレットを再懸濁。
   2. マイクロマスを形成するために、24ウェルプレートのウェルの中央に再懸濁した細胞を配置します。
   3. 2時間後、慎重にマイクロマスの中断を避けるために、プレートの壁にも、ピペッティングにCDMの1 mLを加え。ポジティブコントロールとして、10ng / mLのTGF-β1を含むCDMを追加することにより、遠心分離していない細胞とマイクロマス培養を行います。
   4. 5％CO _2を含む加湿インキュベーター中で37℃でマイクロマス培養します。
   5. メディアEVを変更3週間先日ERY。

2.逆転写酵素 - ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）は、軟骨細胞分化マーカーの転写アップレギュレーションを検出します

1. 14日目に、新しい1.5 mLチューブに回転楕円体ペレットを転送し、1×PBSでそれらを洗浄するためのピペットを使用しています。
2. グアニジンチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出法^9を使用して、ペレットから全RNAを抽出します。
3. 製造業者のプロトコルに従って逆転写酵素を用いて全RNAの2μgのからcDNAを合成し（1時間、42℃でインキュベートし、次いで5分間70℃で酵素を不活性化します）。
4. 軟骨形成分化マーカー¹⁰に特異的なプライマーを用いてPCRを行います。

3.染色は、軟骨形成分化マーカータンパク質の過剰発現を検出するために、

1. パラフィン包埋細胞ペレット
   1. 21日目に、回転楕円体ペレットを収穫し、1×PBSでそれらを洗浄するためのピペットを使用しています。
   2. 24時間、4％パラホルムアルデヒド中に浸漬することによりスフェロイドペレットを修正しました。
      注意：パラホルムアルデヒドは、非常に有毒です。眼、皮膚、または粘膜との接触を避けます。露出を最小限に抑え、準備中に吸入を避けます。適切な個人保護具を着用します。
   3. 固定液を捨て、脱イオン水（DW）で細胞ペレットをすすぎます。
   4. カセット上にガーゼの一つの層を配置し、ピペットを用いて固定されたペレットを転送します。ガーゼを折り曲げることによってペレットを覆い、カセットのふたを閉じます。
   5. ペレットを脱水。
      1. 室温で5分間、70％エタノール（EtOH）中でペレットを浸し。
      2. 室温で5分間、80％エタノールでペレットを浸し。
      3. RTで5分間、95％エタノールでペレットを浸します。
      4. 室温で5分間、100％エタノールでペレットを浸します。二回繰り返します。
      5. RTで15分間、100％キシレン中でペレットを浸します。繰り返しTWICE。
   6. 金型内で56℃のパラフィンで固定細胞ペレットを埋め込みます。ペレットは、特殊な自動化組織処理システムを使用してパラフィンに埋め込むことができます。
   7. ロータリーミクロトームを用いてパラフィン包埋細胞ペレットから厚さ5μmのセクションをカット。
   8. 50％EtOH中でセクションをフロートした後、スライドを使用して、50℃の水浴に転送します。
   9. スライド上にフローティングのセクションを配置します。
2. サフラニンOおよびアルシアンブルー染色
   1. パラフィン切片を再水和します。
      1. 15分間キシレンにスライドを浸し。二回繰り返します。
      2. 5分間100％エタノールでスライドを浸し。二回繰り返します。
      3. 5分間90％エタノールでスライドを浸し。
      4. 5分間80％エタノールでスライドを浸し。
      5. 5分間70％エタノールでスライドを浸し、その後、1×PBSでそれらを洗ってください。
   2. 1％サフラニンO溶液および3％アルシアンブルーのための再水和のセクションを染色30分。
   3. 染色液を捨て、DWでセクションをすすぎます。
   4. 1分間ヘマトキシリン/エオシン溶液（対比）を持つセクションを染色。
   5. 染色液を捨て、DWでセクションをすすぎます。
   6. 任意の残留水を除去した後、カバーガラスの取り付け培地のドロップを置きます。慎重にマウンティング培地を含むカバーガラスのスライド（セルサイドダウン）を配置。
   7. スライドを室温で2〜3時間乾燥することができます。
   8. 明視野顕微鏡（自動正立顕微鏡、50Xおよび200X）を使用して画像をキャプチャします。
3. 免疫蛍光測定法
   1. セクション3.2.1で説明したようにセクションを再水和。
   2. クエン酸ナトリウム緩衝液（10mMクエン酸ナトリウム、0.05％のTween 20、pH6.0）でのスライドを浸漬し、その後、マイクロ波を用いて10分間、サブ沸騰温度でそれらを維持します。
   3. RTで20分間スライドを冷却した後、水道水で洗っ。
   4. 3％のスライドをインキュベート15分間（1×PBS中の）H ₂ O _2、その後15分間¹¹水道水で洗っ。
   5. 1時間、緩衝液（PBS中10％正常ヤギ血清）でブロッキングしてスライドを阻止します。
   6. ブロッキング溶液を吸引し、次いでスライド上に5％正常ヤギ血清で希釈した一次抗体を適用します。
   7. 4℃で一晩スライドをインキュベートします。
   8. 5分ごとに、1×PBS中でスライドを3回洗浄します。
   9. 暗所で室温で1時間、5％正常ヤギ血清で希釈した蛍光標識二次抗体中でスライドをインキュベートします。
   10. 暗所で5分間ずつ、1×PBS中でスライドを3回洗浄します。
   11. 10分間DAPI（1μg/ ml）でスライドをインキュベートし、その後5分間毎に1×PBSでそれらを2回洗浄します。
   12. 任意の残留水を除去した後、カバーガラスの取り付け培地のドロップを置きます。慎重に取り付け媒体上にスライド（セルサイドダウン）を配置。
   13. スライドは2-3のために乾燥することができます室温で暗所で時間。
   14. ^12;蛍光顕微鏡（：594 nmで、DAPI 60Xおよび200X倍率340 nmのRhod）を使用してスライドを可視化します。

結果

遠心重力は、脂肪由来幹細胞における軟骨形成分化マーカーの過剰発現を誘導します。

軟骨形成分化を誘導するのに適している遠心重力の程度を決定するために、ASCを15分間CG（0、300、600、1,200及び2,400 XG）の異なる程度で刺激しました。刺激後、ASCを培養プレート上に再播種し、24時間培養しました。 図1Aに示すように、SOX9 mRNA発現は有意に2,400×gで増加しました。それは、（ASCにはCGでロードされていない）対照に比べて2,400×gで約1.5倍高かったです。 CGは軟骨細胞分化を誘導するか否かを確認するために、我々は、CGの負荷によって、またはTGF-β1処理によってのASCを刺激しました。陰性対照として、ASCを、任意の刺激なしで培養しました。サンプルは、14日目に採取し、定量RT-PCRを行いました。 Fに示すように1 igure、COL2A...

ディスカッション

細胞の幹細胞性の状態は、SOX9のCG誘発性過剰発現のために非常に重要です。我々の研究では、SOX9の発現はなく、後述する通路のASCで、初期継代のASC（2-3）でCGによって誘発される可能性があります。培養中、ASCを3継代¹⁶までCD34 +細胞を含む、ことが報告されています。 ASCは、細胞がCGに低応答特性が得られ、継代されているとして、CD34の発現を失う傾向があります。

遠心重力と、静水圧は、CGの刺激の間に細胞にロードすることができます。従って、媒体の体積は、SOX9の誘導に影響を与える要因の一つであってもよいです。各実験についても静水圧環境を維持するために、培地の1 mLを15 mLチューブ中の1×10 ⁵個の細胞ごとに使用しました。また、スイングバケットローターを均等に（直角を形成することによって）セルCGを適用するために使用しました。

TGF-β1と比較すると、CGがに低い能力を示しましたSOX9とのASCでの軟骨形成マーカーの発現を...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Plasticware
>100 mm ディッシュ	TPP	93100
60 mm ディッシュ	TPP	93060
50 mL コーニカルチューブ	SPL	50050
15 mL コーニカルチューブ	SPL	50015
10 mL 使い捨てピペット	ファルコン	7551
5 mL 使い捨てピペット	ファルコン	7543
ASC 培養培地 Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM 低グルコース	Life Technologies	11885-084	成長ベース培地
ペニシリン ストレプトマイシン	Sigma Aldrich	P4333	1%
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044	10%
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
軟骨分化培地 材料
>DMEM 高グルコース	Life Technologies	11995	軟骨分化培地
MEM 非必須アミノ酸溶液 (100x)	Life Technologies	11140-050
デキサメタゾン	Sigma Aldrich	D2915	100 nM
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333	1%
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044	1%
Ascorbate-2-phosphate	Sigma Aldrich	A8960	50 μg/mL
L-プロリン	Sigma Aldrich	P5607	50 μg/mL
ITS	BD		1%
ヒトTGF&β;1	Peprotech	100-21	10 ng/mL
Materials
18 mm カバーガラス	スーペリア	HSU-0111580
4% パラホルムアルジヒド	Tech &イノベーション	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
ウシ血清アルブミン	ベクターラボ	SP-5050
抗コラーゲンII抗体	abcam	ab34712	1:100
ヤギ抗ウサギIgG (H+L) 二次抗体、Alexa Fluor 594 コンジュゲート	分子プローブ	A-11037	1:200
DAPI	分子プローブ	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
スライドガラス、コーティング	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
クロロホルム	Sigma Aldrich	366919
イソプリピルアルコール	ミリポア	109634
エタノール	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10xTBE Buffer	Life Technologies	15581-044
ローディングスター	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) DNA ラダーマーカー	Enzynomics	DM003
ヒト脂肪由来幹細胞 (ASC)	Catholic MASTER Cells