ここでは、ヒトの抗凝固血液の密度勾配遠心分離後に、末梢血単核細胞からの磁気ビーズ分離によって単球がどのように単球を単離されるかを示します。5日間のインキュベーション後、ヒト単球は未成熟樹状細胞に分化し、非臨床環境での実験手順の準備が整います。
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この記事について
サマリー
要約
樹状細胞(DC)は、ウイルス、細菌、真菌などのさまざまな病原体の外来構造を、その細胞表面に発現するさまざまなパターン認識受容体(PRR)を介して認識し、それによって免疫を活性化し、調節します。
DCの主な機能は、MHC IおよびMHC II分子を介して抗原をナイーブTリンパ球に提示することにより、リンパ節における適応免疫を誘導することです。したがって、DCは、感染部位で病原体を認識した後、末梢からリンパ節に移動する必要があります。in vitro実験やDCワクチン接種戦略では、単球由来のDCが日常的に使用されています。これらの細胞は、生理機能、形態、および機能において、従来の骨髄性樹状細胞と類似性を示しています。これらは、健康なドナーから単離された単球のインターロイキン4(IL-4)および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)刺激によって生成されます。ここでは、密度勾配遠心分離による末梢血単核細胞(PBMC)濃縮後、抗凝固ヒト血液から単球がどのように単離され、刺激されるかを示します。ヒト単球は未成熟DCに分化し、5日間のインキュベーション後に非臨床環境での実験手順の準備が整います。
概要
樹状細胞（DC）は、我々の免疫系の最も重要な特殊な抗原提示細胞です。未成熟DC（iDCを）は、皮膚または粘膜組織に存在し、侵入する病原体と対話するための最初の免疫細胞の間で、したがってあります。彼らは病原体検出、次のTおよびB細胞応答を活性化することができますので、DCは、先天性および適応免疫系1との間のブリッジを表します。さらに、それらは、IL-1β、IL-6、およびIL-12などのためのサイトカインの多量の分泌の前炎症性免疫応答に寄与する。 DCはまた、NK細胞を活性化および走化性によって感染部位に他の免疫細胞を引き付けます。
DCは、未成熟樹状細胞（iDCを）とその形態および機能に基づいて、成熟樹状細胞（mDCの）2に分けることができます。多くのパターン認識受容体（ 例えば、Toll様受容体、C型の1による外来抗原の認識後レクチン、または豊富に細胞表面に発現）受容体を補完する、iDCをは大きな変化を受け、成熟し始めます。この成熟過程の間に、抗原捕獲のための受容体はダウンレギュレートされ、抗原提示に必須の分子がアップレギュレートされている一方、3。成熟DCアップレギュレート主要組織適合遺伝子複合体の抗原提示およびTリンパ球の活性化に必須であるCD80およびCD86のようなIおよびII（MHC I及びII）、共刺激分子、。さらに、細胞表面上のケモカイン受容体CCR7の発現は、リンパ節への末....
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プロトコル
倫理の声明：書面によるインフォームドコンセントは、輸血＆免疫学専攻、インスブルック、オーストリア中央研究所によってすべての参加血液ドナーから得ました。科学的な目的のために匿名残りの標本の使用はインスブルック医科大学の倫理委員会によって承認されました。
末梢血単核細胞（PBMC）の1濃縮
- 遠心分離によるPBMCの濃度。
- 受け取った血液の量に応じて滅菌50ミリリットルの遠心分離管に血液パックとスプリット血液を開きます。
- 必要に応じて、無菌のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）で各チューブのために50ミリリットルにボリュームを調整します。
- 遠心分離にチューブを配置し、ブレーキなしで室温（RT）で15分間400×gでそれらをスピン。
- boundarを残し、滅菌10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて血漿および血小板を含む上層をオフに描きますy層を乱さ。
注：代わりに、FCSの自己血漿を培養培地を補充するために使用される場合、血漿を回収しなければならず、この段階で熱不活性化。 - 2 50mlの遠心管から単核細胞（境界層）を収集し、滅菌した10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、1つの無菌50mlチューブに移します。
- 滅菌D-PBSを用いて各チューブのための50ミリリットルにボリュームを調整します。
- 遠心分離にチューブを配....
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結果
スクロースクッションを用いて抗凝固処理血液の遠心分離後、末梢血単核細胞（PBMC）は、密度勾配媒体（ 図1）の上に中間相が富化されています。 PBMCを引き出された後、FACS分析は、（Bリンパ球のために、例えば、Tリンパ球のためのCD3、単球のためのCD14、およびCD19）系列マーカーを用いたPBMC内の異なる細胞集団を特徴付けるために行われます。 図2Aは、密度勾配遠心分離後に回収し、染色したPBMCの代表的なFACS分析の結果を示します。ゲートされた人口（ 図2A、上のプロット）のうち、我々は、4.03パーセントのBリンパ球、28.20パーセントの単球、および43.62パーセントは、Tリンパ球（ 図2A、下のプロットそのうち67.62パーセント、他の細胞（ 図2A、中央のプロット）を、検出されました）。
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ディスカッション
このプロトコルは、磁性ナノ粒子ベースのアッセイを用いて抗凝固血液からヒト単球の単離を通して単球由来樹状細胞（MDDCs）の生成を説明しています。このプロトコルでは、遠心分離工程は、PBMC画分の濃縮につながる細胞単離手順、上流で行われます。細胞を遠心分離中に失われているが、密度勾配媒体200〜300ミリリットル必要とする密度勾配媒体の全血パックの内容をオーバーレイし、したがって、コスト効率的と考えることができません。また、積極的分離プロセス中に抗ヒトCD14磁性粒子の付着に影響クリーナー細胞集団における遠心分離結果のPBMCの濃縮。さらに、様々なDCサブセットまたはマクロファージのインビトロ分化のために使用することができる生存可能な単球集団における単球結果、磁性ナノ粒子の分離。
組織培養またはゼラチンコーティングしたプラスチック皿上遵守媒介精製のような過去に使用され、他のプロトコルに比べてこの技術の利点は、高純度で単離された細胞集団の均質性だけでなく、利便性がありますそして、スピード。細胞を操作するとき、一般的には、非生理的条件への長期.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この原稿に関して貴重な支援と支援をしてくださった、私たちの技術者である衛生・医療微生物学部門のKarolin Thurnes氏、およびCentral Institute for Blood Transfusion and Immunological DepartmentのAnnelies Mühlbacher博士とPaul Hörtnagl博士に感謝します。この研究を支援してくださったオーストリア科学基金(P24598からDW、P25389からWP)に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 | BD Biosciences 555415 | ||
| APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e | BD Biosciences | 551073 | |
| BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles | BD Biosciences | 557769 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| BSA (Albumin Fraction V) | Carl Roth | EG-Nr 2923225 | |
| Costar 6 Well Clear TC処理マルチプルウェルプレート | Costar | 3506 | |
| 密度勾配媒体:Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-5442-03 | |
| Dulbecco'リン酸緩衝生理食塩水(D-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 10 ml 血清ピペット | コーニング | 357551 | |
| ファルコン 25 ml セロジカルピペット | コーニング | 357525 | |
| ファルコン 50 mlの高明瞭度PPの遠心分離機の管 | コーニング | 352070 | |
| 鷹の丸底の管 | コーニング | 352054 | |
| FITCのマウス 反人間CD3クローンHIT3a | BDの生物科学555339 | ||
| Ghost Dye Violet 510 (細胞生存率の試薬) | トンボ生物科学 | 13-0870 | |
| GM-CSF | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-862 | |
| 熱不活化 FBS (ウシ胎児血清)、EU 承認原産地 (南米) | Gibco | 10500-064 | |
| Hettich Rotanta 460R | Hettich | --- | |
| IL-4 CC | PromoKine | C-61401 | |
| アイソレーションバッファー: BD IMag バッファー (10x) | BD Biosciences | 552362 | |
| L-グルタミン溶液 | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 微量遠心チューブ、1.5 ml、SuperSpin | VWR | 211-0015 | |
| PE マウス 抗ヒト CD14 クローン M5E2 | BD バイオサイエンス 555398 | ||
| PE マウス 抗ヒト CD209 クローン DCN46 | BD バイオサイエンス | 551265 | |
| RPMI-1640 培地 | シグマ-アルドリッチ | R0883 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA、pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 |
参考文献
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
- Steinman, R. M., Inaba, K., Tur....
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