方法論記事

植物の細胞や細胞小器官の壁を越え遺伝子やタンパク質を輸送するために、ペプチド由来方法

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DOI：

10.3791/54972

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2016年12月16日

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1Enzyme Research Team, RIKEN Center for Sustainable Resource Science

この記事について

サマリー

既存の植物改変の方法は適用性が限られています。ここで提案されている新しいペプチド由来の技術は、無傷の植物の目的の細胞内コンパートメントへの外因性タンパク質または遺伝子の導入における簡便性と効率性の両方を約束します。

要約

植物に外因性タンパク質を導入し、特定の遺伝子を発現(またはダウンレギュレーション)する能力は、基礎研究のための強力なツールを提供するだけでなく、植物バイオテクノロジーの分野での新たな応用にも貢献します。現在、植物細胞へのタンパク質や遺伝子の移入に有効な方法、すなわちアグロバクテリウムや微小発射体への導入には、形質転換頻度が低い、宿主の範囲が限られている、装置やマイクロキャリアのコストが高いなどの欠点があります。以下のプロトコールは、合理的に設計されたペプチドを、植物に取り込むさまざまな核酸およびタンパク質ベースの貨物の送達剤として採用する、シンプルで汎用性の高い方法の概要を示しています。ペプチドは、その生分解性、サイズの縮小、多様で調整可能な特性、および細胞内/オルガネラアクセスを得る能力により、システム開発のツールとして選択されています。幅広い配送貨物(プラスミドDNA、二本鎖DNAまたはRNA、タンパク質)の各タイプに最適化された製剤の調製、特性評価、および適用について説明します。また、プロトコール内の重要なステップ、可能な変更、およびメソッドの既存の制限についても説明します。

概要

植物の遺伝子工学は、従来、有益な形質を植物に移すために使用されています。近年、この技術は、植物をバイオファクトリーに変換して、薬学的に重要で商業的に価値のあるタンパク質を生産するために適用されていますが、その多くは化学的に合成できず、動物や微生物システムを使用して生産するには非常に高価です1。新しい遺伝子の導入により、植物自身の代謝を操作して、抗体、代謝酵素、ホルモン、抗原、ワクチン2などのさまざまなバイオ医薬品を生産できます。

植物のための確立された遺伝子導入技術は、アグロバクテリウム媒介送達3、DNA被覆微小発射体(バイオリスティックス)4による衝撃、およびプロトプラストのエレクトロポレーション5またはポリエチレングリコール6処理です。プロトプラストを必要とする技術は、時間がかかり、面倒で、一貫性のない結果をもたらすため、一般的に避けられます7。その結果、現在、ほぼすべての植物改変作業は、遺伝子導入のためにアグロバクテリウムまたは微小発射体のいずれかを利用しています。アグロバクテリウム法はより広く使用されていますが、経済的に重要な多くの植物種には適用できません。一方、微小発射体爆撃は、感受性の高い植物が多岐にわたるため、より用途が広いですが、特殊な機器が必要であり、多くの場合、深刻な組織損傷を引き起こします。さらに、これらの方法は、ランダム(バイオリスティック)または複合体(アグロバクテリウム)の送達メカニズムを含み、形質転換率が変動します8。そのため、シンプルでありながら効果的で、さまざまな植物種に適用できる新しい植物形質転換技術が求められています。

現在、植物は、標的タンパク質の直接的な送達ではなく、主に望ましい形質をコードする外因性DNAの送達によって遺伝子改変を受けています。タンパク質に対するDNAの安定性が高いことは、主な利点です。それにもかかわらず、DNA送達に関連する潜在的な問題には、植物ゲノムへの外因性DNAのランダムな挿入、および遺伝子の水平導入を介した抗生物質耐性遺伝子の病原性細菌への意図しない伝達が含まれる9。ゲノム編集の目的では、細胞に外来DNAを導入せずに植物ゲノムを編集できる能力は、遺伝子組み換え植物に関連する規制上の懸念を回避できる可能性がある。したがって、タンパク質の直接送達による植物の改変のための代替DNAフリー戦略は、これらのニーズに応えることができるでしょう。

ここでは、もともとヒト遺伝子治療10-14のために開発されたペプチドベースのシステムを紹介します。これは、無傷の植物における外因性遺伝子またはタンパク質の標的送達のためのものです。ペプチドは、ヌクレアーゼ分解からDNAを保護することができ、細胞内および細胞小器官膜15-17を横切る遺伝子導入を媒介することができる。それらはまた、非細胞毒性18-20であることに加えて、多様で調整可能な特性を有する。さらに重要なことは、ペプチドの使用により、遺伝子をミトコンドリア21や色素体(葉緑体)22などの細胞内小器官に正確に標的化して発現させることができることであるが、これは生物的形質転換やアグロバクテリウム媒介形質転換では達成できない課題である。カーゴの種類に応じて、この新しい植物改変技術は、タンパク質23を送達するために利用することができ、植物内の特定の遺伝子を発現(プラスミド21,24または二本鎖DNA25)またはダウンレギュレーション(二本鎖RNA26)するか(二本鎖RNA 26)するか、その細胞質空間24-26全体または特定のオルガネラコンパートメント21内で行うことができる。設計されたキャリアペプチドは、ポリリジン(K8)またはポリリジン-コヒスチジン(KH)9のいずれかの形態のカチオン性ドメインで構成され、負に帯電したカーゴの結合および/または縮合を行い、細胞貫通性(BP100ペプチド)またはミトコンドリアトランジット(Cytcoxペプチド)配列に結合します。

プロトコル

ペプチドベースの製剤の調製

  1. 次のように各ペプチドのストック溶液を準備します（KH）9 -BP100（1ミリグラム/ mlまたは800 nM）を、Cytcox-（KH）9（1 mg / mlで）、BP100（1mg / ml）および（BP100）2 K 8（70μM）。 1.5ミリリットルマイクロチューブに各ペプチドの必要量を計量し、ペプチドを溶解させるためにオートクレーブ滅菌超純水を追加します。透明な溶液が得られるまで繰り返しピペッティングによりよく混合します。
  2. 標準的な分子方法に従って、プラスミドDNA（pDNAを）、二本鎖DNA（dsDNA）および二本鎖RNA（dsRNA）を増幅し、精製します。 1.5ミリリットルのマイクロチューブでは、1 mg / mlで（のpDNAおよび二本鎖DNA）または400 nMの（のdsRNA）の濃度の原液を作ります。
  3. 炭酸ナトリウム溶液（0.1 M、pHを9）1mlのタンパク質（ 例えば 、アルコールデヒドロゲナーゼ、ADH）粉末1mgを溶解することによって、7μMの濃度のタンパク質ストック溶液を調製します。 fにタンパク質にラベルを付けますローダミンB（RHB）としてluorescentプローブ細胞に送達タンパク質の顕微鏡可視化を可能にするために、標準的なプロトコルに従って。
  4. 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ中の各成分を組み合わせます。
    1. ペプチドのpDNA製剤は細胞質を標的とするため、pDNAを（1mg / ml）を20μlに6.4μlの（KH）9 -BP100（1mg / ml）を追加し、ピペットでよく混ぜます。混合物を25℃で15分間安定させます。 800μlの最終体積に溶液を希釈するためにオートクレーブ処理超純水の773.6μLを加えます。核発現（P35S-RLUC-TNOS、 表1）のために設計されたpDNA構築体を使用してください。
    2. ペプチドのpDNA製剤は、ミトコンドリアを標的とするため、pDNAを（1mg / ml）を20μlにCytcox-の6.6μlの（KH）9（1mg / ml）を追加し、ピペットでよく混ぜます。混合物を25℃で15分間安定化した後、BP100の2.4μlの（1mg / ml）を追加することができます。混合物を25℃で15分間安定化させます6、さらに15分間、C。 800μlの最終体積に溶液を希釈するためにオートクレーブ処理超純水771μlを添加します。ミトコンドリアの式（：RLUC、 表1 pDONR-COX2）のために設計されたpDNA構築体を使用してください。
    3. ペプチドのdsDNA製剤について、二本鎖DNA（1mg / ml）を8μlに5.1μlの（KH）9 -BP100（1mg / ml）を追加し、ピペットでよく混ぜます。混合物を25℃で15分間安定させます。 800μlの最終体積に溶液を希釈するためにオートクレーブ処理超純水の786.9μLを加えます。
    4. ペプチドのdsRNA製剤については、dsRNA（400 nM）を50μlに50μlの（KH）9 -BP100（800 nM）を追加し、ピペットでよく混ぜます。混合物を25℃で15分間安定させます。 800μlの最終体積に溶液を希釈するためのRNaseフリー水700μlを添加します。
    5. ペプチド-タンパク質製剤のために、ADHの16μlの（7μM）に（BP100）2 K 8（70μM）の16μlを添加し、混合よくピペッティングにより。混合物を25℃で15分間安定させます。 800μlの最終体積に溶液を希釈するためにオートクレーブ処理超純水768μlを添加します。
  5. 製剤は25℃で15分間安定させます。

ペプチドベースの製剤の2キャラクタリゼーション

  1. 動的光散乱（DLS）分析用のキュベットに各溶液（800μl）を転送します。 173°の後方散乱検出角度で25℃で633nmのHe-Neレーザーを使用して、ゼータナノサイザーで形成された複合体の流体力学的直径および多分散性指数を決定します。
  2. 以下の大きさの測定は、25℃での誘電率、屈折率、水の粘度のデフォルトパラメーターでゼータ電位測定に折り畳まれたキャピラリーセルに各溶液（800μl）を転送します。
  3. 原子間力顕微鏡によって、DLS分析のために使用される複合体溶液の少量を、観察（AFM）。マイカシートの新たに露出した切断された表面上にデポジット複合体溶液を10μlとは、カバーされたプラスチックシャーレで一晩乾燥空気にマイカを残します。
  4. モード27,28タッピングに1.3 N /メートルのばね定数を有するシリコンカンチレバーを用いて、25℃の空気中の複合体の画像を取得します。

植物の葉の3浸潤

  1. 3週齢の土壌栽培された植物（ シロイヌナズナ 24、 ベンサミアナタバコ 24またはポプラ26）を使用します。遺伝子発現またはタンパク質送達の定量のための三重として機能する少なくとも3つの葉をトランスフェクトします。
  2. 1葉のトランスフェクションのための複雑な溶液100μlで1ミリリットル無針プラスチックシリンジをロードします。葉の背軸面にシリンジの先端を置きます。
  3. 少し葉に対するシリンジチップを押すと私との対抗圧力をかけながら、ゆっくりとシリンジのプランジャーを押し下げます反対側からラテックス手袋をはめた手のNDEX指。成功浸透葉における水浸領域の広がりとして観察することができます。識別を容易にするために潜入した葉にラベルを付けます。
  4. ペプチドのpDNA（12時間）での浸潤を、次の最適化の期間のためにトランスフェクトされた葉をインキュベートし、ペプチド - 二本鎖DNA（12時間）、ペプチドのdsRNA（9から48時間）、次の条件の下で、ペプチド - タンパク質（6時間）製剤：16時間明/ ベンサミアナタバコのための29℃でのシロイヌナズナとポプラ、または24時間一定の光のために22℃で8時間の暗いです。

トランスフェクション効率の4.評価

  1. 消費税全体は小さい植物の葉（ 例えば 、 シロイヌナズナ ）以上の植物（ 例えば 、N。ベンサミアナ ）のために潜入した領域の1cm 2のセクションをトランスフェクトしました。
  2. ウミシイタケルシフェラーゼ（Rlucを）レポーターベクターを用いたトランスフェクション実験のために、transfectioを決定n個の効率を定量Rlucをアッセイキットを使用して。
    1. 1.5ミリリットルマイクロチューブにそれぞれ切除した葉または葉のセクションを配置します。チューブあたり1×Rlucをアッセイ溶解バッファー100μlを添加します。同様に、非トランスフェクト対照葉（三重）の溶解物を準備します。
    2. 均質化乳棒を用いて葉を粉砕し、6、25℃で、得られた溶解物をインキュベート - 10時間。
    3. 1分間微量で12470×gで溶解液を遠心分離します。 96ウェルマイクロプレート中でウェルに転送清澄化ライセートを20μlを、製造業者のプロトコルに従って、BCAタンパク質アッセイキットを用いて全タンパク質濃度の定量のための残りの容量を使用します。
    4. ウェルに1×Rlucをアッセイ基質（Rlucをアッセイ緩​​衝液を用いて希釈）の100μlを添加して、ゆっくりとピペッティングにより混合します。マルチモードマイクロプレートリーダーでマイクロプレートを配置し、測定を開始します。
    5. バックグラウンド発光（なしの平均値を減算しますn型トランスフェクト三重）各実験サンプルのルミネセンスから。タンパク質（mg）の量にフォトルミネッセンスの比（相対光単位、RLU）を計算します。
  3. 緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーターベクターまたは蛍光標識されたタンパク質（ 例えば 、ADH-RHB）を用いてトランスフェクション実験のために、共焦点レーザー顕微鏡を用いて蛍光を観察します。
    1. あるとして区分された葉を使用することができる一方で、全体の葉（エアスペースの除去を補助するため）のエッジをカットします。 10ミリリットルのシリンジからプランジャーを取り外し、注射器内の各切除した葉または葉のセクションを配置します。
    2. プランジャーを交換し、葉を粉砕することなく、注射器の底に静かに押し込みます。それが約半分満たされるまで、注射器に水を引きます。
    3. 上向きに注射器を指し、先端を通って注射器から空気を除去するために、プランジャーを押し込みます。注射器の先端を覆い、リーから空気を排出するためにゆっくりプランジャーをプルダウンF。葉が半透明に表示されるまで、このプロセスを数回繰り返します。
    4. 粘着テープで顕微鏡スライドの表面を覆います。ブレードを使用して、葉のサンプルを収容するのに十分な大きさのテープ上の正方形の領域を切り出し、試料室を作成するためにピンセットでテープの正方形の部分をはがし。テープは、スライドとカバーガラスとの間のスペーサーとして機能します。
    5. 背軸面を上に向けてチャンバー内に葉を置き、水で残りのチャンバ領域を埋めます。ガラスカバースリップでチャンバ内に葉を密封し、粘着テープでカバースリップの端を固定します。
    6. 40X対物または63X水浸対物レンズ下で共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて葉試料を調べます。 GFPまたはRHB蛍光は、それぞれ、488nmのまたは555ナノメートルの励起波長で可視化することができます。

結果

核酸およびタンパク質の貨物のアレイが正常に送達ベクターとして設計されたペプチドを用いて種々の植物に導入しました。カチオン性ペプチドと、負に帯電した貨物との間の静電相互作用は、直接針注射器（ 図1）を用いて葉植物に浸透することができ、トランスフェクション複合体の形成をもたらしました。植物細胞のトランスフェクションのために最適化された製剤は、（経験的に、これらの研究21,23-26で決定）配信貨物（pDNAを、二本鎖DNAは、dsRNAおよびタンパク質）の広い範囲の各タイプが表現され、表1に記載されています。 300 nmの - すべてのペプチドベースの製剤の平均直径は、150のおおよその範囲でした。 DLS分析に基づいて、すべての製剤が形成されるペプチド - カーゴ凝集体は均一なサイズ分布を有することを示し、相対的に低い大きさの多分散性を示しました。の形態ペプチドとのpDNA（ 図2A）またはタンパク質との間の複合体（ 図2B）は 、雲母に、AFMで画像化しました。均一な球状複合体は、DLS測定からのデータと一致して、ペプチドのpDNAおよびペプチド - タンパク質の組み合わせの両方について観察されました。 dsRNAをベース複合体は中性付近の表面電荷を有していた複合体（ 表1）のゼータ電位の面では、pDNA-および二本鎖DNA由来の複合体は、正味の負の表面電荷を持っていました。ペプチド - タンパク質複合体は、一方で、正に荷電しました。

ペプチドのpDNAとモデルプラントシステムとしてシロイヌナズナやベンサミアナタバコのトランスフェクションを媒介する際のペプチドのdsDNA製剤の効率は定性的ならびに定量的に評価しました。 RLUC遺伝子発現アッセイは、この実験のpDNAのために、したがって、遺伝子発現レベルの定量化（ 表1）のために使用されましたかRLUC遺伝子をコードする二本鎖DNAは、それぞれのキャリアペプチドとの複合体を使用する必要があります。使用（KH）9 -BP100 / pDNAの処方、pDNAの核標的送達および発現は、約1×10 5の推定RLU / mgの値で、12時間のインキュベーション期間の後、達成することができます。 pDNAを、ペプチドの組み合わせのミトコンドリア標的化送達および発現のために、Cytcox-（KH）9及びBP100は、複合体形成のために必要とされます。 12時間の同じ最適化された潜伏期間では、しかし、トランスフェクションのはるかに低いレベル（約1×10 3 RLU / mg）を達成しました。一方、同様のインキュベーション期間（12時間）、および遺伝子発現レベル（約1×10 3 RLU / mg）をさらに9 -BP100ペプチド（KH）を用いて処方、二本鎖DNAに基づく複合体のために記録/必要でした。遺伝子発現の定性評価は錯体preparで処理された葉を直接顕微鏡観察により行いましたEDは、のpDNAを用いて、または二本鎖DNAがGFPレポーター遺伝子をコードします。非標的ペプチドのpDNA複合体でトランスフェクトされた細胞では、GFP発現が明らかに観察され、細胞質ゾル（ 図3A）に局在することが見出されたと対応する緑色蛍光を拡散します。 GFP蛍光の局在パターンにおける明確な違いは、ミトコンドリア標的化ペプチドのpDNA複合体を浸透させた細胞で明らかでした。ここでは、ミトコンドリアの染色と共局在点状の緑色蛍光は、細胞のミトコンドリアのコンパートメント（ 図3B）に独占的に遺伝子発現の特異性が確認された、見えました。

ペプチド - タンパク質製剤の場合には、フルオロフォア（RHB）へのタンパク質カーゴ（ADH）の結合は、細胞内区画内に送達タンパク質の可視化を可能にします。 6時間の短いインキュベーション期間内に、ADH-RHBタンパク質（青）全体に分散されることが見出されましたサイトゾルおよび浸潤した細胞の液胞（ 図3C）。一方、遺伝子発現の迅速かつ効率的なダウンレギュレーションは、ペプチドのdsRNA製剤を用いた各種プラントで達成することができます。ペプチド-dsRNAは干ばつ条件下でアントシアニンを担当するカルコンシンターゼ遺伝子（CHS）（赤色顔料）生合成を沈黙させる複合体で最初の実験では、 シロイヌナズナの葉を浸潤させました。 シロイヌナズナの外観の違いは（ 図3D、a）と干ばつは（ 図3Dは 、b）に最適化されたペプチドのdsRNA製剤を使用して、CHSサイレンシングを評価するための簡単な手段を提供する（矢印1潜入領域を示している）、通常の下に残します。第2の実験では、ペプチドのdsRNA複合体は、黄色蛍光タンパク質（YFP）を発現するトランスジェニックシロイヌナズナの葉に浸潤させました。 YFP発現の明らかな減少は表皮細胞9時間Pに見ることができましたOST-トランスフェクション（ 図3E、F）。異なるプラントシステム（ポプラ、12時間後にトランスフェクション）でダウンレギュレートする遺伝子発現の製剤の有効性はまた、（ 図3G、H）を確認しました。

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図1： リビング植物への核酸やタンパク質の貨物の配達のためのペプチドベースの製剤。
設計されたキャリアペプチドは、細胞貫通またはオルガネラトランジット配列に結合させ、ポリカチオンで構成されています。ポリカチオンは、細胞内への内在以下のエンドソーム区画からの結合および/または負に帯電した貨物の縮合と同様に脱出可能にします。特定の細胞小器官への細胞内へのカーゴの送達およびその後は、それぞれ、細胞透過配列およびオルガネラ輸送配列によって媒介されます。 successfu可能性があり、様々な貨物LLY植物に送達核酸例えばpDNAを、二本鎖DNAとのdsRNAのような酸、並びにウシ血清アルブミン（BSA）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）とシトリン（黄色蛍光タンパク質の変異体）などのモデルタンパク質が挙げられます。生物活性分子は、シリンジ浸潤葉植物に導入されている静電相互作用を介して 、ペプチド結合体でのトランスフェクション複合体を形成することができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図2： ペプチドベースの製剤のモルフォロジー。
（KH）N / P 0.5で9 -BP100 / pDNAの処方の（A）AFM振幅画像。 （B）（BP100）モルRATIで2 K 8 / ADH製剤のAFM高さ画像O 10は、公開されたソース23,24からの許可を得て転載します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図3： 最適化されたペプチドベースの製剤を使用してトランスフェクション効率の微視的評価。
（A）細胞質GFP発現（緑）、葉緑体の自家蛍光（赤）と明確に区別は、 シロイヌナズナのスポンジ状の葉肉細胞は（KH）9 -BP100 / pDNAを処方（N / P 0.5で浸潤葉で観察された。12時間）。 （B）GFP発現（緑）は、各peptidためCytcox-（KH）9 / BP100 / pDNAを処方（N / P 0.5を浸透させたシロイヌナズナの葉の表皮細胞中のミトコンドリア（赤）で検出されました電子; 12時間）。 GFP発現とミトコンドリアの拡大画像は、極端な右パネルに表示されます。 10のペプチド/タンパク質のモル比で（C） シロイヌナズナのスポンジ状の葉肉細胞へのADH-RHB（青）の配信が（BP100）によって媒介される葉2 K 8は 、6時間後の浸潤を可視化しました。前（D） シロイヌナズナの葉の（a）及び（KH）9 -BP100 / dsRNAを製剤（モル比2、48時間）と（b）の処理後、アントシアニン生合成経路の抑制をもたらしました。 GFP5のdsRNAを含有する同様の製剤は、陰性対照（C）のような葉に浸潤させました。矢印2,4は、リーフ内の非浸潤領域を示し、一方、矢印1および3は、浸潤領域を示します。 （E） シロイヌナズナは、黄色蛍光タンパク質（YFP）を発現し、（F）と減少したYFP蛍光以下の浸潤を残します （KH）9 -BP100 /のdsRNA製剤（モル比2; 9時間）。 （G）、黄色蛍光タンパク質（YFP）及び（H）（KH）9 -BP100 / dsRNAを製剤に減少YFP蛍光以下の浸潤発現するトランスジェニックポプラの葉（モル比2; 12時間）。公開されたソース21,23,24,26からの許可を得て複製。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図4： ペプチド対DNA（N / P）比および複合体の生物物理学的特性に及ぼす影響の変化。
DNA比にペプチドの増加に伴って、ペプチドベースの製剤は、負から正へのゼータ電位値遷移しながら、サイズが減少します。/files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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表1： 様々なペプチドベースの製剤の特性と評価。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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表2：無傷の植物のためのペプチドをベースと他の既存のDNA送達技術の比較。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

経験的に同定されているプロトコル内の重要なステップが説明されています。シリンジ浸潤によって、ペプチドベースの製剤は、気孔を介して植物の葉の内部空域内に導入されます。植物は、すなわち気孔開口部を助長している条件であるときにソリューションの最大の取り込みを確実にするために、浸透プロセスが実施されるべきである。、十分な水で、ライト期間中に提供されました。トランスフェクション複合体の準備に関しては、（ミトコンドリアを標的DNA送達のための）2つのペプチドの組み合わせを伴う製剤について、各成分の添加順序は重要であり、反転すべきではありません。

手続きに多くのもっともらしいの変更があります。植物細胞の浸潤のための別のオプションは、以下を含む植物全体および/または部分的な組織に複雑なソリューションを導入することができる真空浸潤を使用すること、です頂端分裂組織。この代替的な手順については、苗木は、トランスフェクション溶液に浸漬され、真空によって発生した圧力に基づいて、ペプチド - カーゴ複合体は、気孔を通って植物細胞（吉住、T.、未発表データ）に強制されます。

動物細胞を用いた研究に基づいて、一過性の遺伝子発現は、より高いDNA濃度が29-31で増加することが示されています。 DNAに対するペプチドの比は、複合体の生物物理学的特性（サイズ、表面電荷）に影響することに注意することはトランスフェクション効率に影響を与える（ 図4）は 、重要です。従って、最適比も増大DNA濃度で維持される必要があります。

遺伝子/タンパク質の送達剤としてのペプチドの使用における主な利点の1つは、その配列が所望の機能を果たすためにチューニングすることが適しているということです。例えば、キャリアペプチドのミトコンドリア標的化ドメインは、このスタッドに記載しますyは、これらの細胞小器官に局在化のため葉緑体またはペルオキシソーム標的化配列で置換することができます。葉緑体の形質転換は、微粒子銃32-34を使用して、いくつかの植物では可能であるが、 アグロバクテリウムやバイオリスティック法のいずれも、核（ 表2）に加えて、ミトコンドリアまたは他の細胞小器官に遺伝子を導入することができます。

アグロバクテリウムベースの方法（ 表2）とは異なり、ペプチドベースのトランスフェクションには、剛性宿主範囲の制限は、ありません。これまで、 シロイヌナズナのトランスフェクションのための製剤は、 ベンサミアナタバコ及びポプラ（ 表1）を 、最適化されているが、この方法はまた、 タバコに適用することができます トマト品種マイクロトム、米（予備実験に基づく）、および他の単子葉及び双子葉植物。

ペプチドが使用されるとき、まだように、導入遺伝子の大きさには既知の制限は存在しませんトランスフェクションベクター。対照的に、大きなDNA分子は、 アグロバクテリウム媒介法35,36の形質転換効率、及び37-39に報告されている約200κBのトランスジーンのためのサイズの上限を減少させることが見出されています。微粒子銃を使用して、一方で、大きなDNA断片を植物38に調製または送達中に剪断することができます。上限は、これまでに遺伝子銃形質転換のために決定されていないが、物理的な制約がはるかに少ない150よりKB 40に転送することができるDNAの大きさを制限することが見出されています。上述のアグロバクテリウムまたは微粒子銃のいずれかを使用する既存のアプローチと比較して、遺伝子導入のためのペプチドベースのシステムを使用することの主な利点は、 表2に要約されています。

それが立つようにいくつかの制限は、この方法のために存在します。まず、そのようなMITなどの特定の細胞小器官へのpDNAの配信をターゲットに効率は低かったもののochondria、DNA結合、細胞透過性およびオルガネラ輸送の配列の単純な組み合わせによって可能と証明されています。導入遺伝子の発現は、細胞内のミトコンドリアの小集団において、共焦点顕微鏡によって、検出することができます。細胞/細胞小器官膜を通過する複数の複合体の移動を高める、および（ii）発現のための標的細胞小器官への解離およびキャリアペプチドのpDNAの伝達を改善（I）：従って、さらなる修正は必要にしています。第二に、このDNAの送達システムを使用して、外因性のレポーター遺伝子の一過性発現は、正常細胞の細胞質ゾルおよびミトコンドリア区画に達成されました。植物の核/オルガネラゲノム中に導入された遺伝子の安定した取り込みおよび発現が原因で、適切な選択方法が存在しないために、しかし、まだ確立されていません。

改善やさらなる日間領域があることを認めつつevelopmentは、ここに記載のペプチド由来の戦略は、多様な植物の種類にさまざまな貨物の配達のための道を開いた、シンプルで汎用性の高い技術のまま。

開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

著者らは、独立行政法人科学技術振興機構探索研究先端技術（JST-ERATO）、新エネルギー・産業技術総合開発機構（NEDO）、及び府省の戦略的イノベーション促進プログラム（SIP）、日本からの資金を承認したいと思います。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
(KH)9-BP100ペプチドカスタム合成:理化学研究所N/A配列:KHKHKHKHKHKHKHKHKHKH-
KHKKLFKKILKYL
(BP100)2-K8ペプチド合成:理化学研究所脳科学総合研究センターN/A配列:KKLFKKILKYLKKLFKKIL-
KYLKKKKKKKKKK
BP100ペプチドカスタム合成:理化学研究所脳科学総合研究センターN/A配列:KKLFKKILKYL
Cytcox-(KH)9ペプチドカスタム合成:理化学研究所脳科学総合研究センター カスタム合成N/A配列:MLSLRQSIRFFKKHKHKHKH-
KHKHKHKHKHKHKHKH
P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOSN/AN/ACaMV 35S構成プロモーターの制御下で、緑色蛍光タンパク質およびRenillaルシフェラーゼ遺伝子をそれぞれコードします(参照:Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)
pDONR-cox2:gfpおよびpDONR-cox2:rlucN/AN/Acox2ミトコンドリア特異的プロモーターの制御下で、緑色蛍光タンパク質およびRenillaルシフェラーゼ遺伝子をそれぞれコードします(参照: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)
dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS)N/AN/A CaMV35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)
GFP5 siRNAN/AN/Aをそれぞれコードします。緑色蛍光タンパク質のRNA干渉媒介サイレンシング(参照:沼田et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
CHS siRNAN/AN/Aカルコン合成酵素のRNA干渉媒介サイレンシング(参照:沼田et al Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
1 mlおよび10 mlプラスチックシリンジテルモ(株)SS-01T, SS-10ESZ
1.5ml 微量遠心チューブアズワン151212
96ウェル平底板旭硝子3860-096
粘着テープ積水化学工業(株)No. 835
アルコール脱水素酵素Sigma-Aldrich Co., LLC.A-7011
原子間力顕微鏡セイコーインスツル(株)SPI3800、SPA 300HV
原子間力顕微鏡日立ハイテクサイエンス株式会社AFM5300E
BCAタンパク質アッセイキットサーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社23227
カンチレバー日立ハイテクサイエンス株式会社K-A102001593
共焦点レーザー走査顕微鏡カールツァイスLSM700
コルク穴あけ器Sigma-Aldrich Co., LLC.Z165220直径1cmの円盤状への葉の切除用
CoverslipMatsunami Glass Ind., Ltd.C02261
キュベットザルスタット759116
折り畳み毛細血管セルMalvern Instruments, Ltd.
ForcepsShimizu Akira Inc.ステンレスピンセット 150
質化乳棒家田商事株式会社9993
マイカ日新EM株式会社LC23Z
微量遠心機ベックマン・コールターBKA46472
マイクロプレートリーダーモレキュラーデバイス株式会社Spectra MAX M3
顕微鏡スライド松波ガラス工業株式会社
ピペットEppendorf Research® plus3120000909
Pipette TipsAS ONECorporation 2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03
プラスチックペトリ皿AS ONECorporation 1-7484-01
Renilla Luciferase Assay KitPromega CorporationE2810
ローダミンB イソチオシアネートシグマ・アルドリッチ(株)
RNaseフリーウォーターキアゲン129112
炭酸ナトリウム和光純薬工業(株)199-01585
外科用ブレードとハンドルFEATHER Safety Razor Co., Ltd.ステンレス No.14(刃)、No.3L(ハンドル)
シリンジチップキャップ株式会社武蔵エンジニアリングNC-3E
天秤ザルトリウスCPA225D
ゼータ ポテンショメータマルバーン・インスツルメンツゼータサイザーナノ-ZS
カスタムDTS1070均S011120283924

参考文献

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