歯髄の評価のための直接覆髄モデルの開発、創傷治癒およびマウスにおける修復象牙質形成

Summary

我々は、in vivoでの歯髄創傷治癒と修復象牙質形成の評価のために、マウスの歯の上にキャッピング直接パルプを行うステップ・バイ・ステップ方式を説明します。

Abstract

歯髄は、エナメル質と象牙質によって完全に保護されている歯の重要な器官です。齲蝕原性または医原性の損傷により歯髄が露出した場合、歯髄の創傷治癒を促進するために、生体適合性材料で蓋がされることがよくあります。最終的な目標は、「生物学的シール」として機能し、下にある歯髄組織を保護する物理的な障壁である修復象牙質を再生することです。この直接的な歯髄キャッピング法は、歯科では長い間使用されてきましたが、歯髄の創傷治癒と修復象牙質形成の根底にある分子メカニズムはまだ十分に理解されていません。修復象牙質を誘導するために、歯髄キャッピングは大型動物で実験的に行われてきましたが、マウスではそれほど多くありません。これは、おそらくサイズが小さく、その後の技術的な困難が原因です。ここでは、クラスI様空洞の調製、歯髄キャッピング材料の配置、歯科用複合材料を使用した修復手順など、マウスで歯髄キャッピング手順を実行する詳細なステップバイステップの方法を示します。私たちの歯髄キャッピングマウスモデルは、研究コミュニティで広く利用可能なトランスジェニックマウスまたはノックアウトマウスの使用を可能にすることにより、in vivoの修復象牙質の文脈で歯髄創傷治癒の基本的な分子メカニズムを調査するのに役立ちます。

Introduction

虫歯は、最も一般的な口腔疾患の1つであり、ほとんど全ての個人における歯列への外科的介入の主な原因となっています^1,2。外科的介入と歯の修復の予後は、適切な歯髄の反応と創傷治癒の成功に大きく依存します。実際、エナメル質や象牙質を深く貫通する虫歯は、水酸化カルシウム(Ca(OH)₂)や三酸化カルシウム凝集体(MTA)などの水硬性ケイ酸カルシウムセメント(HCSC)などの歯科材料で「キャップ」されることが多い下層の歯髄組織の露出につながることがよくあります。このような歯髄キャッピング手術の最終的な目標は、修復象牙質を再生することにより、歯髄の創傷治癒を促進することであり、これは「生物学的シール」として機能する物理的障壁であり、下にある歯髄組織を保護し、歯の平均寿命と全体的な口腔の健康を延ばすことです。しかし、歯髄創傷治癒と修復的象牙質形成の根本的なメカニズムは完全には理解されていません。

生体内での歯髄創傷治癒と修復象牙質形成のメカニズムをよりよく理解するために、サル、イヌ、ブタ^3-5を含むいくつかの動物が以前に使用されていました。その中でもラットは、他の動物に比べてサイズが比較的小さいため、頻繁に使用されるが、その歯は技術的な問題なしに直接歯髄キャッピングを行うのに十分な大きさである^6-10。これらの動物モデルは、歯髄の反応と修復的な象牙質形成を調べるための人間の研究の理想的な代替手段です。しかし、その利用は細胞レベルでの観察研究に限られており、分子レベルでの修復象牙質形成におけるメカニズムの洞察はほとんど得られません。

近年の遺伝子工学の技術的進歩は、過剰発現または欠失した遺伝子を持つマウスという、生体内でのヒト疾患の分子メカニズムの研究に役立つ、非常に貴重で不可欠な研究ツールを提供しました。科学界では、細胞特異的な方法で戦略的に誘導可能なトランスジェニックマウスまたはノックアウトマウスのさまざまな系統の数が絶えず増加しています。したがって、これらのマウスで歯髄の創傷治癒と修復象牙質の再生を調べることは、分子レベルでのこれらのプロセスの理解を大いに促進するのに役立ちます。しかし、マウスの歯に歯髄をキャッピングすることは、その小型化のために技術的に困難であるため、マウスの使用は大幅に減少します。ここでは、in vivoでの歯髄創傷治癒と修復象牙質形成の評価のために、マウスで直接歯髄キャッピングを行う再現性のある方法を紹介します。

Protocol

マウスは、ジャクソン研究所から購入し、実験動物医学のUCLA課（DLAM）における病原体のない動物施設で飼育しました。実験は、学長の動物研究委員会（ARCの＃2016から037）から承認された機関のガイドラインに従って行いました。

1.マウスの麻酔

1. 8週齢の雌C57 / BL6マウスを使用した（n = 3）。
2. ケタミン（マウス体重の80から120ミリグラム/キログラム）/キシラジン（5 mgの/マウスの体重のkg）の溶液を用いてマウスを麻酔し、10 mLの/ kgの用量で腹腔内（ip）に投与します。
3. ケタミンを準備します（80から120ミリグラム/キログラム）/キシラジン（5mg / kg）ソリューションおよび10 mLの/ kgの用量で腹腔内（ip）に、それらを管理します。
4. マウスが完全につま先のピンチを実行することにより麻酔していることを確認します。

2.パルプキャッピング手順

1. マウスの口に口ホルダーを配置します。
2. 彼そのようなテーブルの上に口ホルダーを固定します広告が上向きにされています。
3. 最初の上顎臼歯が完全に表示されるように、口の上に顕微鏡（10倍）を配置します。
4. パルプは透明象牙質を介して表示されるまで20万rpmで高速ハンドピースで1/4ラウンドバーを使用して、途中で歯のエナメル質の部分を削除します。バリでパルプを公開しないでください。
5. ＃15歯内K-ファイル（150μmの直径）を使用して、象牙質を通して穿孔し、パルプを公開します。
   注：象牙質の破片は、パルプ中に押し込まれないように特別な注意が必要です。これは、四半期ごとのK-ファイルを回転した後、K-ファイルアウトを引っ張ることによって回避することができます。
6. 製造元の指示に従って滅菌H ₂ OでMTAを混ぜます。エクスプローラの先端で露出してパルプにMTAを提供し、配置します。穏やかなタッピングによって公開されたパルプにMTAをパックするために、紙ポイント（ファイン）の裏面を使用してください。紙点の厚い側は平坦であるため、でき露出されたパルプへのMTAの適切な凝縮のため。
7. それだけで歯をカバーして35％リン酸エッチング液を配置することにより、15秒のための歯をエッチングします。それは歯肉組織を刺激することができるように、エッチング液の配置を制限するために特別な注意を払ってください。
   注：エッチング液をシリンジに来て、歯科用接着剤は、歯の上にマイクロメカニカル結合を媒介することで流れることができるように、歯の表面を粗面化するために使用されます。それらは粘性であるため、それが歯に直接少量を適用することによって、自己完結型であることができます。
8. エッチング液を除去するために、負の圧力をかけ吸引を使用してください。軽くエッチング剤の残留物を除去するために、H ₂ Oで浸漬された綿ペレットを使用してください。エッチング液が歯から完全に除去されるまで、この手順を繰り返します。
9. 圧縮エアダスターを使用し、軽く歯を乾燥させます。
10. 紙ポイントの裏面を使用した歯科用接着剤を適用します。
11. 3秒間の圧縮空気を使用して接着剤層を薄く。
12. C言語URE硬化光ユニットを用いて20秒間の歯科用接着剤。
13. MTAでキャップされた歯の上に少量で流動可能な複合材料を配置します。歯の溝に複合体を流れるようにエクスプローラの先端を使用してください。
14. それを重合する光硬化ユニットを用いて30秒間複合体を硬化します。コンポジットが完全に硬化し、ハードエクスプローラを使用していることを確認してください。

3.術後のケア

1. すぐに覆髄手順の後にカルプロフェン（5 mgの/ kg）を皮下（SC）を管理します。
2. 彼らが目を覚ます前に暖かい動物を保つために低電力で加熱パッド上にマウスを置きます。
3. 住宅用ビバリウムにマウスを返します。

4.組織調達

1. 5の後 - 6週間、イソフルランとの完全な麻酔状態の下で頸椎脱臼によりマウスを安楽死させます。
2. 慎重に頭蓋底から上顎を除去し、50 mLチューブに入れて。 entirを修正しました。4℃で一晩、パルプでキャップされた歯とPBS、pH7.4中の4％パラホルムアルデヒドでキャップされていない反対側の歯の両方が含まれ、その後70％エタノール溶液に保存し、電子の上顎。
   注：パラホルムアルデヒドは有毒で発癌性です。標準作業手順（SOP）に概説されるように適切な使用のパラホルムアルデヒドを監視する必要があります。
3. μCTスキャンを用いてマウスの上顎をスキャンします。 70％エタノールを浸したガーゼでサンプルをラップし、15 mLの細胞培養チューブの中に置いて、スキャン中に上顎を固定します。

5.μCTスキャン

1. μCTスキャンのためのサンプルを準備します。簡潔には、70％エタノールに浸したガーゼで試料をラップし、一般的な15-mLの細胞培養コニカルチューブに固定します。メーカーの説明書で概説されるように、μCT走査ステージ上にチューブをマウントします。
2. 145μAの電流55のkVpの電圧、及び2の露光時にX線源を設定します00ミリ秒。
3. 20μmの解像度でと0.5ミリメートルのAlフィルタとμCTスキャナーで画像取得を実行します。
4. 画像を再構成し、それ^11を視覚化^します 。
5. μCTスキャンが完了すると、2週間、5％EDTA、PBS中4％スクロース（pH7.4）で脱灰し始めます。

6.組織処理と染色

1. パラフィンで脱灰組織を埋め込みます。埋め込む前に、すぐに第一大臼歯の前方矢状カットを行うことで、上顎をトリミング。埋め込む一方で、第一大臼歯の縦断面が切断面となるように、下向きのこの面を配置します。
2. ミクロトームを用いて、厚さ5μmのスライドを準備します。パルプキャップ領域は、通常、ランドマークとして使用することができるdistopalatal（DP）ルートと一致します。光学顕微鏡下で組織学を調べ、μCT画像を比較することにより、関心の正確な面積を決定します。
3. H＆E染色、deparaのためffinize、キシレン（2回）と連続的に希釈したエタノール（100％エタノール2回、95％エタノール2倍、および70％エタノール1×）でスライドを再水和。
4. 水道水でスライドを洗浄します。
5. 2.5分間ヘマトキシリン溶液で染色し、水道水ですすいでください。
6. 1分間、95％エタノールでスライドを浸します。
7. 1分間エオシン溶液で染色し、水道水ですすいでください。
8. 連続希釈したエタノール（70％エタノール1倍、95％エタノール2倍、および100％エタノール3×）、キシレン（3×）で脱水。
9. マウントソリューションでスライドをマウントします。

Results

ここでは、マウスの歯にキャッピングパルプを実行するためにステップバイステップの手順を示しました。マウスでキャッピングパルプの重要な側面の一つは、適切な装置を持つことです。この点において、10Xパワー倍率で顕微鏡を有する（ 図1A）が不可欠です。歯のClass-I様準備を作成するには、20万回転（ 図1B）の電気高速ハンドピースに1/4ラウンドのバリを使用しました。あるいは、圧縮空気を使用するものを含む他のエンジンは、歯を調製するために使用することができます。

図2A-2Eは、パルプキャッピングを実行するための代表的な手順が示されています。クラスIのような製剤は、（ 図2B）を行いました。水スプレーは、手順の間にマウスを紛らすことがあるので、その使用は推奨されません。このため、優しくintermiで歯を調製することが不...

Discussion

現在、歯髄幹細胞^{（DPSCs）13}の歯原性分化に歯科材料、足場、または成長因子のin vivoでの効果を検証するために利用可能ないくつかの異なる実験モデルがあります。これらのモデルは、腎カプセル、または足場^14,15と免疫不全マウスにDPSCsの皮下移植などの臓器へのDPSCsの異所性自家移植が含まれます。しかしながら、これらの方法はDPSCsに対するそれらの歯原性効果は同所パルプ環境で行われていないという点で制限されています。一方、歯の上パルプ、パルプ・キャッピング手順に同所移植は大型動物^16,17で使用されています。これらのモデルは同所環境で歯原性の可能性を評価する上で貴重であるが、それらのモデルの使用は、パルプ創傷治癒と修復象牙質形成に限定されたメカニズムの洞察を提供し、自然の中で主に観察されます。

本稿では、マウスでは、パルプ・キャッピングを実行するための詳細な方法を提示します。このステップバイステップの手順では、μCTスキャンで分析し、修復象牙質形成のための組織サンプルを評価し、上...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BM-LED実体顕微鏡	明治テクノ		マイクロスコープ
オプティマ MCX-LED	Bien Air Dental	1700588-001	Electic motor engine
isoflurane	Henry schein animal health	NDC 11695-0500-2
1/4 round bur	Brasseler	001092T0
Endodontic K-file	Roydent	98947
ProRoot MTA	Dentsply	PROROOT5W	MTA
Paper point	Henry schein	100-3941
ウルトラエッチング	・ウルトラデント・プロダクツ株式会社		リン酸エッチング剤
OptiBond SoloPlus	Kerr	29669	接着剤
Coltolux LED	Coltene/whaledent Inc.	C7970100115	硬化ライトユニット
特性評価	色合い ビスコ	T-14012	流動性複合材
スカイスキャン	ブロイカー	1275	uCT スキャナー
マイクロム	サーモ	HM355S	ミクロトーム
ヘマトキシリン-1	サーモサイエンティフィック	7221
エオシン-Y	サーモサイエンティフィック	7111
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-16	埋込溶液