このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

隣接セル受けてアポトーシス細胞死との相互作用によって生細胞に誘導されるイベントを細胞内シグナルの同定

8.1K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/54980

⸱

2016年12月27日

 ,  ,  ,  , 
1Section of Nephrology, Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Section of Nephrology, Department of Medicine, Jesse Brown Veterans Affairs Medical Center, 3Department of Biology, Kutztown University of Pennsylvania, 4Division of Rheumatology, Department of Medicine, Research Institute of the McGill University Health Centre, 5Department of Microbiology & Immunology, University of Illinois at Chicago

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、隣接する死細胞または死にかけている細胞との物理的相互作用によって生存細胞に誘発される細胞内シグナル伝達イベントを決定するためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、死細胞の食作用取り込みまたは可溶性メディエーターの放出とは対照的に、死細胞の受容体媒介認識によって誘発されるシグナル伝達イベントに焦点を当てています。

要約

アポトーシスによって死細胞は、隣接する生細胞の機能に影響を与えることを可能に複数の新たな活動を取得し、調整された細胞死と呼ばれます。このような生存、増殖、成長、および分化などの生命活動は、アポトーシス細胞によって変調された多くの細胞機能の一つです。認識し、アポトーシス細胞に応答する能力にかかわらず、発信の系統または器官の、すべてのセルの普遍的な特徴であるように思われます。しかし、細心の注意が任意の特定の結果の責任シグナル伝達事象および経路を解剖に取られるアポトーシス細胞の義務に対する応答の多様性と複雑さ。特に、1はアポトーシス細胞を含む、実行可能な応答細胞内の細胞内シグナル伝達経路に影響を与えることが可能な複数のメカニズムを区別する必要がありますの受容体媒介アポトーシス細胞の認識、アポトーシス細胞による可溶性メディエーターの放出、および/または婚約をphagocytic機械。ここでは、アポトーシス細胞への曝露後の生存可能な応答細胞に誘導される細胞内シグナル伝達事象を識別するためのプロトコルを提供します。プロトコルの主な利点は、アポトーシス細胞が応答する細胞内シグナル伝達事象を調節するメカニズムの解剖に支払う注意にあります。プロトコルは、条件付きで不死化したマウスの腎臓近位尿細管細胞株（BU.MPT細胞）に特異的であるが、それは容易に原点非上皮細胞および/または腎臓以外の臓器に由来する細胞系に適合されます。刺激として死んだ細胞の使用は、細胞内シグナル伝達事象の検出を妨げることができますいくつかのユニークな要素を紹介します。これらの問題だけでなく、それらを最小化または回避するための戦略は、プロトコル内で議論されています。このプロトコルの適用は健康にし、diseaの両方で、死亡または瀕死の細胞は、それらのライブの隣人に及ぼす幅広い影響の私達の拡大の知識を支援する必要がありSE。

概要

アポトーシス、または規制された細胞死1は 、組織の維持・発展に不可欠な方法で貢献しています。最も単純に見ると、アポトーシスが損傷し、高齢者許可、または過剰な細胞が組織2,3の周囲に害を及ぼすことなく排除されます。組織ホメオスタシスに対するアポトーシスの寄与は、しかしながら、かなり動的で変化します。アポトーシスによる死細胞は、複数の新たな活動を取得し、両方の分泌され、細胞関連、隣接する生きた細胞4-10の機能に影響を与えるために、それらを可能にします。以前の研究は、炎症11-16を抑制するために、アポトーシス細胞の能力に焦点を当てたが、アポトーシス細胞はまた、生存4,9,10、増殖4,9,10、分化17、などの重要な活動を含む細胞機能の広い範囲を調節しますマイグレーション18、および成長19。また、これらの効果は、マクロファージのような専門の食細胞に限定されるものではありませんsの、そのような上皮および内皮細胞7,9,10,18-21として伝統的に非食細胞を含む、実質的にすべての細胞型および系統、にまで及びます。

アポトーシス細胞への曝露後に隣接する生きた細胞の特異的な応答は、生存応答細胞およびアポトーシス細胞自体の両方に関連する複数の要因に依存します。アポトーシス細胞への曝露は、マウスマクロファージおよび腎臓の近位尿細管上皮細胞（PTECs）の両方の増殖を阻害するが、例えば、これら2つの細胞型は、アポトーシス細胞4,6,9,10に対する生存応答に劇的に異なります。アポトーシス細胞は、マクロファージの生存を促進するが、PTECs 4,6,9,10のアポトーシス死を誘導します。特に、アポトーシス細胞に対する応答は、乳房上皮対 例えば 、腎臓PTECs（起源10の応答細胞の器官に応じて、同じであっても系統の応答細胞の間で異なる場合があります細胞）または活性化22の状態（ 例えば 、好中球）。逆に、アポトーシス細胞は、アポトーシス10,23またはアポトーシス10,14のステージを刺激の性質に依存して全く同じセル内の異なる応答を誘発することができます。

アポトーシス細胞に対する応答の多様性と複雑さを考えると、細心の注意は、任意の特定の結果の責任シグナル伝達事象および経路を解剖に注意しなければなりません。まず、生存可能とアポトーシス細胞との間の直接的な物理的相互作用を必要とする回答は、アポトーシス細胞3,6-10によって放出されたか、生成された可溶性メディエーターによって誘発されるものと区別されなければなりません。物理的な相互作用が必要な場合は、さらなる分化が行われるべきです。シグナル伝達事象は、アポトーシス細胞に特異的に結合する特異的受容体とは無関係に、その後の飲み込みの独立したアポトーシス細胞の受容体媒介認識、上、または貪食取り込みに依存してもよいです 3-7,9,10,19。後者の場合、応答は、アポトーシス細胞に特異的ではなく、任意の食作用物質4,6によってトリガすることができます。

これらの区別の重要性は、再びマクロファージおよび腎臓PTECsの応答を対比することによって理解することができます。両方の細胞型のために、アポトーシス細胞への暴露は、プロ生存キナーゼAktの活性を変化させます。 0.4μmのポリカーボネート膜により応答とアポトーシス細胞の分離が応答4,9,10,19を廃止するので変調は、物理的な相互作用に依存しています。マクロファージの応答は貪食4,9,10,19によって駆動されるのに対し、しかし、PTECsの応答は、受容体媒介および食作用とは無関係です。この結論は、ラテックスビーズ、中性食作用の刺激への曝露は、PTECsにおけるAkt活性に影響を及ぼさないという事実が、模倣マクロファージ4,9におけるアポトーシス細胞の効果によって強化されます。

">あまり研究が、壊死により死細胞、または偶発的な細胞死1、また3-10,19近くの生細胞の機能を調節する。アポトーシス細胞と同様に、壊死細胞は、様々なメカニズム、特に漏れを介してその効果を発揮しますその破裂し、細胞膜3,5,6,9,24を介して細胞内のコンテンツの。PTECsおよびマクロファージを含む多くの細胞は、壊死5,9により死細胞のための明確な非競合受容体を有する。これらの受容体の婚約があるシグナリング事象を誘発しますアポトーシス細胞は、リン酸化9,10,19を減少させる一方、アポトーシス細胞の受容体4-10,19の係合によって誘発されたものとしばしば反対。例えば、PTECsに、壊死細胞は、Aktのリン酸化を増加させます。

ここでは、隣接するアポトーシスPTECsの受容体媒介性の認識によって実行可能な腎臓PTECsに誘導される細胞内シグナル伝達事象を識別するためのプロトコルを記述します 9,10,19。プロトコルはBU.MPT細胞9,10,19,25,26のように知られている条件付きで不死化PTECの細胞株に特異的であるが、それは容易に原点非上皮および/または以外の臓器に由来する細胞系に適合されています腎臓。重要なことには、細胞刺激などのアポトーシス細胞の使用は、可溶性リガンドと共に存在しない特定の固有の実験的な困難をもたらします。これらの中で最も重要なのは、アポトーシス細胞を懸濁液としてではなく、溶液として添加されなければならないということです。これらの問題だけでなく、それらを最小化または回避するための戦略は、プロトコル内で議論されています。ほとんどのプロトコルに記載された技術のすべては、簡単で、細胞培養の標準です。このプロトコルの利点は、アポトーシス細胞が応答して細胞内のシグナル伝達を調節することにより、複数のメカニズムに注目です。これらのメカニズムは、表面決定を経由して結合または再上の特定の受容体に架橋分子が含まsponding細胞、可溶性メディエーターの放出、および/または食作用機械の締結。壊死細胞は、結果は、細胞死のモードではなく、死細胞に一般的な応答に特異的であることを保証するために、すべての実験に含まれています。このプロトコルで推奨されているように慎重なアプローチは、死にかけている細胞は、健康と病気の両方で、彼らのライブの隣人に及ぼす拡大を続ける影響の理解に重要です。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1.準備

注意：このプロトコルでは、2つ以上の細胞株または初代細胞培養物は、独立して、特定の条件下で調製されます。これらの製剤は、アポトーシス細胞（プロトコル1）、壊死細胞（プロトコル2）、および健康な応答細胞（プロトコル3）が挙げられます。独立した調製後、アポトーシスまたは壊死細胞は、応答細胞に添加し、得られたシグナル伝達は、（プロトコル4、5、および6）監視されます。

  1. 培地および試薬を準備
    1. 培養液Aの500 mLの準備（許容条件下での使用のために成長する細胞を、1.2節を参照）、以下を組み合わせることにより：1×ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）は4.5グラム/ Lのグルコース、584 mg / Lのʟグルタミン、110を含みますmg / Lのピルビン酸ナトリウム、100単位/ mLペニシリン - ストレプトマイシン、10％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）、および10単位/インターフェロンγ（IFN-γ）のミリリットル。
    2. 使用WHのための培養培地Bの500ミリリットル（調製非許容条件下での血清欠乏細胞エン、前血清飢餓に非許容条件（）で細胞を成長させるために培養液AのレシピからFBSおよびIFN-γを省略することによって、セクション1.2）を参照してください、10％vを追加培地Bへ/ v FBS
    3. 死細胞を固定するための4％ストックパラホルムアルデヒドから1×ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で、0.4％（v / v）のパラホルムアルデヒド、pHを7.2に調製します。
      注：パラホルムアルデヒドは毒性があり、かつ適切な注意が、その使用に注意を払うべきです。
  2. 文化BU.MPT細胞
    1. 液体窒素からBU.MPT細胞の1バイアルを解凍します。
      注：BU.MPTが主要なマウスの制御下でSV40ラージ腫瘍抗原（タグ）の温度感受性（TS）突然変異（株tsA58）を有するトランスジェニックマウス由来のマウス腎臓近位尿細管上皮細胞（PTEC）ラインであります組織適合遺伝子複合体（MHC）H-2K bのクラス私は25,26プロモーター。
    2. 無菌polystyr上のプレートの細胞エン真空ガスプラズマ処理された組織培養皿（直径100mm皿当たり約5×10 6細胞）。
    3. 加湿した5％（v / v）のCO 2雰囲気中で許容条件下で細胞を成長させます。
      注：33で培養物として定義されている許容条件下、 - IFN-γの存在下で、37ºCでは、株tsA58変異タグの導入遺伝子の安定な発現を可能にします。単一の通路または2以上生存しないマウス腎臓PTECの初代培養物とは異なり、BU.MPTは無期限に継代することができる許容する条件下で培養しました。
      1. 実験においてそれらを使用する前に、解凍後の継代細胞は、少なくとも3回。
        1. 継代細胞を、5分間、37ºCで（v / v）のCO 2雰囲気の加湿5％の100mmディッシュあたり0.05％トリプシンの1 mLを加え、そしてインキュベートします。媒体Aを吸引し、10mLのを分離した細胞を添加することによりトリプシンを中和し、そして1分割：滅菌ポリスチレン真空ガスプラズマTISSを処理し、新しい100 mmのに5：1〜3UE培養皿。 100ミリメートル皿当たり10ミリリットルの合計にボリュームを起動するために培地Aを追加します。
    4. 細胞応答としての実験的な使用のための準備では、非許容条件下で、加湿5％でコンフルエンスする細胞（v / v）のCO 2の雰囲気を成長させる（ すなわち、IFN-γの不在下で39ºCで[培地Bは、10％vを含みます/ vのFBS]）。
      注：非許容条件下で、株tsA58変異タグの導入遺伝子の発現は、> 95％阻害される、とBU.MPT細胞は、マウス腎臓PTECの初代培養のように振る舞います。

アポトーシスBU.MPT細胞（プロトコル1）の調製

注意：このプロトコルは、アポトーシス誘導の方法として、アポトーシス細胞の供給源、およびスタウロスポリンなどBU.MPT細胞に特異的です。あるいは、別の細胞株、または初代細胞培養は、標準化されたprotocoによって誘導されるアポトーシスに、アポトーシス細胞の供給源として使用することができますその特定の細胞型とアポトーシス誘導の方法LS。

  1. 直径100mmの滅菌ポリスチレン真空ガスプラズマ処理された組織培養皿に継代した後、で培地A中で37ºCで、すなわち （許容条件下（v / v）のCO 2雰囲気の加湿5％コンフルエントにBU.MPT細胞を成長させますセクション1.2.3で説明したように100ミリメートル皿当たり10 mL）で、。
  2. 接着細胞単層をリンス当たり10ミリリットルを用いて培養液Bで3回リンス。
  3. 37ºCで加湿した5％（v / v）のCO 2雰囲気下で3時間に1μg/ mLで、スタウロスポリンを含む培養培地B中で細胞をインキュベートすることによって非選択的タンパク質キナーゼ阻害剤のアポトーシスを誘導します。
  4. 単層から剥離してきた「フローティング」アポトーシス細胞を含むスタウロスポリン含有培地を吸引除去します。遠心分離機500×gで10分間この培地上清を捨て、培地Bでペレットを3回洗浄し、そして次のステップ、2.5に回収した細胞に戻ってペレットを追加します。
  5. Mg 5分間ディッシュあたり1 mLの2 +フリーDPBS - 1XのCa 2 + 5 mMの（エチレンジアミン四酢酸）、EDTAの添加によりステップ2.3および2.4から残りの接着細胞を切り離します。取り外したアポトーシス細胞を含むEDTA含有培地を吸引除去し、滅菌した15 mLのポリスチレン遠心管にステップ2.4からの「フローティング」アポトーシス細胞と分離した細胞をプールします。
  6. そして洗浄あたりのMg + 2を含まないDPBS - 500×gで再懸濁1XのCa + 2 10mL中で10分間遠心分離することにより、アポトーシス細胞を3回洗浄します。
  7. 最後の洗浄後、応答細胞を刺激するために使用する前に、mL当たり〜5×10 6個の細胞で新鮮な培養培地B中のアポトーシス細胞を懸濁。代替的に、30分間、1×DPBS中の0.4％（v / v）のパラホルムアルデヒド中で洗浄し、アポトーシス細胞を固定し、その後培養で3回洗浄し培地Bに中断前の媒体B、
  8. 必要に応じて、以前6,9,10,15に記載されているように 、アポトーシス細胞（またはこの目的のためにいくつかのセルを予約することによって）の別々の準備を使用したフローサイトメトリーによるアポトーシスの誘導を確認します。
    注：初期のアポトーシス細胞が無傷の細胞膜を有し、そしてヨウ化プロピジウム（PI）として現れる陰性及びアネキシンV陽性細胞（生細胞と比較して）セルのサイズを減少させました。後期アポトーシス細胞は、非無傷の細胞膜を有し、およびPI陽性およびアネキシンV陽性細胞は、細胞の大きさの減少として現れます。現在のプロトコルを使用して、典型的な調製物は、〜85％初期アポトーシス及び〜15％後期アポトーシス細胞を含みます。
  9. 直接的または1x DPBS中0.4％（v / v）のパラホルムアルデヒドで30分間、アポトーシス細胞の固定後、1：1のアポトーシスへの応答細胞の割合で細胞（プロトコル3）レスポンダBU.MPTするアポトーシス細胞を追加。
    注：アポトーシス細胞の固定を前に応答者の刺激にする必要があります観察されたシグナル伝達事象は、可溶性媒介物質（ 表1）の放出によるものでない限り、結果には影響しません。

壊死BU.MPT細胞（プロトコル2）の調製

注意：このプロトコルは、壊死の誘導方法として壊死細胞の供給源、および加熱などBU.MPT細胞に特異的です。あるいは、別の細胞株、または初代細胞培養物は、その特定の細胞型および壊死を誘導する方法を標準化されたプロトコルによって誘導される壊死で、壊死細胞の供給源として使用することができます。

  1. 直径100mmの滅菌ポリスチレン真空ガスプラズマ処理された組織培養皿に継代した後、で培地A中で37ºCで、すなわち （許容条件下（v / v）のCO 2雰囲気の加湿5％コンフルエントにBU.MPT細胞を成長させますセクション1.2.3で説明したように皿当たり10 mL）で、。
  2. 使用して、培地Bで接着細胞単層を3回リンスすすぎあたり10 mLです。
  3. およびMg + 2 5分間ディッシュあたり1 mLのフリーDPBS - 1XのCa + 2で5 mMのEDTAを添加することによって細胞を切り離します。剥離した細胞を含むEDTA含有培地を吸引し、滅菌した15 mLのポリスチレン遠心管に細胞懸濁液を加えます。
  4. およびMg + 2の洗浄あたりフリーDPBS -のCa + 2の10ミリリットルで500×gで再懸濁で10分間の遠心分離によって細胞を3回洗浄します。
  5. 最後の洗浄後、ミリリットル当たり約5×10 6個の細胞で新鮮な培養培地Bで細胞を懸濁。
  6. 穏やかに細胞懸濁液を10分ごとにボルテックスし、水浴中で45分間70ºCに細胞を加熱することにより壊死を誘発します。
  7. 37℃で加湿した5％（v / v）のCO 2雰囲気下で2時間、細胞をインキュベートします。静かに細胞懸濁液を15分ごとにボルテックス。
  8. 必要に応じて、NEの別々の調製物を用いたフローサイトメトリーによって壊死の誘導を確認しますcrotic細胞（またはこの目的のためにいくつかのセルを予約することによって）、先6,9,10,15に記載しました。
    壊死細胞は、細胞膜を破裂しており、（生細胞と比較して）増加した細胞サイズのPI陽性細胞として表示注：。現在のプロトコルを使用して、典型的な調製物は、≥95％壊死細胞が含まれています。代替的に、壊死および膜完全性の喪失の誘導は、トリパンブルー染色により確認することができます。

BU.MPTレスポンダー細胞（プロトコル3）の4準備

注意：このプロトコルは、応答細胞の供給源としてBU.MPT細胞に特異的です。あるいは、別の細胞株、または初代細胞培養は、応答細胞として使用することができます。実験的使用に先立ち、休止は、実験室内の標準化されたプロトコルによって一晩誘導することができます。

  1. それらが達成されるまで〜皿当たり10 mLの培地A中で許容する条件下で、無菌の100mm組織培養皿にBU.MPT細胞を成長させます85％のコンフルエンス。
  2. 吸引培地A、及びすすぎあたり10 mLで細胞を培地Bで三回洗浄します。 1.2節で説明したように、加湿5％で18〜24時間、非許容条件（ すなわち 39ºCで皿当たり10 mLの培地B中）の下（v / v）のCO 2雰囲気のために細胞を一晩血清餓死静止状態を誘導するために0.4、。代替的に、血清はFBSを含まない培地Bで一晩細胞を飢餓前に一日39ºCで培地B中の細胞に加えて10％（v / v）のFBSを成長させます。
  3. 各実験条件についてコンフルエントBU.MPT細胞の別個の組織培養皿にラベルを付けます。
  4. 15分間の車両または上皮成長因子（EGF）のいずれかで実行可能なBU.MPT応答者の刺激、無細胞、アポトーシス細胞、または壊死細胞のいずれかへの30分間の曝露次：次の6つの条件を含みます。
    注：死細胞への曝露は、GIの活性のレベルを刺激または阻害することができるいずれかシグナル伝達分子ヴェン。刺激は最高の低ベースラインの上に検出された（ 例えば 、EGFの不在）、阻害は最高の高ベースラインから検出されたのに対し（ 例えば 、EGFの存在）。死細胞による刺激の効果が先験的不明であるので、不在とEGFの存在の両方ですべての試験を実施することをお勧めします。

アポトーシスおよび壊死細胞（プロトコル4）と応答細胞の5刺激

  1. 静止の前標識された皿から吸引し、培地B（血清飢餓）BU.MPT応答細胞（プロトコル3）。
    注：非許容条件下で一晩培養した後、BU.MPT細胞は、マウス腎臓PTECの初代培養のように振る舞うべきです。
  2. 100ミリメートル皿当たり、次のいずれかの2 mLを追加します。培地B（無細胞）;培地Bで、mL当たり〜5×10 6細胞（プロトコル1）でアポトーシス細胞懸濁液; mLの私あたり〜5×10 6個の細胞で、または壊死性細胞懸濁液nは培地B（プロトコル2）。
    1. 均等に100ミリメートル皿の上に死んだ細胞の2 mLの懸濁液を配布し、それらを最小限に落ち着くまでの時間を保ちます。これを達成するために、応答細胞皿の表面全体に広い先端ピペットで滴によって死細胞懸濁液滴を分配します。セトリング時間を最小化し、死細胞の凝集を回避することとの間の妥協点として2ミリリットルの容量を使用してください。
      注：刺激として死んだ細胞の懸濁液を使用することは、以下に詳細に説明されている特別な考慮事項の数（ 表2および考察）を伴います。
    2. 〜10×10 6個の細胞が含まれていコンフルエント100ミリメートル皿に、mL当たり〜5×10 6個の細胞で死細胞の2ミリリットルを追加することによって、1：〜1の死者・ツー・レスポンダ細胞比を実現。また、任意の観察されたシグナル伝達事象の用量依存性を確立するために、教団の漸進的希釈により連続的に反応細胞に死者の比率を変化させますプロトコール1及び2で調製した死細胞懸濁液のURE媒体B。
  3. 静かその後、加湿5％（v / v）のCO 2雰囲気中、37ºCでインキュベート、料理を旋回させます。
  4. 30分後、培養皿の前標識によれば、車両または50 nmのEGFのいずれかで応答細胞を刺激します。
  5. 加湿した5％（v / v）のCO 2雰囲気中、37℃で15分間インキュベートします。
  6. 、氷冷1×DPBS 5mLのを加える料理を旋回し、洗浄液を吸引することにより、死細胞を洗い流します。 3回繰り返します。
  7. すぐに、さらなる処理のために氷上で応答細胞の皿を置きます。
  8. 細胞溶解物を準備します
    1. 以下を含む細胞溶解緩衝液を調製する：1×トリスSDS、10％グリセロール、及び25mMのフッ化ナトリウムw / vの生理食塩水（TBS）、10mMのピロリン酸ナトリウム、Vデオキシコール酸/ W、0.5％、0.1％の緩衝化。
      1. INDに与えられた正確な順序で以下を追加し、細胞溶解する直前icated濃度：ミニEDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル（1錠10溶解緩衝液1mLあたり）、10％（v / v）のトリトンX-100、1mMジチオスレイトール（DTT）、1mMのフェニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF）、及び10オルトバナジン酸ナトリウム。
    2. ステップ5.7から氷上で新鮮に刺激応答細胞の100ミリメートル皿当たりの氷冷細胞溶解緩衝液の700μLを追加します。セルスクレーパーで細胞をこすり、および1.5 mLのマイクロチューブに予め冷却した溶解液を移します。 15分間氷上でチューブを維持します。
    3. 20ヘルツ、持続時間が1秒未満それぞれの10パルスと氷上で超音波処理した溶解物。このサンプルを過熱することができるように、気体/液体界面でのフォームの作成を避けてください。完全に超音波処理器を切り替える前に、溶解物を含むマイクロチューブに超音波処理器プローブを浸漬し、溶解物からプローブを取り外す前に、超音波処理器のスイッチを切ります。
    4. 4℃で10分間20,000×gで遠心分離し、新鮮なあらかじめ冷却マイクロチューブに上清を移します、および-70ºCで保存。
    5. 以前6,9,10,15に記載されているように 、溶解物の上清のゲル電気泳動およびイムノブロッティングを行います。

6.半透過性ポリカーボネート膜を用いて、目標とレスポンダとの間の直接的な物理的接触を防止する（プロトコル5）

  1. 1つの例外を除いて、プロトコル3に従ってBU.MPTの応答細胞を準備し;滅菌ポリスチレン組織培養中の細胞を成長させるには、12ウェルのクラスターを処理しました。
  2. 選択したウェルでは、死んだとレスポンダー細胞との間の物理的相互作用を防止するために、0.4μmのポリカーボネート膜を含む透過性のサポートシステムを配置します。同じ実験における膜なしの対照ウェルを含めます。
  3. 血清飢餓BU.MPTの応答細胞の実験ウェルから吸引し培地B。
  4. 以下のように変更して、アポトーシスまたは壊死細胞と応答性細胞の刺激のためのプロトコル4に従ってください：
    1. ウェルあたりの12ウェルのクラスタは、次のいずれかの0.1 mLを加え：培養液B（細胞なし）。培地Bで、mL当たり〜5×10 6細胞（プロトコル1）でアポトーシス細胞懸濁液;または培養培地B（プロトコル2）で、mL当たり〜5×10 6細胞で壊死性細胞懸濁液。
      注：12ウェルクラスターのコンフルエントウェルは、〜0.5×10 6細胞、〜で死んだ細胞の0.1 mLに添加することを含んでいるので 、mL当たり5×10 6細胞を、死んツー応答細胞比〜をもたらす1：1。
    2. 透過性のサポートシステムを含むウェルに、透過性の支持システム内で0.4μmのポリカーボネート膜の上に死んだ細胞を追加し、その結果、無駄とレスポンダー細胞との間には直接の物理的相互作用はありません。

サイトカラシンDと貪食の7阻害（プロトコル6）

  1. プロトコル3に従ってBU.MPT応答性細胞を準備します。
  2. dimethにおける細胞骨格阻害剤サイトカラシンDを準備4 mg / mlで（×1000）でイルスルホキシド（DMSO）。培地Bの10mLに4μgの/ mLの最終濃度を達成するためにBU.MPTの応答細胞車両の10μL（DMSO）またはサイトカラシンDの10μLのいずれかのために予め標識料理を追加します。
    注：BU.MPT細胞やマクロファージ細胞株によるサイトカラシンD、食作用のこの濃度で≥90％9,10によって阻害されました。
  3. 加湿した5％（v / v）のCO 2雰囲気中、37ºCで2時間インキュベートします。
  4. アポトーシスまたは壊死細胞と応答性細胞の刺激のためのプロトコル4に従ってください。
  5. 必要に応じて、以前9,10に記載されているように 、（この目的のために予約または細胞）死んだとレスポンダー細胞の別々の調製物を用いて、フローサイトメトリーにより死細胞の貪食の阻害を確認します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

図1では、我々はタイミングおよびアポトーシス細胞（プロトコル1）および壊死細胞（プロトコル2）の製造およびアポトーシスと壊死細胞（プロトコル4）の懸濁液と応答細胞の刺激に関与する重要なステップを示す概略図を提供します。

図2において、我々は、セリン-スレオニンキナーゼグリコーゲンシンターゼキナーゼ-3（GSK-3）、GSK-3αおよびGSK-3βの二つのアイソフォームのリン酸化に対するアポトーシス細胞の効果を示す代表的な結果をもたらします。 GSK-3α/βは、細胞の増殖および生存の調節において重要な役割、ならびにグルコース代謝におけるその重要な役割を担っています。セリン9におけるセリン21及びGSK-3βにおいてGSK-3αのリン酸化は、キナーゼ活性を阻害し、次いで、リン酸化およびβカテニンの増加した安定性の減少につながります。 βカテニンそれは、細胞増殖を刺激し、アポトーシスを...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

ここでは、アポトーシスまたは細胞死の他の形態を経ている細胞への曝露後の生存細胞に誘導される細胞内シグナル伝達事象を特徴づけるためのプロトコルを提供します。プロトコルは、アポトーシス細胞の曝露は、生存応答細胞内の細胞内シグナル伝達経路を調節することが可能な複数の機構を強調しています。これらのメカニズムは、次のとおりです。対話を（死んだ細胞またはその小屋の小胞および微小胞の分子または表面決定をブリッジを経由して、多くの場合、アポトーシス小体と呼ばれる）応答細胞上の特定の受容体と; （偶数またはその細胞外世代27）可溶性メディエーターの放出;そして、貪食機械の締結。実質的な食作用が発生する状況下では、考慮すべき追加的なメカニズムは、アポトーシス細胞またはその小胞21内に濃縮されたようなマイクロRNAなどのメディエーター、の配信です。 Oと比較して、私たちのプロトコルの重要性、THERの方法論は、アポトーシス細胞が応答する細胞内シグナル伝達を調節することができることにより、複数のメカニズムのその慎重な解剖です。主な利点は、必要な技術の大部分は簡単で、細胞培養に標準装備されていることです。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この作業は、全体的または部分的に、ホセ・A・アルーダ博士とイリノイ大学シカゴ校腎臓内科からの機関資金(J. S. L.へ)と、マギル大学医学部とマギル大学保健センターの研究所からの資金提供(J.R.へ)によって支援されました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
細胞培養材料
DMEM、1x with [4.5 g/L] グルコース、ʟ-グルタミン & ピルビン酸ナトリウムMediatech (バージニア州マナサス)10-013-CV
HyClone Fetal Clone II, 胎児ウシ血清GE Healthcare (ユタ州ローガン)SH30066.03に 10% (v/v)  を加え
ます。100xLife Technologies (Grand Island, NY)10378-016培地 A および B
&γ;-インターフェロン、マウス組換え体、Escherichia coliCalbiochem、Millipore (Billerica, MA)10 単位/mL を添加407303
Falcon ポリスチレン組織培養処理皿、非発熱性Corning (ノースカロライナ州ダーラム)353003滅菌済み、 直径 100 mm
のファルコン ポリスチレン遠心チューブ、円錐底コーニング (ノースカロライナ州ダーラム)352095滅菌済み、15 mL
トリプシン-EDTA、0.05%、GibcoFisher (マサチューセッツ州ウォルサム)25300062滅菌済み、100 mL
名前会社カタログコメント
化学物質および阻害剤
スタウロスポリン、Streptomyces spから。シグマ(ミズーリ州セントルイス)S4400[1μアポトーシスを誘導するために3時間g/mL]
皮成長因子(EGF)、[1 mg / mL]ミリポア(ビレリカ、マサチューセッツ州)EA14050 nMで使用してレスポンダー細胞を刺激する
UltraPure、0.5 M EDTA、pH 8.0Life Technologies(グランドアイランド、ニューヨーク)15575-0385 mMを使用して付着細胞を剥離します
トリパンブルー溶液、0.4%MP Biomedicals(カリフォルニア州サンタアナ)91691049死細胞
染色用パラホルムアルデヒド溶液、DPBSAffymetrix (カリフォルニア州サンタクララ)19943固定に 1x DPBS で 0.4% (v/v) を使用
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)、1x、GibcoLife Technologies (ニューヨーク州グランドアイランド)14040133原液
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)、Ca2+- および Mg2+-フリー、 1x、GibcoLife Technologies(ニューヨーク州グランドアイランド)14190367ストック溶液
サイトカラシンD、4 mMのジメチルスルホキシド(DMSO)、Zygosporium mansoniiSigma(ミズーリ州セントルイス)C8273[4 μ食作用を阻害する
メチルスルホキシド(DMSO)Sigma(ミズーリ州セントルイス)D2650サイトカラシン用溶媒 D
[header]
細胞溶解緩衝液 ingredients
Tris-buffered saline (TBS), 10x, pH 7.4BioRad (Hercules, CA)1706435細胞溶解緩衝液用
ロリン酸ナトリウムSigma-Aldrich (ミズーリ州セントルイス)22136810 mM 細胞溶解バッファー用
デオキシコール酸ナトリウムSigma-Aldrich (ミズーリ州セントルイス)D67500.5% w/v 細胞溶解バッファー用
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)Sigma-Aldrich (ミズーリ州セントルイス)L3771 0.1% w/v 細胞溶解バッファー用
グリセロールSigma-Aldrich (ミズーリ州セントルイス)G551610% 細胞溶解バッファー用
ッ化ナトリウムSigma-Aldrich (ミズーリ州セントルイス)45002225 mM 細胞溶解バッファー用
完全ミニ EDTA フリープロテアーゼ阻害剤カクテル錠Roche Diagnostics (インディアナポリス州インディアナポリス)4693159001細胞溶解バッファー用
Triton X-100Sigma-Aldrich (セントルイス、MO)T878710% 細胞溶解バッファー用
Dithiothreitol (DTT)MP Biomedicals (Santa Ana, CA)11DTT000051 mM 細胞溶解バッファー
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)MP Biomedicals (Santa Ana, CA)48002631 mM for cell lysis
ソバンデートナトリウムMP Biomedicals (Santa Ana, CA)215966410 mM 細胞溶解バッファー用
名前会社カタログコメント
Equipment
Sorvall T6000B遠心分離機デュポン(ウィルミントン、DE)T6000B
フィッシャーティッシュマット、ウォーターバスフィッシャー(ウォルサム、マサチューセッツ州)
Sonic Dismembrator (sonicator)、モデル 100Fisher (Waltham, MA)
Miscellaneous
Cell counting chamber、NeubauerHawksley (Lancing, Sussex, UK)AC2000
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit IIMillipore (Billerica, MA)CBA059for PI and Annexin V staining to determine the stage of apoptosis
Eppendorf microcntrifuge tubes, 1.5 mLSigma-Aldrich (St. Louis, MO)T9661
Transwell 透過性担体, 0.4 μmポリカーボネート膜コーニング(コーニング、ニューヨーク)3413無菌、ポリスチレン、組織培養治療<
strong>名前CompanyCatalogComments
strong<>Antibodies
リン酸化グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3&α;/β(GSK-3α/β)(Ser21/9)、ポリクローナル抗体Cell Signaling Technology9331rabbit polyclonal antibody
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) monoclonal antobody ( (14C10) )Cell Signaling Technology2118rabbit monoclonal antibody
培地 A ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミンから し培地 Aは上を 細胞をジピ フ用 buffer オル

参考文献

  1. Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
  2. Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
  3. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748(2013).
  4. Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
  5. Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
  6. Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
  7. Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
  8. Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
  9. Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
  10. Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
  11. Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
  12. Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
  13. Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
  14. Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
  15. Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
  16. Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
  17. Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the "phoenix rising" pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13(2010).
  18. Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
  19. Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
  20. Hess, K. L., Tudor, K. -S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
  21. Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51(2009).
  22. Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
  23. Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
  24. Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
  25. Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
  26. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
  27. Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

GSK3 phagocytosis
隣接セル受けてアポトーシス細胞死との相互作用によって生細胞に誘導されるイベントを細胞内シグナルの同定
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。