私たちは、成体マウスにおいて一貫して厄介な脊髄損傷を生じさせることができる組織変位ベースの偽性脊髄損傷モデルを紹介する。
方法論記事
マウスにおける組織変位ベースの脊柱挫傷モデルの検討
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
一貫した再現性のある脊髄傷害（SCI）の生成は、実験動物間の行動および組織学的変動を最小化するために重要である。異なるメカニズムを用いて傷害を引き起こすために、いくつかの厄介なSCIモデルが開発されている。 SCIの重症度は、所定の体重を落とした高さ、負傷力、または脊髄の変位に基づく。今回の研究では、傷害速度と精度の高い変位ベースのSCIを作成することができる、新規なマウス擬制SCI装置、LISA（Louisville Injury System Apparatus）インパクタを紹介する。このシステムは、高度なソフトウェアと組み合わせたレーザー距離センサーを使用して、段階的かつ再現性のある損傷を生成します。我々は段階的手順を実証するために、マウスの10 番目の胸椎（T10）レベルで厄介なSCIを行った。このモデルは、頚椎および腰椎のレベルに適用することもできます。
概要
ヒトで起こる最も一般的な脊髄損傷（SCI）は、厄介なSCI 1である。傷害のメカニズムおよびSCIに続く種々の治療戦略を調べるために、げっ歯類における正確で、一貫性があり、再現性のある厄介なSCIモデルが必要である。
種々の損傷生成機構を有する多くの脊髄損傷傷害モデルが、実験SCI研究2,3,4,5,6に用いられている。オハイオ州立大学（OSU）のインパクタ/電磁波SCI装置（ESCID）5、3つの厄介なSCIモデル、具体的には、ニューヨーク大学（NYU）/多施設動物脊髄損傷試験（MASCIS） 図7において、（IH）インパクタ4,8は、SCIの研究分野で広く受け入れられています。 NYU / MASCISインパクタまたはこれと同等のものは、異なる高さから固定錘を標的脊髄に落として複数の傷害重症度を生成することによって傷害を生じる3,6。 OSU / ESCIDは、組織の変位を誘発することによって傷害を引き起こす5,7 。 IHインパクタは、脊髄4,8に異なる力を加えることによって傷害を生じる。各インパクタは異なる速度を使用しますが、これは怪我の結果に影響を与える重要なパラメータです。 NYU / MASCIS装置は、0.33〜0.9m / sの範囲の速度を生成する。 IH装置の最大速度は0.13m / sです。 OSU / ESCIDインパクタの固定速度は0.148m / sです。特に、臨床モデルで観察されたものよりも低く、通常は1.0m / sを超える。
ここでは、衝撃速度10の高いマウスでSCIを生成するために、Louisville Injury System Apparatus（LISA）と呼ばれる新しい変位ベースのcontusive SCIデバイスを紹介します。このシステムは、傷害部位で椎骨をしっかりと安定させ、一定で再現性のあるSCIの生成を可能にする椎骨安定装置を含む。デバイスのレーザーセンサーは、組織変位の正確な決定と結果としてのSCIの重症度を保証します。脊髄との接触点におけるプランジャの速度は0.5〜2m / sに調整することができる。これらの損傷パラメータは、臨床的に見られる外傷性SCIを再現する。
プロトコル
全ての外科的および動物の取り扱い手順は、実験動物の管理および使用のためのガイド（国立研究評議会）およびインディアナ大学医学部機関動物管理および使用委員会のガイドラインの下で承認されたとおりに行われた。
1.動物の準備とT10脊髄椎間板切除の実施
- オートクレーブで外科用器具および金属製スパイン安定剤を滅菌する。手術用手術台を清掃します。ヒーターパッドを37℃に温める。ヒーティングパッドを手術台の上に置き、無菌手術用ドレープで覆ってください。手術中は無菌技術を使用する。
- この研究のために、10週齢の若い成体C57 / 6Jマウスを使用する。ケタミン（87.7mg / kg）およびキシラジン（12.3mg / kg）混合物の腹腔内（ip）注射により各動物を麻酔する。足のつまみに誘発された侵害受容刺激に対する応答を誘発することによって完全麻酔を確認する。 ng>
- ブプレノルフィン（0.01-0.05mg / kg）、鎮痛剤、および非ステロイド抗炎症薬であるカルプロフェン（5mg / kg）を皮下投与する。
- 電気クリッパーを使って胸腰椎の上に髪を剃ります。ベタジン溶液と70％アルコールワイプで皮膚を擦る。
- 手術中に眼が乾燥するのを防ぐために、眼軟膏を角膜に塗布する。
- メスで、動物の背中に1.5cmの正中線の皮膚切開を施して、9 番目から11 番目の胸椎の椎弓板を露出させる。皮下脂肪組織を吻側に押します。棘突起と椎弓板から傍脊髄筋をそれぞれの側方の側面に向かって解剖する。
- スタビライザのU字型トラフにマウスを置きます（ 図2A 2B ）。ステンレススチールのアームをT10椎骨の露出したファセットの下に左右にクランプする（g>図4A）、アームに取り付けられたつまみネジを使用して締め付けます（ 図2A ）。
- 脊髄の上に硬膜を露出させるマイクロロングジャーを使用して、T10の棘突起および椎弓板（椎弓切除術）を除去する（ 図4B ）。
2. LISAインパクタを用いたT10傷害の実施
- 窒素タンクの圧力調整器のつまみを回して、圧縮窒素を20 PSIまたは138 kPaに設定します（ 図1A ）。
注：圧力は10-120 PSIから調整可能です。より高い圧力は、より速い速度の影響をもたらす。直径1.2mmのSCI装置の先端はマウス用に設計され、直径2.2mmの先端はラット用に設計されている。マウスからラットに変更する場合、金属チップ（直径1.2mm / od 2.2mm）にリングを加えることにより、より大きい直径の先端を形成することができる。我々はこのマウスSCIの1.2mmチップを使用したtudy。使用前にSCIチップを滅菌する。 - コンピュータの電源を入れてソフトウェアを起動します。押しボタン1（ 図1B ）を押してインパクター先端を完全に伸長した位置に動かします（ 図3A -1 ）。
注記：ボタン1の機能は、空気圧シリンダーを手動で有効または無効にすることです。 - ステージ上にマウスでU字型コンテナを置きます（ 図2B ）。マウントのつまみネジを締めてステージを固定します（ 図2B ）。
- "SET ZERO LEVEL"ゾーン（緑色）の下で、 "START READING"ボタン（ 図3A ）をクリックして、完全に伸長したプランジャーチップまでの距離をレーザーセンサーが測定するゼロレベルを設定します。距離はこのゾーンの "Range"パラメータに表示されます（ 図3A ）。 「ゼロを設定」ボタンをクリックします（ 図3Aに示す8.951mmなど）。
- 押ボタン1（ 図1B ）を押してインパクター先端（ 図3B -1 、上矢印で示す）を引き出し、ネジ1の固定を解除する（ 図2B ）。ネジを正しい位置（ 図3B -1 、横矢印で示す）に引いて先端をレーザー光路から離し、ネジを90°時計回りに回してネジを固定します。
- 正面と横のマイクロドライバ（ 図1C ）を調整して、露出した背側脊髄の中心にレーザビームを向けることによって、ステージを動かします。傷害部位が標的とされた後、「傷害の設定」の下の「START READING」ボタンをクリックして組織距離を測定するEVELゾーン（青色）（ 図3B および3B-1 ）。
- 垂直マイクロドライバ（ 図1C ）を介してセンサと脊髄との距離をゆっくり調整して、「傷害レベルの設定」ゾーンの所望の変位パラメータ（ 例えば、傷害パラメータボックスに示される0.500mm）に到達させる（青色）（ 図3B ）。
- 所望の損傷変位に達すると、組織距離（ 例えば、 「範囲」パラメータボックスに示される8.451mm）を記録する（ 図3B ）。所望の変位（傷害）=先端距離（ゼロ） - 組織距離（範囲）（ 図3B ）を定義する。所望の傷害（ 例えば、 0.500mmの組織変位）に達したら（ 図3B ）、「傷害レベルの設定」ゾーンの下の「傷害を止める」ボタンをクリックしてけがをする。
- ねじ1を反時計回りに90°回してねじのロックを解除し、衝撃の先端をレーザービームの軌跡（ 図3C -1 、矢印の方向）に押し戻し、ネジ1を90°時計回りに回してロックします。
- インパクトを実行するには、赤い "RUN EXPERIMENT"ゾーン（ 図3C ）の下のRunボタンをクリックします。このゾーンの下のパラメータボックスには、負傷時間、力（mV）、速度（m / s）、および負傷変位（mm）が表示されます（ 図3C ）。
- 損傷データがすべて記録されて保存されたら、マウスでU字型トラフをステージから取り外します。外科用顕微鏡下で脊髄損傷を目視で確認する（ 図4C ）。
- 3-0シルクの連続縫合（Henry Schein、776-SK）を用いて、脊柱筋、表在筋膜、および皮膚を縫合する。
- 注射する動物を0.9％生理食塩水1mLで水和させ、完全な意識が回復するまで温度制御されたパッド上に置く。アクセス可能な食物と水が入ったケージにマウスを置きます。
- 術後ケアのために、自発性膀胱排尿が戻るまで膀胱を手動で表現する。鎮痛のために、ブプレノルフィン（0.05-2.0mg / kg、SQ）を8-12時間/日で2日間注射する。膀胱感染が起こった場合は、Baytril（SQ、0.1 mLに5〜10 mg / kg、1日1回）を7〜10日間注射する。局所/全身感染が起こる場合は、ゲンタマイシン（SQ、5〜8mg / kg、滅菌生理食塩水1mLで8〜12時間ごとに希釈）を4日間注射する。
- SCIの14日後に縫合糸を除去する。
- 損傷後42日目に、マウスを灌流により屠殺する。 1.2の適切な麻酔の後、それらを0.01M PBS中の30ml（0.01M）リン酸緩衝食塩水（PBS）および30mlの4％パラホルムアルデヒドで灌流する。病変叙事詩を含む脊髄の1センチメートル入力は採取され、切片化および組織学的分析のために処理される。
結果
この装置は、（1）インパクタ先端を有する本体（ 図1C ）、（2）ソフトウェアを有するコンピュータ（ 図1B ）、（3）電気制御ボックス（ 図1B ）、（4） （ 図2A ）、および（5）空気圧制御システム（ 図1A ）のための圧縮空気を含む。正確な組織変位を誘発するために、システムは、完全に伸長したプランジャ先端と標的とされた脊髄の背側表面との間の距離を測定するレーザセンサに依存する。このソフトウェアは、レーザビームがインパクタの反射面にのみ到達するという事実のために、先端の4mmの厚さを考慮しています（ 図2Bおよび図3A -1 ）。プランジャチップを配置できる位置は2つあります。（1）iレーザビームから離れた側方位置（ 図3B -1 ）におけるレーザビーム（ 図3A -1 ）または（2）の経路。プランジャがレーザビーム経路にあるとき（ 図3A -1 ）、インパクタ先端からの距離を測定し、伸長と収縮の間の動作中のインパクタ先端の速度を監視する。プランジャがレーザビーム経路から離れた側方位置にあるとき（ 図3B -1 ）、レーザと脊髄との間の距離が測定される。
我々の脊柱安定剤を使用してT10椎骨の安定化は、手順の不可欠な要素である（ 図2A ） 10,11 。レーザーセンサーを使用した信頼できる距離測定は、ターゲットの能力は、動きが存在する場合には歪む可能性があります。この系の正確性および一貫性を決定するために、8匹のマウスに0.5mm変位損傷を施した。これらの動物は、±0.001mm（±SD）の変位変動性を示し、システムが非常に正確で再現性があることを示している。 図4は、外科用顕微鏡下でのスタビライザ（ 図4A ）および露出したT10脊髄（ 図4B ）および後（ 図4C ）の脊髄の固定された標的椎骨を示す。
圧縮空気の圧力は、損傷の瞬間におけるインパクターの速度を制御する。我々のデータは、138 kPaの圧力で衝撃速度が0.81±0.0345 m / s（平均±SD）であることを示している。電気ボックスコントロールのノブ（ 図1B ）損傷後のチップコード接触時間（滞留時間）であり、0〜5,000msの間で調整することができる。ほとんどの実験におけるチップコード滞留時間は、0.32±0.0147秒（平均±SD）に設定されている（ 図5 ）。この装置を用いて、成体マウスにおいて、0mm（偽対照）、0.2mm（軽度の損傷）、0.5mm（中程度の損傷）、および0.8mm（重度の損傷）の組織変位で重度依存性の挫傷を生じさせることができる（ 図6 ）。
図1：ルイビル傷害システム装置（LISA）。 （ A ）システムは、インパクタ、制御システム、および圧縮空気源からなる。 （ B ）制御システムは、制御ボックスおよびラップトップコンピュータを含む。コントロールボックスのソフトウェアとコントロールボタンを使用すると、ユーザーは傷害パラメータ。 （ C ）レーザーセンサーは、装置の主要構成要素であり、傷害対象の位置、脊髄からセンサーまでの距離、および傷害速度を測定する。衝撃チップの迅速な上下運動は圧縮空気によって行われる。傷害の位置および組織変位の重症度は、3次元での動きを制御するマイクロドライバーによって調整される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：スタビライザーとマウスホルダー。 （ A ）背骨安定装置は、U字型のトラフと、マウスの椎骨を保持するための2本の金属アームで構成されています。 （ B ）次に、スタビライザをインパクター装置に取り付ける。 T赤い線はレーザービームの経路を示します。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：接触SCIを生成する方法。 （ A〜C ）3つの損傷パラメータ/ゾーンを持つグラフィカルユーザーインターフェイス（GUI）ソフトウェアが表示されます。 （ A 、 A-1 ）緑色ゾーン（SET ZERO LEVEL）は、プランジャーチップの距離を較正します。赤い線はレーザービームの経路を示します。 （ B 、 B-1 ）青色のゾーンは、怪我レベルを設定するために使用されます（傷害レベルの設定）。インパクタは持ち上げられ、レーザビームがゼロレベルを設定するために脊髄の背側表面に到達できるように、横方向に右側に移動される。赤い線はレーザーbを示します EAMパス。 （ C 、 C-1 ）衝撃に先立って、先端をレーザビーム経路に戻して、損傷（RUN）を実行する。負傷のパラメータは、赤いゾーン（RUN EXPERIMENT）の下にあります。赤い線はレーザービームの経路を示します。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4：傷害暴露と評価。 （ A ）背骨安定装置の金属アームは、T10椎骨を安定させる。 （ B ）T10椎弓切除術で脊髄を露出させ、背側血管がはっきりと見えるようにする。 （ C ）脊髄の背側表面に衝撃誘発挫傷（矢印）があると、傷害が確認される。スケールバー= 2mm。g4large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図5：傷害パラメータ。一貫した損傷パラメータには、組織変位（mm）、損傷速度（m / s）、および先端滞留時間（s）が含まれる。 N = 8、平均±SD。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図6：組織学的評価。 Cresyl VioletとEosinで染色された脊髄の代表的な断面は、（ A ）偽（0mm）、（ B ）軽度（0.2mm）、（ C） D ）重度（0.8mm）の不規則なSCIを検出した。画像は怪我の震央で撮影されました。スケールバー=500μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
ディスカッション
1911年、アレンは犬12の露出した脊髄に傷害を誘発するために固定重量を用いた最初の体重減少モデルを説明しました12 。類似の体重減少モデルは、NYU / MASCISインパクタ3,6,13,14を含むAllenモデルに基づいて開発されている。重量減少モデルに加えて、他のSCIデバイスも作成されています。 OSU / ESCID 5,7モデルは組織変位機構を用いて傷害の重症度を制御し、IHモデル4,8は力を利用して漸変可能なSCIを生成する。これらのシステムでは、脊椎安定化は、吻側および尾側の棘突起を損傷部位に締め付けることによって得られる。これらの装置は、低い損傷速度、具体的には0.33~0.9m / s（NYU / MASCIS）、0.148m / s（OSU / ESCID）、0.13m / s（1H）。吻側および尾側の棘状突起を安定させると、衝撃時に脊柱の柔軟性および背骨の動きが生じ、怪我の正確さに影響することがあります。
LISA法は、特に背骨の不安定性および低傷害速度に関して、既存のモデルの欠点を克服しようと試みる。この方法は、両側ファセット安定化を使用し、怪我に伴う運動アーチファクトを回避する。この装置は、0.5~2m / sの間で設定可能な衝撃の速い速度を使用する。レーザーセンサーは、ESCIDモデルで使用されるLing Vibratorよりも高度であり、組織接触を必要とせずに脊髄の表面からの距離を正確に測定します。このモデルはもともとラットSCIを産生するために開発されたもので、マウスおよび非ヒト霊長類のSCIを改変して産生するようになっています。
スパインセントすべての実験的SCI法、特に組織変位モデルにおけるばらつきを低減する。レーザ距離センサは、呼吸運動中の脊髄の組織変位の大きさを決定する。レーザーが集束される脊髄の点は、インパクターによって打たれた同一点であることが重要です。このステップは、インパクタ先端とレーザビームとの位置合わせが行われる較正ステップ（ 図3 ）中に行われる。このモデルの潜在的な弱点は、組織変位の大きさが硬膜表面から測定されることである。硬膜の厚さは動物間の差はごくわずかですが、脳脊髄液（CSF）で満たされたくも膜下腔にはかなりの変動が存在する可能性があります。小さな組織変位を用いて非常に軽度の挫傷傷害を生じる場合、傷害転帰の変動が起こり得る。全体として、傷害の一貫性は、主に依存している組織変位の正確さ、ならびにプランジャの速度および組織接触時間に依存する。
組織変位の範囲は広い（精度：0-10±0.005mm）。げっ歯類および非ヒト霊長類における以前のパイロットデータおよび公表された情報に基づいて、SCの前後方向の直径の20％の変位は軽度のSCIを生じ、30〜40％の変位は中程度のSCIをもたらし、> 50％変位1m / sの速度で深刻なSCIを生じる。動物種によって若干の違いがあります。滞留時間は、時間リレーを使用して0〜5秒まで調整できます。我々の研究では、滞留時間は300msに設定された。これは、NYUおよびIHモデルを含む他のSCIデバイスの休止時間を再現するように容易に調整することができます。
要約すると、我々は、成体マウスにおける痙攣性SCIの変位に基づくモデルを開発した。このモデルでは、U字型のスタビライザを使用して、両側の脊柱面を安定させ、コードを回避しますコード表面のレーザー誘導測定に関連した運動アーチファクト。このモデルは、0.5-2m / sの高速傷害を引き起こす可能性があります。レーザセンサは、衝突面までの速度および距離を決定する従来の方法よりも正確である。このモデルは、軽度から重度まで、あらゆるレベルで脊髄の傷害を引き起こす可能性があります。改変された場合、このデバイスはまた、ラットおよび非ヒト霊長類のような大きな動物において傷害を引き起こす可能性がある。
開示事項
Christopher B. Shieldsは、Louisville Impactor System、LLCが製造したLouisville Injury System Apparatus（LISA）の所有権を持っています。
謝辞
この研究は、NIH NS059622、NS073636、DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562によって部分的に支持された。米国退役軍人局からの功績審査賞I01 BX002356; Craig H Neilsen Foundation 296749;インディアナ脊髄および脳損傷研究財団およびマリ・ハルマン・ジョージ・エンダプライズ・ファンド（XMX）ノートン・ヘルスケア、ルイビル、ケンタッキー州（YPZ）;インディアナ州のISDH 13679（XW）; NeuroCures Foundationとの間で締結されました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ケタミン(7.2mg/mL)/キシラジン(0.475mg/mL)/アセプロマジン | パターソン獣医 | 07-890-8598/07-869-7632/07-808-1947 | 麻酔薬 |
| ブプレノルフィン(0.03mg/mL) | パターソン獣医 | 07-891-9756 | 鎮痛剤 |
| カルプロフェン | パターソン獣医 | 07-844-7425 | 抗生物質 |
| パデュー製品 ベタジン手術用スクラブ | フィッシャーサイエンティフィ | 19-027132 | 除菌 |
| デュカルガーゼスポンジ | フィッシャーサイエンティフィック | 22-415-490 | 除菌用 |
| コンエタノール 200プルーフ | フィッシャーサイエンティフィック | 04-355-450 | 除菌用 |
| 1 mL NORM-JECT | HENKE SASS WOLF | D-78532 | 麻酔/鎮痛/抗生物質注射用 |
| 10mL シリンジ | テルモ | 食塩水注射用 | REF SS-10L |
| 人工涙液 眼軟膏 | ウェブスター獣医 | 07-870-5261 | 乾燥した |
| 抗生物薬軟膏 | ウェブスター獣医 | 07-877-0876 | 感染からカットされたプロベント手術 |
| コットンチップアプリケーター | フィッシャー科学 | 1006015 | 止血 |
| 器具滅菌器 | ファインサイエンスツール | 18000-50 | 滅菌手術ツール |
| ファイン 鉗子 | ファイン サイエンス ツール | 11223-20 | 組織をつかむ |
| メス | ファイン サイエンス ツール | 10003-12 | スキン カット |
| メス ブレード #15 | フィッシャー サイエンティフィック | 10015-00 | スキン カット |
| 止血 | ファイン サイエンス ツール | 13004-14 | 出血を止め |
| Rongeur | ファイン サイエンス ツール | 16021-14 | 椎弓切除術 |
| アグリコラ・リトラクター | ファイン・サイエンス・ツール | 17005-04 | 手術ビューを開いたままに |
| ファインハサミ | ファイン・サイエンス・ツール | 14040-10 | 脊椎から分離した筋肉用 |
| 滅菌縫合糸 | ファイン・サイエンス・ツール | 12051-10 | スキンクロージャー |
| マウス 椎体安定剤 | ルイビル・インパクター・システム | N/A | 椎骨を安定させて露出 |
| LISA | Louisville Impactor System | N/A | マウスの脊髄の実験的挫傷を引き起こす |
参考文献
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再版と許可
