このプロトコルは、マウス島の単離および脱細胞化された骨格上への播種を実証する。足場支持膵島を、ストレプトゾトシン（STZ）誘発糖尿病マウスの精巣上体脂肪パッドに移植した。島は移植部位で生存し、高血糖状態を逆転させた。
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方法論記事
糖尿病マウスの精巣上体脂肪細胞における膵島支持骨格移植
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
膵島移植は、1型糖尿病の治療に有効であることが臨床的に証明されている。しかしながら、現在の肝内移植戦略は、急性の全血反応を招き、膵島移植が不十分になる可能性がある。ここでは、糖尿病マウスモデルにおける肝外移植部位（epididymal fat pad（EFP））における膵島の移植のための堅牢なプロトコールを報告する。 C57BL / 6Jマウスから高収率で膵島を単離および精製するためのプロトコール、ならびに脱細胞化足場（DCS）上に膵島を播種し、それらを糖尿病にした同系C57BL / 6JマウスのEFP部位に移植することによって実施される移植方法が記載されているストレプトゾトシンによる。 500島を含むDCS移植片は10日以内に高血糖状態を逆転させたが、DCSを有さない自由島は少なくとも30日間必要であった。正常血糖は移植片が外植されるまで3ヶ月まで維持された。結論として、DCSは島の生着をtEFPの肝外部位であり、容易に回収することができ、骨格材料を調べるための再現可能で有用なプラットフォームならびに成功した島移植に必要な他の移植パラメータを提供することができる。
概要
1型真性糖尿病（T1D）は、膵島細胞が免疫系によって切除され、患者が一生の間、外因性インスリンの注射に依存する自己免疫性内分泌障害である。エドモントンプロトコールは、膵島移植の臨床研究における画期的な成果である。膵島を門脈から注入し、肝内サイト1に移植した。しかし、不十分な供与膵島の供給源と膵島生着の不十分な2つの主な障害は、膵島移植の大きな成功を妨げる2 。通常、1人の患者の高血糖状態を逆転させるために、3つの死体ドナーから膵島を採取する必要がある。これは、膵島単離手順の低い収率および移植後の膵島損失に起因する。特に、移植後の島は酸素が豊富な血液に浸されていたが、血液と直接接触すると、しばしば即座の血液媒介性の炎症が誘発された島の急激な喪失を引き起こす可能性のある腐敗反応（IBMIR）を引き起こす可能性がある。長期的には、患者の膵島の漸減が、最初の年に90％に達する可能性があり、2および5で30％および10％に低下することができる臨床群における糖尿病の逆転率の低下を説明すると考えられる移植後の年数3 。
肝臓外の部位での膵島移植は、膵島の血液との直接的な接触を減少させる一方で、肝臓内注入に比べてより限定された位置に移植物を閉じ込める魅力的な戦略であった。過去数年にわたり、腎臓のカプセル、眼、筋肉、脂肪パッド、皮下の空間で研究が行わ....
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プロトコル
すべての実験は、北京大学機関動物実験および使用委員会（IACUC、IACUC no。COE-LuoY-1）によって承認された。
1.アイスアイソレーション
- 試薬と装置の準備。
- HBSS中のコラゲナーゼP粉末（2U / mg）を再構成して5mg / mL溶液を作製し、それを0.22μmフィルターを通してろ過して細菌を除去する。コラゲナーゼPの0.6 mLアリコート溶液を15 mLコニカルチューブに入れ、-20°Cで保存します。
注：使用中、各アリコートをHBSSで希釈して、最終濃度0.5mg / mLまたは1U / mL（3匹のマウスを処置するのに十分）の6mLの作業溶液を得る。作業溶液を氷上に置いて直ちに1時間以内に使用します。追加の使用のために、作業中のソリューションを復元または再固定するべきではありません。 - HBSSにFBS（2.5％）とP / S（1％）を添加して中和溶液を調製する。溶液を氷上に保つ。中和液60mLを調製するt 6マウス。
- 膵島培養培地には、D-グルコース（7mM）、FBS（10％）およびP / S（1％）をRPMI 1640培地に加える。
- 手術器具を115℃で30分間、15psiの圧力でオートクレーブ処理する。
- HBSS中のコラゲナーゼP粉末（2U / mg）を再構成して5mg / mL溶液を作製し、それを0.22μmフィルターを通してろ過して細菌を除去する。コラゲナーゼPの0.6 mLアリコート溶液を15 mLコニカルチューブに入れ、-20°Cで保存します。
- 膵臓の膨張。
- ....
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結果
顕微鏡止血クランプを使用して実施されたクランプ法は、縫合ライゲーション法と比較して簡単で時間が節約できます。 6匹のマウスから約1,200個の膵島を単離および精製するのに約4時間を要した。新たに単離された島は、典型的には、光学顕微鏡（ 図3A ）下で粗い周辺部を有していた。島が分離プロセスから回収されると、それらは明るくてタイトに見え、滑らかな表面を獲得した。しかし、ストレスのある単離は依然として細胞死を誘発し、島表面からの細胞の脱落をもたらし、不健全な島はしばしば暗い壊死核を含む（ 図3B ）。 5匹のマウスから945膵島の直径を測定した。計算された平均膵島直径は130.42±41.75μmであった（ 図3C ）。
レシピエントの免疫を避けるため C57BL /.......
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ディスカッション
膵臓の灌流および消化時間は、膵島の収量および品質に影響を及ぼす2つの重要なパラメーターである。 Moskalewskiは最初に、細かいモルモット膵臓を消化するための粗コラゲナーゼ混合物の使用を報告した11 。 Lacy ら膵臓を灌流するためのダクト系への酵素の注入を報告した。これは膵島収量を大幅に増加させた12 。酵素の導管潅流がより均一消化みじん切り膵臓13を消化と比較して、無傷の膵島の大きい放出をもたらす、酵素の膵臓表面積の最大の露出を可能にします。我々の経験では、成功した胆管のカニューレ挿入および膵臓全体の灌流は、高島収率のための前提条件であった。これは、十二指腸に近い膵臓組織と比較して、膵尾（脾臓葉）が実質的に膵島の大部分を含有するためである。カニューレを挿入するには2つの方法があります i）の中への酵素の侵入を阻止しながら十二指腸13、14.......
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開示事項
著者は何も開示することはない。
謝辞
著者はGuanhao BiotechのWei Zhangに脱細胞化された足場を提供してくれたことに感謝したいと思います。私たちは、ポン・ホン・ポンに感謝しています。この研究は、中国国立自然科学財団（プロジェクトNo.31322021）によって財政的に支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 解剖ハサミ | 寧波医療 | ||
| 鉗子 | 寧波医療 | ||
| 直径0.5 mmの金網 | 寧波医療 | ||
| 70 μm細胞ストレーナー | ファルコン | 352350 | |
| 動脈止血クランプ | 寧波医療 | ||
| 顕微鏡止血クランプ | 寧波医療 | ||
| 止血鉗子 | 寧波医療 | ||
| 吸収性 6-0 PGLA縫合糸 | JINHUAN | 針 | |
| 巻きクリップ | 寧波医療 | ||
| 綿 | 波医療 | ||
| ガーゼ | 寧波医療 | ||
| 滅菌ドレープ | 寧波医療 | ||
| 10mL注射器 | JINGHUAN1mL | ||
| 注射器 | JINGHUAN | ||
| 27G 静脈注射針 | JINGHUAN | 0.45x15 RWSB | |
| 1.5 mL Eppendorf チューブ | Axygen | ||
| 15mL コニカルチューブ | Corning | 430791 | |
| 50mL コニカルチューブ | Corning | 430829 | |
| 35mm 未処理 ペリディッシュ | コーニング | 430588 | |
| トランズウェル | コーニング | 3422 | |
| 0.22 μm フィルター | ポール | PN4612 | |
| 10 mL 血清ピペット | コーニング | 4488 | |
| ピペット フィラー S1 | サーモサイエンティフィック | 9501 | |
| ピペット (2-20μL) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
| 解剖顕微鏡 | オリンパス | SZ61 | |
| 遠心分離機 | エッペンドルフ | 5810R | |
| ハンクの平衡塩溶液 | Gibco | C14175500CP | |
| Collagenase P | Roche | COLLP-RO | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
| Glucose | meter Roche | ACCU-CHEK | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | Gibco | 15140-122 | |
| ストレプトゾトシン | Σ | V900890 | VetecTM |
| >クロラール水和物 | J&K | C0073 | |
| クエン酸ナトリウム | Σ | 71497 | |
| クエン酸 | Σ | C2404 | |
| ヨードフォア | 寧波医療 | ||
| C57BL/6J、生後 10-12 週齢 | VitalRiver | 北京、中国 | |
| 脱細胞化足場 | Guanhao Biotec | 131102 | 広州、中国 |
参考文献
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Shapiro, A. M. J., et al.
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再版と許可
