ここでは、さまざまな発生段階でショウジョウバエを準備し、カスタム光干渉顕微鏡(OCM)システムを使用してショウジョウバエの心拍の縦方向の光学イメージングを実行するための実験プロトコルが説明されています。心臓の形態学的および動的変化は、OCM画像から心臓の構造的および機能的パラメータを分析することにより、定量的に特徴付けることができます。
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この記事について
サマリー
要約
小動物の心拍の縦断的研究は、心臓の発達中の構造的および機能的変化を理解するのに役立ちます。光干渉顕微鏡(OCM)は、高い空間分解能と超高速のイメージング速度で小動物の心臓をイメージングできることが実証されています。高い画像コントラストと非侵襲的な特性により、OCMは組織の解剖や染色を必要とせずに縦断的研究を行うのに理想的です。ショウジョウバエは、その多数の相同性ヒト疾患遺伝子、脊椎動物との分子メカニズムと遺伝経路の類似性、ライフサイクルの短さ、および培養コストの低さから、心臓発生研究のモデル生物として広く使用されています。ここでは、ショウジョウバエの調製と、標本のライフサイクル全体にわたるカスタムOCMシステムによる心拍の光学イメージングに関する実験プロトコルについて説明します。このレポートで提供されている手順に従うことにより、横方向のMモードおよび3D OCM画像を取得して、ショウジョウバエの心臓の形態と機能の縦断的研究を行うことができます。顔面および軸方向の断面OCM画像、心拍数(HR)および心臓活動期間(CAP)ヒストグラムは、心臓の構造変化を分析し、ショウジョウバエの変態中の心臓のダイナミクスを定量化することも示されました。また、Mモード画像で構成されたビデオと組み合わせて、心臓の活動を直感的に追跡することが示されました。ショウジョウバエと脊椎動物との遺伝的類似性により、ショウジョウバエの心臓の形態と動態を縦断的に研究することで、ヒトの心臓疾患の起源を明らかにすることができる可能性がある。ここでのプロトコルは、ヒトの心臓病のメカニズムを理解するための幅広い研究を実施するための効果的な方法を提供します。
概要
小動物における心臓の縦断研究では、このような遺伝子関連先天性心臓欠陥1,2のようなヒトの関連心血管疾患、各種の理解に貢献しています。過去数十年、このようなマウスを3,4、アフリカツメガエル5,6、ゼブラフィッシュ7,8、鳥9、及びショウジョウバエ10-16などの様々な動物モデルにおいて、研究に関連する人間の心臓の開発を行うために使用されています。マウスモデルは広く、正常と異常な心臓の開発とヒトの心臓3,4との類似性に起因する心臓の欠陥表現型を研究するために使用されています。アフリカツメガエル胚は、その取り扱い易さと半透明5,6に対する心臓の開発の研究に特に有用です。ゼブラフィッシュモデルの胚と早期の幼虫の透明性は、心臓の開発7,8の簡単な光学観察を可能にします。鳥類のモデルは、発達心臓研究の共通の課題であるbecaus電子心は簡単に卵の殻と人間9に鳥の心の形態学的類似性を除去した後にアクセスすることができます。 ショウジョウバエモデルは、心臓の長手方向の研究を行うために最適ですいくつかのユニークな機能を備えています。まず、 ショウジョウバエの心臓管は、心臓の光アクセスおよび観察のための利便性を提供し、背側表面下〜200μmで、です。さらに、多く....
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プロトコル
ショウジョウバエ 16の光イメージングのためのOCMシステムの作製
- OCMシステムは、 ショウジョウバエのハートビートを解決することができるようになりますので、少なくとも80フレーム/秒のフレームレートを提供する分光器と高速ラインスキャンカメラを選択します。
- ショウジョウバエの心臓構造を識別するために、2μmの軸方向の分解能を確保するために、広帯域光源を使用してください。
- 高横分解能を得るために10倍の対物レンズを使用してください。
- 基準アーム光を反射し、標本に焦点深度を拡張するために、環状サンプルアーム光ビームを生成するために45°ロッドミラーを使用します。
- OCMシステムを制御し、測定を実行するためのカスタムコンピュータプログラムを開発します。
2. ショウジョウバエ文化
- 標準的なフライ食品の準備
- ポリスチレンバイアルに〜5ミリリットルインスタントショウジョウバエ式を置きます給紙シュートの支援を受けてチューブ。
- 適切に食べ物を飽和させるために数式に〜8ミリリットルの水を注ぎます。
- 異なる実験のための標準的なフライ食品に異なるサプリメントを追加します....
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結果
縦心臓イメージングは、OCMを用いて室温で24B-GAL4 / +株とショウジョウバエを用いて行きました。測定は、変態処理（ 表1）を追跡するためにL2、L3であり、PD1からPD4に8時間間隔、及び成人1日目（AD1）で行いました。幼虫、早期蛹、後半蛹および成人のハエは、 図1Aに見られるようなガラススライド上にマウントしました。幼虫と大人のハエのための心のセグメントの特徴は、図1Bの概略図に示しました。
この発達研究では、4096フレームは、ショウジョウバエのハートビートを追跡するために、当社独自のOCMシステムと32秒で取得しました。測定精度を向上させるために、5反復測定は、各発達段階における各検体のために採取しました。 3Dデータは、変態の間に心臓構造の変化を観察するために得ることができます。
横Mモード及び3D画像は、CでしたカスタムMatlabのプログラムとImageJのでreated。 顔.......
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ディスカッション
幼虫と大人の段階で400 bpmの周り最大HRとショウジョウバエの急速な心拍は、心臓diastolesとsystoles（経験に基づいていない未満80フレーム/秒）を解決するために、高い描画速度を必要とします。小さい心腔サイズおよびミクロンスケールの心臓壁の厚さ（5 - 10μm）を、高い空間分解能（2マイクロメートルよりも良好な）心管構造を解決するために必要とされます。本研究では、高解像度、超高速OCMシステムは、格子600本/ mmの送信と分光器と2048ピクセルのラインスキャンカメラを使用した場合に、開発されました。 20キロヘルツのAスキャン速度は、ラインスキャンカメラによって提供されます。 128フレーム/秒のフレームレートは、L2、L3、PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、および成人を含む複数の発達段階、でショウジョウバエのハートビートをキャプチャするのに十分高速です。光源は〜800nmでの中心波長および帯域幅を持つ広帯域スーパーコンティニューム光源だったと〜220それぞれnmおよび組織における〜1.3ミクロンの距離分解能を得ました。 10倍の対物レンズは、3.9ミクロン〜の横断方向.......
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開示事項
著者らは、現在の研究に関連する利益相反はないと宣言しています。
謝辞
この作業は、リーハイ大学スタートアップ基金、NIH(R00EB010071はC.Z.、R15EB019704はC.Z.とA.L.、R03AR063271はA.L.、R01AG014713とR01MH060009はR.E.T.へ)、NSF(1455613はC.Z.とA.L.へ)、Cure Alzheimer's Fund(R.E.T.へ)、そしてマサチューセッツ総合病院(A.L.に研究賞に関する執行委員会)によって支援されました。M.C.とY.M.は、National Key Basic Research Programによって支援されました助成金番号2014CB340404に基づく中国(973プログラム)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| カスタムOCMイメージングシステム | 私たちの研究室 | ||
| 私の温度 ミニ デジタル インキュベーター | ベンチマーク | H2200-HC | |
| カバーガラス | AmScope | 200PCS | |
| コットン ボール | RITE AID | ||
| インスタント ショウジョウバエ フォーミュラ | カロライナ | フォーミュラ 4-24 | |
| 酵母 | ActiveDry | ||
| 顕微鏡 | ソニー | ワイルド M420 | |
| ブラシ | ロウ コーネル | 245B | 標本を移動するために使用されている |
| Labview ソフトウェア | 国立楽器 | ||
| ImageJ | 国立衛生 | ||
| Matlab | Mathworks | ||
| ピンセット | Wiha | AA SA | 果物を固定するフライウィングス |
| FlyNap | カロライナバイオロジカルサプライ | カンパニー4,224,898 | |
| スコッチパーマネント両面テープ、3 M | スコッチ | ||
| ピペット | フィッシャーブランド | MU18837 | |
| オーガニックエクストラココナッツオイル | スプリング | バレー13183 | |
| 顕微鏡スライド | キャピトルブランド | M3504-E | |
| ショウジョウバエバイアル | SEOH | 8401SS | |
| All-trans-retinal | Sigma-Aldrich Co. | R2500 |
参考文献
- Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. ....
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再版と許可
