ショウジョウバエの調製と光コヒーレンス顕微鏡を用いてin vivoで心機能の縦イメージング（OCM）

サマリー

ここでは、さまざまな発生段階でショウジョウバエを準備し、カスタム光干渉顕微鏡(OCM)システムを使用してショウジョウバエの心拍の縦方向の光学イメージングを実行するための実験プロトコルが説明されています。心臓の形態学的および動的変化は、OCM画像から心臓の構造的および機能的パラメータを分析することにより、定量的に特徴付けることができます。

要約

小動物の心拍の縦断的研究は、心臓の発達中の構造的および機能的変化を理解するのに役立ちます。光干渉顕微鏡(OCM)は、高い空間分解能と超高速のイメージング速度で小動物の心臓をイメージングできることが実証されています。高い画像コントラストと非侵襲的な特性により、OCMは組織の解剖や染色を必要とせずに縦断的研究を行うのに理想的です。ショウジョウバエは、その多数の相同性ヒト疾患遺伝子、脊椎動物との分子メカニズムと遺伝経路の類似性、ライフサイクルの短さ、および培養コストの低さから、心臓発生研究のモデル生物として広く使用されています。ここでは、ショウジョウバエの調製と、標本のライフサイクル全体にわたるカスタムOCMシステムによる心拍の光学イメージングに関する実験プロトコルについて説明します。このレポートで提供されている手順に従うことにより、横方向のMモードおよび3D OCM画像を取得して、ショウジョウバエの心臓の形態と機能の縦断的研究を行うことができます。顔面および軸方向の断面OCM画像、心拍数(HR)および心臓活動期間(CAP)ヒストグラムは、心臓の構造変化を分析し、ショウジョウバエの変態中の心臓のダイナミクスを定量化することも示されました。また、Mモード画像で構成されたビデオと組み合わせて、心臓の活動を直感的に追跡することが示されました。ショウジョウバエと脊椎動物との遺伝的類似性により、ショウジョウバエの心臓の形態と動態を縦断的に研究することで、ヒトの心臓疾患の起源を明らかにすることができる可能性がある。ここでのプロトコルは、ヒトの心臓病のメカニズムを理解するための幅広い研究を実施するための効果的な方法を提供します。

概要

小動物における心臓の縦断研究では、このような遺伝子関連先天性心臓欠陥^1,2のようなヒトの関連心血管疾患、各種の理解に貢献しています。過去数十年、このようなマウスを^3,4、アフリカツメガエル^5,6、ゼブラフィッシュ^7,8、鳥^9、及びショウジョウバエ^10-16などの様々な動物モデルにおいて、研究に関連する人間の心臓の開発を行うために使用されています。マウスモデルは広く、正常と異常な心臓の開発とヒトの心臓^3,4との類似性に起因する心臓の欠陥表現型を研究するために使用されています。アフリカツメガエル胚は、その取り扱い易さと半透明^5,6に対する心臓の開発の研究に特に有用です。ゼブラフィッシュモデルの胚と早期の幼虫の透明性は、心臓の開発^7,8の簡単な光学観察を可能にします。鳥類のモデルは、発達心臓研究の共通の課題であるbecaus電子心は簡単に卵の殻と人間⁹に鳥の心の形態学的類似性を除去した後にアクセスすることができます。 ショウジョウバエモデルは、心臓の長手方向の研究を行うために最適ですいくつかのユニークな機能を備えています。まず、 ショウジョウバエの心臓管は、心臓の光アクセスおよび観察のための利便性を提供し、背側表面下〜200μmで、です。さらに、多くの分子メカニズムと遺伝的経路は、ショウジョウバエと脊椎動物の間で保存されています。ヒトの疾患遺伝子の75％以上のオルソログは、それが広く、トランスジェニックの研究^11,13で使用されてきたショウジョウバエで発見されました。また、短いライフサイクルと低メンテナンスコストを有し、そして一般に発生生物学研究^14-16する試料モデルとして使用されています。

以前の報告は、彼のようなショウジョウバエの心臓機能を監視するためのプロトコルを記載しましたartbeat。しかし、解剖手順は^17,18を必要とされました。光学イメージングは​​、非侵襲的性質のために、動物の心臓の開発を可視化するための効果的な方法を提供します。異なる光学イメージングモダリティは、二光子顕微鏡^19、共焦点顕微鏡^20,21、光学シート顕微鏡^22、および光コヒーレンストモグラフィー^{（OCT）16,23-26}ように、動物の心臓の研究を行う際に適用されています。比較的、OCTは高分解能と超イメージング速度を維持しながら、生きた動物を画像化するために重要である、造影剤を使用せずに、小動物の心臓に大きなイメージング深度を提供することができます。また、OCTシステムの開発の低コストの検体の光学的イメージングのためにこの技術を普及しています。 OCTは、正常ショウジョウバエの縦断的研究のために使用されてきました。 OCTを使用して、心臓の形態学的および機能イメージングは​​FUNC、心臓の構造を研究するために行われています的な遺伝子の役割、および心臓の開発中に、変異体モデルにおける心血管の欠陥のメカニズム。例えば、年齢依存心機能の低下は^、10月27日とショウジョウバエのダウンレギュレーションアンジオテンシン変換酵素関連（ACER）遺伝子と確認されました。遺伝子関連心筋症の表現型は、10月^{28から33を}使用して^、 ショウジョウバエで実証されました。 OCTを用いた研究はまた、 ショウジョウバエ³⁴の中心部にある人間SOX5遺伝子の機能的役割を明らかにしました。 10月と比較すると、OCMは、より良い横方向の分解能を提供するために、より高い開口数対物レンズを使用しています。過去には、オルソログ人間の概日遺伝子dCry / DCLOCKのサイレンシングによって引き起こされる心臓機能障害は、肥満誘導されたヒトを理解するために、カスタムOCMシステム^15,16と同様に、 ショウジョウバエにおける心筋症に高脂肪食の効果を用いて研究されてきました心疾患。 ¹⁵

ここで、第電子実験プロトコルは、第二齢（L2）でのショウジョウバエの心臓の形態学的および機能的変化の縦断的研究、三齢（L3）、蛹1日目（PD1）、蛹2日目（PD2）、蛹の3日目（PD3）のために要約されています、蛹4日目、人間関係の先天性心疾患の研究を促進するためにOCMを使用して（PD4）、蛹5日目（PD5）、および成体（ 図1）。このような人事やCAPなどの心臓機能パラメータは、定量的に心臓の開発機能を明らかにするために、異なる発達段階で分析しました。

プロトコル

ショウジョウバエ ¹⁶の光イメージングのためのOCMシステムの作製

1. OCMシステムは、 ショウジョウバエのハートビートを解決することができるようになりますので、少なくとも80フレーム/秒のフレームレートを提供する分光器と高速ラインスキャンカメラを選択します。
2. ショウジョウバエの心臓構造を識別するために、2μmの軸方向の分解能を確保するために、広帯域光源を使用してください。
3. 高横分解能を得るために10倍の対物レンズを使用してください。
4. 基準アーム光を反射し、標本に焦点深度を拡張するために、環状サンプルアーム光ビームを生成するために45°ロッドミラーを使用します。
5. OCMシステムを制御し、測定を実行するためのカスタムコンピュータプログラムを開発します。

2. ショウジョウバエ文化

1. 標準的なフライ食品の準備
   1. ポリスチレンバイアルに〜5ミリリットルインスタントショウジョウバエ式を置きます給紙シュートの支援を受けてチューブ。
   2. 適切に食べ物を飽和させるために数式に〜8ミリリットルの水を注ぎます。
   3. 異なる実験のための標準的なフライ食品に異なるサプリメントを追加します。実験^35をペーシング光遺伝学のためのオールトランスレチナール（ATR）食品の準備をすると、100 mMのATRを抽出し、食品中の1mMのATR濃度を得るために〜8ミリリットルの水に溶解するためにピペットを使用しています。溶液を均一に混合した後、式への溶液を注ぎ、十分にそれをかき混ぜます。
   4. 電子レンジで30秒間のカップと熱で15ミリリットルの水で^〜10,15ミックス、ショウジョウバエの肥満関連心機能障害を研究するための10ミリリットルの式を、高脂肪食を準備します。いくつかの有機エキストラバージンココナッツオイルは、別のカップに入れて、電子レンジで90秒のためにそれを加熱します。
   5. 7.5ミリリットルココナッツオイルを抽出し、〜30/100食品にココナツ油の重量/体積比を作るために十分に準備された式と混合し、目エキス〜2ミリリットルエン混合食品やチューブの底にそれを置きます。
   6. 媒体が完全に飽和するまで1分間待ちます。 ショウジョウバエのための生活条件を最適化するために、平らな面で慎重に食品を圧縮。準備された式に酵母の8粒、および綿のクラスタでチューブを差し込む - 6を追加します。
2. フルーツフライ十字架と文化
   1. 準備された標準的なフライ食品とチューブを取り、差し込ま綿を削除します。慎重にチューブに（オスとメス）大人のハエを転送し、すぐに綿でチューブを差し込みます。チューブからの脱出からハエを防ぐために、綿や管壁との間に隙間がないことを確認するために綿を確認してください。
   2. 交雑育種のために25℃のインキュベーターでショウジョウバエを保管してください。遺伝子の大部分が活性であり、細胞タンパク質を25℃で^36〜39で合成されます。
   3. 8手の転送Aの後にインキュベーターからチューブを取り出しdultは、実験的な制御のための同様の年齢で卵を得るために、チューブの外に飛びます。
   4. 8.5日^40,41の開発期間とショウジョウバエの開発のための標準的な温度である25℃、インキュベーターに卵を培養し続けます。
      注：温度が発育期間（大人への卵）と種々の遺伝子の発現レベルに影響を与えます。

3. OCMと光イメージングの実行

1. 光イメージングのためのマウントフライ幼虫
   注：22 ショウジョウバエのハッチの卵- 1齢幼虫（L1）に25℃で24時間。第二齢幼虫は、別の24時間後に現れます。最大の幼虫の形は、約24時間後に脱皮3齢幼虫です。幼虫の構造的特性は、それらの異なる発達段階を区別するために使用することができます。第一齢と第二齢の間の口器の大きさが異なっています。口第二齢幼虫の口のフックが大きく、構造が明確になりつつ、第1齢幼虫のフックは、非常に小さく、小さな黒点の二対のように見えます。気門は、通常、二齢と三齢を識別するために使用されています。三齢のために、前方気門が分岐され、一方で第二齢幼虫は、前方気門をこん棒ました。濃いオレンジ色のリングは3齢幼虫における後部気門の先端に表示されるようになります。
   1. きれいな顕微鏡用スライドガラスに両面テープ片を適用します。撮像中の気泡によって引き起こされる反射を回避するためにテープの下に気泡を追い出します。
   2. 幼虫の段階でインキュベーターから培養ハエとチューブの1を取り出します。
   3. クリーンな組織上の柔らかいブラシと場所でメディアから削除し、メディアに幼虫を識別します。湿った柔らかいブラシで幼虫に付着した任意の食品を削除して、組織でそれを乾燥させます。
   4. cleaneを移動広視野顕微鏡の対物レンズの下の組織に飛ぶdは。
   5. ハエのクリアな視界を見つけるために、顕微鏡の焦点を調整します。顕微鏡でその構造的特徴によって幼虫の右の発達段階を識別します。
   6. 柔らかいブラシを使用してフライを置きます。体がまっすぐに背側と背側によりスライドガラス上に装着するための準備をするために上向きにされていることを確認。顕微鏡下で、この手順を実行します。
   7. 幼虫は、テープ上にマウントする前に完全に乾燥していることを確認してください。それ以外の場合は、幼虫がテープに付着しません。
   8. 適度な圧力でスライドガラス上に両面テープに位置付けフライの背側を貼り付けます。あまりにも多くの圧力がハエを殺すことが、あまりにも少し力が撮像中の動きを飛ぶためにつながることに注意してください。
2. OCMと幼虫期（L2とL3）でのショウジョウバエの光イメージング
   注：心管の広い内腔はfoをすることができますウント幼虫の段階でA8にA5の間のセグメントに位置する（ 図1）。横OCM Mモード画像（2次元+時間）が収縮期および拡張期の分析を容易にするために、それぞれの幼虫のための心臓チューブのA7セグメントで取得しました。
   1. 対物レンズの下に上向きに背側とy軸、横方向に沿ってOCMシステムの調整可能な試料ステージ上に取り付けられた幼虫を置きます。試料ステージに小さな穴がステージ面との接触を避けるために、幼虫を配置するために必要です。
   2. 結像ビームの焦点面にミバエの心管を移動する試料ステージを調整します。簡単A7セグメントを見つけるには、リアルタイムの画像取得ソフトウェアにおける断面OCM画像と心管の後部領域を見つけます。 A7セグメントが表示されるまで、次に前方にステージを移動します。
   3. セットB-1スキャンあたり100 A-スキャン（フレーム）、100 B-スキャンする画像取得ソフトウェアのパラメータ、およびscanneR電圧〜0.28、X横方向にミリメートル、及びY横方向に0 Vをカバーします。暗い布でサンプルビーム経路を遮断することによってバックグラウンド除去のためのバックグラウンドノイズデータを取得するソフトウェアで「スタート」ボタンをクリックします。
      注：100のフレーム3は、バックグラウンド減算のために使用することができます。
   4. 〜のx横方向に0.28ミリメートル、およびy横方向に0 VをカバーするためにB-1スキャンあたり128 A-スキャン、4096 B-スキャン、スキャナ電圧にデータ収集ソフトウェアのパラメータを設定します。約30秒間0.28 X 0.57ミリメートル^2をカバー^する領域の上にフライ心管のA7セグメント全体の横Mモード画像を取得するソフトウェアで「スタート」ボタンをクリックします。
   5. 撮像光にフライ心臓の長時間暴露を避けるために、データ退避処理中に暗い布を用いた撮像光を遮断します。
   6. 心の楽しみの信頼性の高い測定を得るために、5回の測定を繰り返しますction。
   7. X-横方向に〜1.7ミリメートル、およびy横方向に〜4ミリメートルをカバーするためにB-1スキャンあたり400 A-スキャン、800 B-スキャン、スキャナ電圧に対する画像取得ソフトウェアのパラメータを設定します。全体のミバエを画像化することができる保証するために、両方の方向にステージを移動します。 3次元でショウジョウバエの画像を得るために、1つのデータセットを取得するために、ソフトウェアで「スタート」ボタンをクリックします。注：3Dフライ構造はアミラ3Dソフトウェアを使用してレンダリングすることができ
   8. 測定されたフライを湿らせ、ゆっくりとガラススライドから削除するには湿った柔らかいブラシを使用してください。継続的な発展のために別のチューブにそれを移動します。次の発達段階を経て縦断的研究のためのチューブにラベルを付けます。
3. 画像ショウジョウバエ蛹の段階で
   注：すべてのミバエはPD1からPD5のイメージングのために取り出しました。 図1bにおける幼虫の概略図に示されるように、広範な管腔は番目のA8セグメントにA5に留まりますPD1までの電子の心管。 PD2からは、円錐形のチャンバは、A4サイズのセグメントにA1の間に開発を開始します。一貫性のある画像を取得し、心臓の分析を容易にするために、横Mモード画像は、 図1bにマークされたように、PD2後PD1でA7セグメントから、およびA1セグメントから得ました。
   1. PD1の画像ショウジョウバエ
      注： - PD1中（1時間0） ショウジョウバエは、短い時間枠の白蛹殻を持つことになります。この時間ウィンドウは、高い透明性がOCMイメージングのために、より高い光の浸透につながるため早期蛹の光学イメージングを行うための理想的です。
      1. 彼らは蛹になるとミバエが管壁に見られるように、濡れた柔らかいブラシでPD1での撮像のために個々のチューブから蛹を削除し、体に付着した食品がある場合はブラシで蛹を清掃してください。
      2. 直接濡れたブラシで、小さなガラススライド上のミバエをマウントし、上向きに背側を保つ（ 図1a
      3. フライ本体の側面から過剰な水を除去します。
      4. 上にミバエを保ち、OCMシステムの試料ステージ上にスライドガラスを置きます。幼虫の測定で説明したのと同じ戦略を用いたフライ心のA7セグメントの明確なリアルタイム画像を検索します。
      5. セクション3.2のようにデータ収集ソフトウェアの同じパラメータを設定し、画像A7セグメントでのハートビートが横Mモードと3D画像を取得します。
      6. 撮影後、戻って連続培養用チューブに蛹とガラススライドを配置するためにピンセットを使用しています。
   2. PD2で画像ショウジョウバエ PD5ステージへ
      注：試料は蛹段階ますます不透明になるので、イメージングシステムの侵入深さが低減されます。
      1. 慎重にガラス秒を削除するには、ピンセットを使用して、ライドは、イメージングのための管からのPD2でフライを搭載しました。 PD2では、試料の殻、黄色になり、体がPD1（ 図1）に比べて少なく透明になります。
      2. OCMシステムの試料ステージ上にスライドを置きます。
      3. OCMシステムの結像ビームの焦点面にハエを移動する試料ステージを調整します。リアルタイムの断面OCM画像と心管の前端を検索します。心管のA1セグメントを見つけるために戻って後方に〜50ミクロンを移動します。
         注：心臓の開発（PD2）のこの時点では、円錐形のチャンバは非常に小さくなり、暴行することはできません。
      4. 以前の発達段階と同様の方法を用いて、横方向のA1セグメントからMモードデータセットだけでなく、3Dデータを収集します。
      5. 連続培養のために慎重に戻ってチューブにスライドを置きます。
         注：PD3では、シェル内の試料の色は、PD2の段階ではそれよりも暗いです。 PD4の段階では、ブラックストライプは、CAn個の標本の殻の内側に観察すること。他の人がPD5に進化する一方、いくつかのハエは、次の日のこの段階から大人へと発展します。 PD5の段階では、ブラックストライプがさらに明らかにショウジョウバエで見られています。これらのハエは、次の日に大人になるだろう。
4. 大人の段階での画像ショウジョウバエ
   注：大人の段階では、女性と男性のハエは、体の大きさや下腹部の色で区別することができます。男性は小さく、暗い色の下腹部にある間、女性の大人は、より大きなサイズを有します。
   1. ミバエが大人に発展するときにインキュベーターからチューブを取り出し、そして大人が〜45ミリリットル空のバイアルに飛ぶ移します。
   2. 、麻酔にワンドの吸収性終わり（〜1cmの長さは、〜3ミリメートルの直径）を浸しバイアルに杖を入れ、ちょうど差し込ま綿の下とに麻酔終わりを維持するために綿のクラスタでチューブを差し込みますanes3分間フライをthetize。麻酔の持続時間は、ハエの大きさに依存し、（例：2.5分間のオス、3または3.5分間メス）2.5〜3.5分の間で変化してもよいです。
   3. 両面テープの切れ端でスライドガラスを準備します。
   4. 背側を上に向け、柔らかいブラシを使用してスライドガラス上に麻酔ハエを移動します。
   5. ピンセットを使って翼を分離し、フライを修正し、イメージングのための心臓領域を露出するために、顕微鏡下でテープに翼を貼り付けます。
   6. 画像フライ心のA1セグメントからフライ（ 図1）。実験の終了時に、フライを屠殺してもよいです。

4.イメージング解析¹⁶

1. 画像ファイルへの画像取得ソフトウェアを用いて収集2Dと3Dのバイナリファイルを変換するためにMatlabのプログラムを開発します。
2. クリートする横Mモード画像における心臓管領域と魔法の杖アルゴリズムを識別するためのImageJを使用して、各横Mモード画像用の心臓領域のEAマスク。セグメントマスクされた領域と収縮期および拡張期の位置を識別するために、ピーク発見アルゴリズムを使用しています。横Mモード画像から時間依存心径の変化を計算します。
3. 取得した時刻依存心の直径に基づいて、このようなHR、心臓活動期間（CAP）、拡張末期径（EDD）、収縮末期径（ESD）、拡張末期面積（EDA）などの心臓パラメータを計算し、（収縮期面積を終了ESA）。短縮率（FS）とを計算します
4. フライ心臓の構造的な発展を可視化するために、3D OCMの画像を分析するためのImageJを使用してください。

結果

縦心臓イメージングは​​、OCMを用いて室温で24B-GAL4 / +株とショウジョウバエを用いて行きました。測定は、変態処理（ 表1）を追跡するためにL2、L3であり、PD1からPD4に8時間間隔、及び成人1日目（AD1）で行いました。幼虫、早期蛹、後半蛹および成人のハエは、 図1Aに見られるようなガラススライド上にマウントしました。幼虫と大人のハエのための心のセグメントの特徴は、図1Bの概略図に示しました。

この発達研究では、4096フレームは、ショウジョウバエのハートビートを追跡するために、当社独自のOCMシステムと32秒で取得しました。測定精度を向上させるために、5反復測定は、各発達段階における各検体のために採取しました。 3Dデータは、変態の間に心臓構造の変化を観察するために得ることができます。

横Mモード及び3D画像は、CでしたカスタムMatlabのプログラムとImageJのでreated。 顔画...

ディスカッション

幼虫と大人の段階で400 bpmの周り最大HRとショウジョウバエの急速な心拍は、心臓diastolesとsystoles（経験に基づいていない未満80フレーム/秒）を解決するために、高い描画速度を必要とします。小さい心腔サイズおよびミクロンスケールの心臓壁の厚さ（5 - 10μm）を、高い空間分解能（2マイクロメートルよりも良好な）心管構造を解決するために必要とされます。本研究では、高解像度、超高速OCMシステムは、格子600本/ mmの送信と分光器と2048ピクセルのラインスキャンカメラを使用した場合に、開発されました。 20キロヘルツのAスキャン速度は、ラインスキャンカメラによって提供されます。 128フレーム/秒のフレームレートは、L2、L3、PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、および成人を含む複数の発達段階、でショウジョウバエのハートビートをキャプチャするのに十分高速です。光源は〜800nmでの中心波長および帯域幅を持つ広帯域スーパーコンティニューム光源だったと〜220それぞれnmおよび組織における〜1.3ミクロンの距離分解能を得ました。 10倍の対物レンズは、3.9ミクロン〜の横断方向...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
カスタムOCMイメージングシステム	私たちの研究室
私の温度 ミニ デジタル インキュベーター	ベンチマーク	H2200-HC
カバーガラス	AmScope	200PCS
コットン ボール	RITE AID
インスタント ショウジョウバエ フォーミュラ	カロライナ	フォーミュラ 4-24
酵母	ActiveDry
顕微鏡	ソニー	ワイルド M420
ブラシ	ロウ コーネル	245B	標本を移動するために使用されている
Labview ソフトウェア	国立楽器
ImageJ	国立衛生
Matlab	Mathworks
ピンセット	Wiha	AA SA	果物を固定するフライウィングス
FlyNap	カロライナバイオロジカルサプライ	カンパニー4,224,898
スコッチパーマネント両面テープ、3 M	スコッチ
ピペット	フィッシャーブランド	MU18837
オーガニックエクストラココナッツオイル	スプリング	バレー13183
顕微鏡スライド	キャピトルブランド	M3504-E
ショウジョウバエバイアル	SEOH	8401SS
All-trans-retinal	Sigma-Aldrich Co.	R2500