方法論記事

（ゼブラフィッシュにおける癌細胞の血管浸潤能をテストします

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DOI：

10.3791/55007

⸱

2016年11月3日

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, Lombardi Comprehensive Cancer Center, Georgetown University

この記事について

サマリー

この方法は、効果的に癌細胞の血管の浸潤能をテストするためにゼブラフィッシュ胚を利用します。蛍光性の癌細胞は、心臓前方の洞または胚の開発の卵黄嚢に注入されます。癌細胞血管浸潤と血管外漏出は、24から96時間後に尾部領域の蛍光顕微鏡によって評価します。

要約

がん細胞の血管浸潤と血管外漏出は、転移進行の特徴です。 がん細胞の内皮浸潤の従来のin vitroモデルは、通常、浸潤細胞がin vivoでさらされる流体力学を欠いています。 しかし、マウスモデルのようなin vivo系は、生理学的に関連性が高いものの、より長い実験時間スケールを必要とし、モニタリングやデータ解析に関連する独自の課題があります。 ここでは、がん細胞の血管浸潤と血管外漏出の迅速な評価を可能にすることで、この技術的ギャップを埋めようとするゼブラフィッシュアッセイについて説明します。 このアプローチでは、血管系が対照的な蛍光レポーターによって特徴付けられている透明な生後2日齢のゼブラフィッシュ胚の心臓前洞に蛍光がん細胞を注入します。 注射後、がん細胞は循環中で生存し、その後、血管から胚の尾側領域の組織に血管外漏出する必要があります。 血管外に増殖したがん細胞は、固定された時点での蛍光イメージングにより、生きた胚で効率的に同定され、スコアリングされます。 この手法は、注射部位を卵黄嚢に変更することにより、がん細胞の不均一な混合物間の血管内および/または競争を研究するように変更できます。 これらの方法を組み合わせることで、がん細胞の特徴的な挙動を評価し、転移性表現型への悪性進行を示すメカニズムを明らかにするのに役立ちます。

概要

転移性疾患は、癌死亡率および癌細胞の播種を可能にする1が発見されずに残っている多くのメカニズムの主要な原因です。正常に転移する癌細胞のためには、まず、原発腫瘍を囲む間質を介して侵入しなければならない循環系に（intravasate）を入力し、輸送中に生き残る、循環からの出口（浸出）、および最後に実行可能なコロニーを確立します遠隔臓器サイト2で。血管内および血管外漏出は、このように転移カスケードにおける重要なステップであり、まだすべての癌細胞は、内皮接合部3を介して破壊し、移行では、本質的に熟達していません。実際には、癌細胞の血管浸潤を取り囲み、プロセスはさらに、内因性及び外因性因子4の様々な影響を与えることができるユニークな選択圧のシリーズがあります。これらの理由から、進行期癌の攻撃的な行動を調べる技術は、多くの場合、Vに焦点を当てます転移拡散を予測する手段としてascular浸潤能。

様々なモデル系は、in vitroでの癌細胞の血管浸潤の研究を促進するために存在します。 インビトロアッセイにおいて最も使用され、癌細胞6によって無傷内皮単層のリアルタイム破壊を監視するために、内皮障壁5または電気細胞-基質インピーダンスセンシング（ECIS）技術を介して癌細胞の移動を評価するために、トランスウェルシステムのいずれかを含みます。これらのアッセイは、典型的には、それ以外の内皮壁に癌細胞の付着に影響を与える流体力学および間質の要因を欠いています。この問題は、やや間質細胞を支持して内皮の3D培養から生じる灌流血管ネットワークによって回避されており、これらの3Dマイクロ流体システムは現在、in vitroでの現在のオプション7,8の最前線を表します。それでも、これらのアプローチは、機能的な循環系の堅牢な微小環境を省略しますしたがって、唯一のin vivoでのモデルの一部代替インチ

最も広く血管浸潤のin vivoモデルで使用されるそれらは、比較的短い時間スケール上に発生し、一般的転移能9を示しているので、実験的転移アッセイが一般的に実行されたマウスです。これらのアッセイは、循環への癌細胞の直接注入を伴う、したがって転移、臓器の血管外遊出すなわち癌細胞コロニー形成の最終段階をモデル化します。実験的転移アッセイは、癌細胞の注射部位に基づいて異なると器官は、最終的に分析しました。第1のアッセイ型では、癌細胞をマウスの尾静脈に注入され、肺の癌細胞の播種は、10,11モニターされます。第二のアッセイは、転移性骨微小環境12-14に向かって播種するだけでなく、脳15を指示するために心臓内注射を実行する必要があります。第三のアッセイでは、癌Cellsは頸動脈に第送達経路は、脳17,18に癌細胞を担持し、一方、肝臓16のコロニー形成を可能にするために、脾臓内に注入されます。かかわらず、癌細胞送達方法、臓器のコロニー形成の受け入れ実験的エンドポイントであると一般的に発光、組織学、またはPCRベースの技術を介して決定されます。マウス宿主内で実験的転移アッセイを行うの生理学的な利点にもかかわらず、これらの実験はまだ完了し、分析するために数週間から数ヶ月が必要です。

ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）モデルは、最近、癌の進行19,20を研究するための新しいシステムとして登場し、マウス21-24と比較してはるかに短い時間スケールで機能的な循環系内の癌細胞の血管浸潤の評価が可能にしました。この方法は、その内皮は緑のサンゴのfluoのタグが付いている透明なゼブラフィッシュ系統を利用しますkdrlプロモーターによって駆動されるrescentタンパク質レポーター、血管内皮増殖因子25ゼブラフィッシュレセプター。アッセイでは、癌細胞は赤色蛍光マーカーで標識され、2日齢の胚の心臓前方の洞に注入しました。どこでも注射後48〜96時間の間に、血管系の外と胚の尾部領域に侵入した癌細胞は、蛍光顕微鏡で効率的に得点することができます。ここでは、それらの血管の浸潤能で全く差異を実証するために一般的に使用されるヒト乳癌細胞株のパネルに技術を適用します。さらに、我々は癌細胞集団は、示差蛍光色素で標識され、蛍光血管系を欠くゼブラフィッシュ胚に注入することができるように、胚の卵黄嚢に注射部位を変えることは、不均一な細胞相互作用の研究を可能にすることを示しています。この後者のアッセイでは、卵黄に侵入した癌細胞はvasculaturにintravasatedeは注射後48時間に尾部領域24で採点されます。これにより、モデルの有効性と利便性のために、ゼブラフィッシュはますます急速に生理学的な設定の下で、癌細胞の血管の侵襲能力を試験するために使用されます。

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プロトコル

倫理文：承認されたIACUCプロトコルに従ってゼブラフィッシュの胚を生成しました。これらの実験は、ジョージタウン大学動物実験委員会によって勧告に準拠して実施しました。

1.注射用胚を整理し、原液を作成します。

  1. 癌細胞の血管浸潤を評価するために必要なゼブラフィッシュの幼虫を生成します。
    1. mitfa b692; ednrb1の B140の魚：（grcfp kdrl）ZN1 Tgを有するにおけるクロス交配ペアワイズまたはグループを設定します。
      注：ZN1; mitfaのb692; ednrb1の B140のゼブラフィッシュを、Tgは（kdrl：grcfp）交配することによって：我々は、Tgは（grcfp kdrl）を生成した色素細胞を欠いている行で、内皮細胞に緑色のサンゴ礁のサンゴの蛍光タンパク質を発現ZN1 25を 、mitfa b692; ednrb1 B140、ゼブラフィッシュ国際リソースセンターで開発されました。
    2. 共同llect卵、清潔、そして翌日22未受精または変形した胚を削除します。
    3. ゼブラフィッシュの胚は受精後（2 DPF）2日間あるときに発生する、癌細胞の注射の準備ができるまで、28.5℃で胚を培養します。
  2. 注入プレートを作成します。
    1. 各プレートのためのdH 2 O中1.5％アガロースの25ミリリットルを溶かします。
    2. 100ミリメートル×15ミリメートルのペトリ皿にアガロースの12ミリリットルを注ぎ、それを硬化させます。
    3. プレートに残っているアガロースを注ぐその後、再溶融。
    4. それは、アガロースに30度の角度であり、プレートの中央に位置するようにすぐにカットガラスモールド（7.5センチx xは7.2センチメートル広い3ミリメートル）を配置します。
      注：これは急な60°の壁と30°傾斜したランプを作成します。
    5. 代わりにガラスモールドをテープやアガロース硬化しましょう。
    6. 静かにガラスモールドを除去し、アガロースを引き裂くしないように注意してください。
      注型は、4℃でのdH 2 Oに保存することができます。
  3. 魚の水（0.3グラム/ Lの海塩）で注入プレートを平衡化します。
    1. 蒸留水で2回プレートを洗浄します。
    2. 10分間シェーカー上でプレートと場所に魚の水の10ミリリットルを追加することによって、プレートを平衡化します。
    3. 魚の水でプレートをもう一度平衡化します。
  4. 魚の水22を含む皿にそれらを転送することにより、注射群に2日後に受精（DPF）の胚を分割します。
  5. 注入後に利用するグループごとに回復料理を準備します。回復皿は10ミリリットル魚の水に加え、ペニシリン（25μg/ ml）およびストレプトマイシン（50μg/ ml）を含んでいることを確認してください。
  6. 魚の水+ペニシリンおよびストレプトマイシンの50ミリリットルに緩衝トリカインストック（4 mg / mlで、10 mMトリス、pHが7）の4ミリリットルを追加することで、2倍トリカイン溶液を調製します。
  7. イマジンライブ胚を固定します取り付け麻酔媒体を生成するために、2倍トリカイン溶液10ml中に15mgの低融点アガロースを溶解グラム。
    注：マウント培地を1.5％アガロースで構成されています。
  8. マイクロインジェクションの針を引き出します。
    1. 垂直ピペットプラーにガラスキャピラリーチューブを置きます。 20ミリアンペアの電流と2コイルの発熱体を使用して長いテーパー状のピペットを引き出します。

親油性蛍光色素で標識化2.癌細胞

  1. その推奨される培養条件でがん細胞を維持します。
    注：BT-474、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468およびSK-BR-3：これらの行は、DMEM + 10％FBS中で維持しました。 HCC 1806 T-47D：これらのラインは、RPMI + 10％FBS中で維持しました。すべての細胞株は、インキュベーション中に37 O C及び5％CO 2で維持しました。
  2. 癌細胞の接着培養を解離することにより、単一細胞懸濁液を生成します。
    1. PBSを用いて最初の細胞を洗浄した後、0.05％トリプシン-EDTA溶液で処理します。
      注：トリプシン露光時間細胞株に依存するであろう。
    2. SEとのトリプシン溶液を中和細胞がデタッチした後、ラム含有細胞培養培地。
  3. 遠心分離機200×gで5分間トリプシン中和し、細胞懸濁液を、次いで、細胞計数のために、新鮮な培地中に細胞ペレットを再懸濁します。
  4. 自動化された計数器を用いて細胞懸濁液を計数し、細胞培養培地200μlに100万個の細胞を調製します。
    1. ゼブラフィッシュ胚に注入前にトリパンブルー色素排除と細胞生存率を確認します。
      注：死細胞の注入は、真の血管浸潤が反映されませんようにのみ生存細胞集団は、ゼブラフィッシュ胚に注入する必要があります。
  5. 、100倍希釈よく混ぜ、その後、37℃で20分間混合物をインキュベート：1のための癌細胞懸濁液に赤親油性色素の2μLを加えます。
    注：染料の濃度および標識時間は、各細胞株のために最適化される必要があるかもしれません。
  6. インキュベーション後、チューブに新鮮な培地の1ミリリットルを追加し、その後で5分間遠心200×gです。
  7. 癌細胞からの残留蛍光染料を洗い流します。
    1. 吸引は、細胞ペレットから上清を、200×gで5分間、新鮮な培地1ml中のペレット、及び遠心分離機を再懸濁します。
    2. 洗浄工程をもう一度繰り返します、上清を吸引新鮮な培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁した後、200×gで5分間、再び遠心します。
    3. 洗浄工程三回目を繰り返します、上清を吸引新鮮な培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁した後、200×gで5分間、再び遠心します。
  8. 上清を吸引し、新鮮な培地500μlの中に百万標識された癌細胞を含む細胞ペレットを再懸濁します。
    注：0.5mMのEDTAは、細胞凝集を防止するために、培地に添加することができます。

3.ゼブラフィッシュ胚の事前の心臓洞に癌細胞を注入

  1. 加圧空気源にマイクロインジェクションディスペンスシステムを接続し、目をオンにします電子マイクロインジェクション分配システムの電源。
    1. フットペダルを押すことにより試験圧力。空気の短いパルスは、針ホルダーから放射する必要があります。
  2. 2Xトリカイン溶液で2回噴射プレートを平衡化。
    1. 各平衡段階のために、10分間シェーカー上射出プレートと場所に2倍トリカイン溶液20mlを加えます。
  3. 2倍のトリカイン溶液を含む小さな皿に胚のグループを転送するためにプラスチック製のピペットを使用してください。
  4. ゲルローディングピペットチップを使用して、癌細胞を有するマイクロインジェクション注射針を埋め戻します。
    1. 細胞は先端付近に落ち着くように下向きに先端を有する電極保存瓶に針を置きます。
  5. プラスチックピペットで2倍トリカインをたっぷり使って胚を収集することにより、射出プレートに30麻酔し、胚 - 転送20。
    1. 胚は、ピペットの先端に定住することを可能にします。
    2. ヘントlyがトラフの長さに沿って胚を拡散、注入プレートのトラフに胚を追放します。
    3. トラフの急な壁に直面して上を向く頭と腹を持つ胚を合わせます。
      注：トリカイン溶液は、胚が唯一のトラフに存在すると、トラフの長さとフラットアガロース面の両方をカバーする必要があります。胚は今、注射の準備ができています。
  6. マイクロインジェクションディスペンスシステムを用いて、ゼブラフィッシュ胚の心臓前方の洞に - （5 NL 2）100癌細胞 - 50を注入します。
    1. マイクロマニピュレータの針ホルダーに針を取り付けます。
    2. 左に60度の壁とステレオスコープの下で注入プレートを置き、25倍の倍率でトップ胚に焦点を当てます。
    3. 拡張時、針が胚を貫通するように、マイクロマニピュレーターを配置します。
    4. それはほぼ胚をタッチするまで目で針を拡張します。
    5. 顕微鏡で見ると、トンように針を合わせます帽子には、さらなる伸長時の胚を貫通します。
    6. ピアースだけでチップを置く卵黄嚢を通して胚ではなく、中に、プレ心臓洞。
    7. フットペダルを押すことによって、細胞を注入します。注入の力は、心臓の洞に細胞を放出します。針を撤回。
    8. 右手を使用して、拡張し、注射針を後退させます。左手で、次の胚を配置するために微調整を行います。
    9. 別のプレートを注入するために設定しながら、電極保存瓶に針を戻します。
  7. プレート全体が注入されると、回復皿に胚を移します。
    1. トラフのうち残りの胚を洗浄し、プラスチック製ピペットでそれらを収集し、下部にある胚をプールするために注入プレートを傾けます。
    2. 胚は、ピペットの底に定住することができます。
    3. トリカインの最小容量の回復皿に胚を移します。
  8. Incuba1時間28℃でのTE回収皿。
    1. 死んだ胚および他の破片から独立した実行可能なゼブラフィッシュ胚。
  9. 96時間 - 得点、一般的に24の準備ができるまで33℃で皿をインキュベートします。
    注意：この温度は37℃、癌細胞のための理想的な温度、及び28.5°C、ゼブラフィッシュのための理想的な温度との間の妥協点として決定されます。

4.得点溢出

  1. トリカイン溶液で皿にそれらを置くことによって得点する胚のバッチを麻酔。
  2. トリカインのドロップでうつ病顕微鏡スライド上に麻酔をかけた幼虫を置きます。
    1. 尾部領域の最適なイメージングのための横方向に東洋の幼虫。
  3. 正常に明らかに無傷の細胞を識別するためにテール領域を介して上下に着目して血管系の外に侵入した癌細胞の数をカウントします。
    注：これは、トンに関与する少なくとも2人を持っているのがベストです個々の魚の得点彼のプロセスは、評価される実験条件に盲目です。
    1. 10倍の対物レンズを有する化合物の蛍光顕微鏡で幼虫をスコア。いかなる困難通話用20倍対物レンズを使用してください。

5.スライドとその後の蛍光イメージングに胚をマウントします

  1. 1.5％アガロース/トリカイン溶液を融解し、37℃にもたらします。
  2. トリカイン溶液中にそれを置くことによって撮像される胚を麻酔。
  3. 撮像面にトリカイン溶液の液滴で胚を転送します。必要に応じてガラスボトムディッシュや顕微鏡スライドを使用します。
  4. 撮像面に胚を保持し、過剰トリカイン溶液を除去するためにガラスピペットを使用してください。
  5. 胚の上に溶融アガロース溶液の一滴をオーバーレイ。
  6. 迅速に、アガロースが重合前に、イメージングのために横方向に胚を配向させるために、まつげブラシのような、繊細なツールを使用し、特別な注意を与えます胚を確実にするために、撮像面に沿って平坦化されます。
  7. トリカインソリューションの下になりまし重合アガロースドロップを水没。
  8. 顕微鏡イメージングにライブゼブラフィッシュ胚を施します。

6.変更：ゼブラフィッシュ胚の卵黄嚢に癌細胞を注入

  1. 以前にこのプロトコルの項（3）に記載されているようにマイクロインジェクションディスペンスシステムと注入プレートを準備します。
  2. 以前にこのプロトコルの項（2）に記載されているように対照的な蛍光色素と2つの細胞集団にラベルを付けます。
  3. 卵黄嚢の中に2×10 ^ 7細胞/ mlの10 NL - 5を注入します。各細胞集団から - （200癌細胞100）同一の細胞数を注入する注入量を一定に保ちます
    注：一つは、このアッセイの蛍光血管系を欠く透明なゼブラフィッシュの胚を使用することができます。受動的な脈管構造への粒子の侵入蛍光ビーズ（<10ミクロン）を注入することによってために制御することができ、あるいは、変化させますネイティブ、intravsateしない細胞株。
  4. 以前に（3）このプロトコルの、その後成功した注射用画面セクションで説明したように注入された胚を回復します。
    1. 首尾よく新しい皿に注入した生存可能な胚を選別し、転送するためにステレオスコープを使用してください。
      注：すべての胚は、卵黄に位置する細胞の一貫サイズの質量を持っている必要があります。任意の細胞は卵黄の外側に配置されている場合は質量のサイズが異なる場合、または胚は廃棄されます。
    2. 癌細胞が明らかに卵黄嚢に見られる場合は、新しい皿に実行可能な胚を移します。
  5. 48時間 - 得点、一般的に24の準備ができるまで33℃で皿をインキュベートします。
    注意：この温度は37℃、癌細胞のための理想的な温度、及び28.5°C、ゼブラフィッシュのための理想的な温度との間の妥協点として決定されます。
  6. 、血管内をスコアこのプロトコルの項（4）に記載されているガイドラインに従うのではなく、Cの数をカウントするには成功した尾部領域の血管系に侵入したancer細胞。

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結果

ここでは、ゼブラフィッシュ胚モデルで一般的に使用される乳癌細胞株（ 図1）の血管の侵襲能力を試験しました。厳格な基準は、癌細胞が明らかに溢出した場合は正のイベントのみカウントされ、これは細胞の破片を得点に起因する可能性のある偽陽性を制限するために主に行われていたこれらの異なる細胞株、のために得点溢出に採用されました。

侵入が心臓前方の洞（ 表1）への注射後96時間を評価したとき、我々の分析では、行の中で極端に異なることが明らかになりました。試験した7細胞株、MDA-MB-231細胞株を注射したゼブラフィッシュ胚は胚あたりの血管外遊出した腫瘍細胞の最大数は、行の受け入れ転移性質（ 図2）と一致する所見を示しました。我々はまた、容易に私そのBT-474細胞を発見しましたこのようなMCF-7、SK-BR-3、およびT-47D細胞のような他の細胞株は、（

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ディスカッション

この技術は、効率的に癌細胞（ 図1参照 ）の脈管浸潤能を試験するためのゼブラフィッシュモデルを利用します。ここでは、他の研究者は、その後、独自の研究（; - 3図2、 表1を参照）を構築することができ、その上にベースラインを提供するために、乳癌細胞株のパネルに技術を適用しました。 MDA-MB-231細胞は容易にゼブラフィッシュ胚の尾部領域に侵入観察は、血管浸潤を阻害する可能性がある薬剤をテストするためのこの細胞株の理想的になるだろう。例えばHCC1806またはMDA-MB-468細胞のような比較的低侵襲性の細胞株は、そうでなければ血管浸潤を増強するであろう因子を研究するために使用することができます。実験のこれらのタイプは、薬物を含めることを必要とする場合は、一方が治療効果は耐久性であると予想されるかどうかに応じて、配信2つの異なる経路を有しています。癌細胞は、薬物注射の前にして前処理することができます胚または薬物は直接拡散することによって癌細胞に影響を与える胚を収容する水に添加することができます。 <...

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

私たちは、ゼブラフィッシュの胚のイメージングを支援してくださったジョージタウン大学顕微鏡コアのPeter Johnsonに感謝します。 Microscopy & Imaging Shared ResourceおよびZebrafish Shared Resourceは、NIH/NCIの助成金P30-CA051008によって部分的にサポートされています。 この研究は、NIH/NCI CA71508 (AW) と CA177466 (AW) の支援も受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.05% トリプシン EDTAライフ テクノロジー25300-054
100 mm ディッシュコーニング インコーテッド3160-100
5 3/4" ディスポーザブル パスチャー ピペット、ホウケイ酸ガラスフィッシャー ブランド13-678-20B
60 mm ディッシュコーニング インコーテッド3160-60
アガロース、低融解フィッシャーBP165-25
アガロース、分子グレードバイオラインBIO-41026
キャピラリーガラス、標準、1.2 mm x 0.68 mm、4"AMシステムズ、Inc627000
David Kopf 700C垂直ピペットプーラーホフストラグループ3600
DMEMLife Technologies11995-065
保管ジャー、1.0 mmWorld Precision Instruments、IncE210
エチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩 (トリカイン、MS-222)フルーカA5040
まつげブラシテッド・ペラ社113
ウシ胎児血清、熱不活性化オメガサイエンティフィックFB-12
フィッシャーブランドトランスファーピペットサーモフィッシャーサイエンティフィック13-711-7M
ゲルローディングピペットチップフィッシャーブランド02-707-181
ガラス底皿 (12.0 mm)サーモフィッシャーサイエンティフィック150680
ガラス ディプレス スライドVWR470005-634
インスタント オーシャン ソルト、シーソルペンテアIS50
ラテックス ゴム球、2 ml、72 個入りパックヒースロー サイエンティフィックHS20622B
SP8 共焦点顕微鏡ライカ
マイクロマニピュレーター成重
エクリプス E600ニコン
PBSライフテクノロジー10010-023
ペニシリン-G カリウムフィッシャーバイオテックBP914-100
ペトリプレート 100 mm x 15 mmフィッシャーブランド 
Picospritzer IIGeneral Valve Corporation
RPMI 1640 Medium Life Technologies11875-093
ストレプトマイシン硫酸塩Fisher BiotechBP910-50
Vybrant DiIThermoFisher ScientificV22885
Vybrant DiOThermoFisher ScientificV22886
ゼブラフィッシュ ジョージタウンゼブラフィッシュ共有資源
細胞株は、DMEM + 10% FBSで維持され、BT-474およびHCC18-6細胞が期待され、RPMI + 10% FBSで維持されました。
ズ 電極ト ズ FB0875713

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