方法論記事

定量的トランスクリプトーム解析に使用するための種子から高度に精製されたRNAの単離のための効率的な方法

DOI：

10.3791/55008

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2017年1月11日

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1Laboratory of Biological Diversity, Department of Evolutionary Biology and Biodiversity, National Institute for Basic Biology, 2Department of Basic Biology, SOKENDAI (The Graduate University for Advanced Studies), 3Department of Cell Biology, National Institute for Basic Biology

この記事について

サマリー

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高純度のRNA単離に対する阻害効果を持つ油分、タンパク質、ポリフェノールを多く含む植物種子からのRNA単離方法を確立することに成功しました。私たちの方法は、シード中の低レベルの転写産物を持つ遺伝子の発現を監視するのに適しています。

要約

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植物の種子は、生分解性の有機物を含む大量の貯蔵蓄えを蓄積します。人間は、食料や工業材料として種子貯蔵庫に依存しています。遺伝子発現プロファイルは、植物細胞の代謝制御を研究するための強力なツールです。そのため、作物の育種には、種子開発における詳細で正確な遺伝子発現プロファイルが必要です。これらのプロファイルを作成するためには、高度に精製されたRNAを取得することが不可欠です。高度に精製されたRNAを種子から単離するには、効率的な方法が必要です。ここでは、高純度RNAの単離に阻害効果を持つ油脂、タンパク質、ポリフェノールを多く含むシーズからRNAを単離する方法について述べます。私たちの方法は、フェノール、クロロホルム、またはRNA精製のための追加のプロセスを使用せずに、種子から高度に精製されたRNAを得ることを可能にします。この方法は、シロイヌナズナ、菜種、および大豆種子に適用できます。本手法は、発生中の種子や成熟した種子における低レベル転写産物の発現パターンのモニタリングに役立ちます。

概要

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植物は、次の世代を生じる種子を生産します。種子は、ポスト発芽成長のために、そのような油、炭水化物、およびタンパク質などの貯蔵物質、大量に蓄積します。人間は食品や動物飼料の供給源として種子貯蔵準備金を活用し、ひいては植物の種子は、世界的に食用有機物の主要なサプライヤの一つです。種子の収量を増加させると、植物科学における重要な課題です。

種子貯蔵物質が食品や工業材料の商業的に価値のある情報源であるため、これらの引当金の代謝の調節の根底にある分子メカニズムは、広く1-6を検討されています。さらに、これらのメカニズムを解明することは、作物種子収量を増加させるために有用であろう。種子は受精後植物卵巣で開発し、それらは発達段階1,6,7の一連の成熟します。さらに分子機構根底にある種子の開発を理解することは、詳細が必要です種子を開発する一連の正確な遺伝子発現プロファイルが生成されます。しかし、油、タンパク質、炭水化物、および植物種子中のポリフェノールの高い量は、それが困難な遺伝子発現の正確なプロファイリングを排除する高度に精製されたRNAを単離することを可能にします。

ここでは、油、タンパク質、およびポリフェノールを多く含む油糧種子からのRNAの単離のための効率的な方法を紹介します。この方法を使用して、研究者らは、高度に精製されたRNAを調製することができるであろう。このようなRNAは、開発および成熟脂肪種子における種子貯蔵物質の代謝調節を制御する重要な遺伝子で転写変化をモニタリングするために有用であろう。

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プロトコル

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植物の種子からの全RNAの1の抽出

  1. バッファセット、スピンカラム、1.5および2.0 mLのポリプロピレンチューブ、およびヌクレアーゼフリー1.5 mLのポリプロピレンチューブを準備します。
  2. RNA抽出、激しくボルテックスするための溶解緩衝液をセルに（以下、PVPという）分子生物学グレードのポリビニルピロリドン（w / v）の1％を加えます。完全に溶解するために25℃で20分間インキュベートします。 20分間のインキュベーション後、気泡の形成を防止するために逆さまにチューブを回転させることによって穏やかにバッファーを混合します。使用前に室温（15~25℃）で保管してください。
  3. 氷上で1.5 mLのポリプロピレンチューブ中のシロイヌナズナと場所から収穫果物。アルミプレート上に果物を置き、4℃で維持し、実体顕微鏡下で果実から種子を分離します。
    1. 氷の上にアルミラックに格納され、直ちに液体窒素中にチューブを配置された1.5 mLのポリプロピレンチューブに分離された種子（約200種を）置きますitrogen。
  4. 液体窒素からチューブを外して、氷の上にアルミニウムラックに戻します。 4℃で千×gで1分間、1％のPVPと遠心分離機を含む緩衝液100μLを加えます。
  5. 氷の上にアルミラックにチューブを保持したまま60秒間モーターグラインダーを使用して、ステンレス製の乳棒でサンプルをホモジナイズします。
  6. 1％のPVPを含有する緩衝液550μLを加える逆さまチューブを回して穏やかにバッファーを混合し、25℃で10分間インキュベートします。
  7. 25℃で8000×gで5分間遠心し、新しい1.5 mLのポリプロピレンチューブに上清550μLを移します。
  8. 25°C 10,000×gで5分間遠心し、新しい1.5 mLのポリプロピレンチューブに上清450μLを移します。
  9. RNA抽出のための細胞溶解液として上清を使用してください。以下では、市販のキットには、メーカーの説明書に記載の手順に従ってください。
  10. 溶出低レベルの転写物の発現パターンをモニターするためのRNAの十分に高い濃度を確実にするために、溶出緩衝液の最小量を使用してRNA。使用するまでディープフリーザーでRNAを保管してください。

RNAの品質の2.確認

  1. 、全RNAを解凍穏やかなタッピングによって混合し、氷上でアルミラックにチューブを配置します。
  2. 微量分光光度計を用いてRNA濃度、A260 / A280比、およびA260 / A230比を測定します。
  3. 70 ngの/μLの最終濃度になるようにRNaseフリー水で全RNAを希釈します。

種子からの全RNAの3逆転写

  1. 市販のキットから全RNAおよびバッファセットを解凍します。穏やかなタッピングした後、氷上でキットからの酵素を保管してください。ヌクレアーゼフリー0.2 mlのポリプロピレンチューブを準備します。
  2. 0.2 mLのpolypropyに全RNAの5μL、オリゴdTプライマーの1μL（50μM）、およびランダム6量体の1μM（50μM）を追加氷上のレンチューブ。
  3. 37ºCで15分間インキュベートし、氷上に置きます。
  4. 以下は、逆転写PCRキットで、製造業者の説明書に記載されている手順に従ってください。
  5. 使用前に氷上で逆転写産物を置きます。

4.定量的リアルタイムPCR解析

  1. 製造業者のプロトコルを使用して、標的遺伝子配列を保有するプラスミドを構築します。
  2. 標準曲線のためのDNAテンプレートの100-500,000コピー/μLに濃度を調整します。
  3. 蒸留水で：（100 1）のcDNAのソリューションを希釈します。
  4. 定量的リアルタイムPCRキットからマスターミックスに希釈したcDNA溶液及び標準曲線のためのプラスミドの2μLを追加します。
  5. 35秒30秒95℃をした後、5秒、95℃で40サイクル、60℃：以下のサイクリング条件を用いてリアルタイムPCRを設定します。
  6. 男に従ってコピー数を分析リアルタイムPCRシステム用のufacturerの指示。

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結果

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我々は最初のシロイヌナズナ完熟種子を用いて、PVPの最適濃度を調べました。全RNAを、0％、0.25％、0.5％、1.0％または2.0％のPVPを含有する細胞溶解緩衝液を用いて、上記のプロトコルに従って約1,000種から単離しました。油層と種子の破片（ 図1A）を回避しながら、ホモジナイズし、遠心分離後、上清を回収しました。

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図1： 細胞溶解緩衝液中で最適なポリビニルピロリドン濃度の推定。総RNAは、PVPの異なる濃度を含有する細胞溶解緩衝液で抽出しました。 （A）ホモジナイズし、遠心分離後の種子の写真。 （B）各サンプルについて、波長の吸光度...

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ディスカッション

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遺伝子発現プロファイルは、植物生理学の我々の理解に貢献します。従って、特定のRNAの単離方法は、各サンプル条件9-12のために開発されています。我々は、種子からのRNA単離の間に抑制されたプロセスを調査し、RNAをシリカ膜への結合が厳しく抑制されたことがわかりました。油、タンパク質、およびポリフェノールの大量のRNA単離を阻害します。我々は、RNAはシリカ膜に結合する工程の前に、溶解溶液でこれらの化合物を除去するために、RNA抽出過程を改変しました。重要な修飾は、1％のPVP（ステップ1.2）、遠心分離、溶解液からの上清の収集（1.7、1.8ステップ）の添加を含みました。 1％のPVPの添加の目的は、ポリフェノールを除去することです。我々が使用するPVPの最も効果的な濃度を検討し、1％のPVPがこのプロセスのための最も有効な濃度であることが確認されました。遠心分離した溶解液から上清を収集する目的油およびタンパク質を除去することです。上清は、上清中の油層とチューブ内のペレットを保持しないように注意してください収集する必要があります。これらの2つの簡単な修正が大幅に中央で種子や開発の後期段階（ 表1）<...

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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私たちは、ゲノム機能施設と分光とバイオイメージング施設、基生研中核研究施設、およびモデル植物研究施設、基生研バイオリソースセンターのスタッフに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
RNeasy Plant Mini KitQIAGEN74904
polyvinylpyrrolidoneSigma-AldrichP5288-100G
ホモジナイザー S-303AS ONE1-1133-02
NanoDrop LiteThermo ScientificND-NDL-US-CAN
PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)TAKARARR037A
KAPA SYBR高速リアルタイムqPCRキットKapa biosystemsKK4601

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
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