安定同位体のトレースを使用した複雑な細胞のコミュニティのソートされた亜集団で代謝を測定する方法

Summary

この記事では、安定同位体追跡、特定の細胞タイプを分離するための細胞選別、および質量分析の組み合わせを使用して、複数の細胞タイプの複雑なコミュニティにおける細胞代謝を研究する方法について説明します。

Abstract

哺乳類の細胞タイプは特殊な代謝を示し、さまざまな共存する細胞タイプが代謝協力に従事しているという十分な証拠があります。さらに、単一の細胞型の培養物であっても、休止細胞や循環細胞など、異なる代謝状態の細胞を含んでいてもよい。このような亜集団の代謝活性を測定する方法は、細胞代謝を理解するための貴重なツールです。複雑な細胞集団は、セルソーターを用いて分離するのが最も一般的であり、この方法で単離された亜集団はメタボロミクス法で解析することができます。しかし、このアプローチの問題点は、細胞選別手順が細胞にストレスを与え、細胞の代謝を歪める可能性があることです。 >jove_content<これらの問題を克服するために、安定同位体標識栄養素で培養された細胞からの代謝物の質量同位体分布(MID)は、絶対代謝物濃度よりも安定している可能性が高いと推論しました。なぜなら、MIDはより長い時間スケールで形成され、細胞選別条件への短期間の曝露による影響が少ないはずだからです。ここでは、この原理に基づいて、セルソーティングと液体クロマトグラフィー高分解能質量分析(LC-HRMS)を組み合わせた方法について説明します。この手順では、3種類のサンプルを分析します:(1)複雑な集団から直接得られた代謝物抽出物。(2)特定の集団をゲートせずにセルソーター装置を通過した「模擬選別」細胞の抽出物;(3)実際にソートされた母集団の抽出。模擬ソーティングされた細胞は、直接抽出と比較され、MIDが実際に細胞ソーティング手順自体によって変更されていないことを確認してから、実際のソーティングされた集団を分析します。細胞周期の位相に従って選別されたHeLa細胞の結果の例を示し、ヌクレオチド代謝の変化を明らかにします。

Introduction

高等生物は、より複雑な機能をもたらすために協力異なる細胞型の複雑なコミュニティを含みます。例えば、腫瘍は、癌細胞だけでなく、線維芽細胞、血管を構成する細胞だけでなく、を含み、多くの場合、免疫細胞は^、1浸潤します;血液は、免疫細胞サブタイプ²の数十の複雑な混合物が含まれています。さらには培養細胞株は、乳癌細胞³の管腔および基底サブタイプなどの複数の亜集団、から構成されてもよいです。また、共存する異なる細胞型は、代謝、「コラボレーション」を示すことができます。例えば、脳内で、アストロサイトは、この基板^4を酸化ニューロンへのその後「摂食」である乳酸にグルコースを変換するために考えられています。 Tリンパ球は、システイン⁵の供給源として、隣接する樹状細胞に依存して、いくつかの状況です。そして癌細胞はASSOと協力することができます腫瘍⁶でciated線維芽細胞。このようなシステムの代謝挙動を理解するために、存在する種々の細胞型の代謝活動を分離して測定することが不可欠です。

はるか細胞型を分離するために最も広く使用される方法は、蛍光活性化細胞選別です。この方法は広く適用可能であり、目的の細胞型または状態....

Protocol

1.代謝物の抽出

1. 皿からの抽出
   1. 安定同位体標識された培養培地+透析サプリメント（血清または他の成長サプリメント）で三連で6ウェルプレートで培養細胞は、細胞が75％コンフルエントになるまで。
      注：U- ¹³ C-グルコース40％を含むRPMI中で48時間と70％U- ^{13 C、15} N2-グルタミンおよび5％透析FBS（ウシ胎児血清）のためにここでは、培養HeLa細胞。透析FBSは、標識されたメディアを汚染する可能性がある低分子量代謝物を取り除くために使用されます。実際の実験の前に透析したサプリメントで細胞を培養する培地で細胞を正常に増殖していることを確認することをお勧めします。サプリメントは、ヘビ肌透析チューブを用いて、0.15 M NaCl溶液で一晩透析します。
   2. 抽出廃棄培地の日に、500μLの冷HBSSで二回、ウェルを洗浄し、それを捨てます。
      注：ここでは40％を含むHBSSを使用U-13 C-グルコースは培地もあるからです。
   3. 追加600μLの100％メタノールをドライアイス上で予備冷却しました。
   4. ドライアイスに皿を転送し、セルスクレーパーで細胞材料を除去します。
   5. 注意深く質量分析まで-80℃でマイクロ遠心チューブとストアに細胞抽出物をピペット。
2. モ....

Results

一例として、ここでは、細胞周期の段階に応じてソートされたHeLa細胞の代謝を調べる実験を記載します。炭素と窒素の両方に中央代謝物の広い範囲を標識するために、我々はU- ¹³ C-グルコースおよびトレーサーとしてU- ^{13 C、15} N-グルタミンを使用して48時間、細胞を培養しました。同位体の中間レベルはより多様MIパターン^14を生成する傾向があるとして、検証実験のための豊富なのMIDを得るために、我々はここでは、40％U- ¹³ C-グルコースおよび70％U- ^{13 C、15} N2グルタミンの混合物を選びました。

検証実験のために我々は85の代謝産物の標的に分析を行いました。品質が低品質のLC-MSピークを削除する手順を制御した後、我々は66モック選別された細胞（96％）に.......

Discussion

我々の方法は、細胞代謝産物中のMIDは、細胞の代謝活性の「歴史」を反映している原理に基づいています。これは、細胞の複雑なコミュニティで生じたような従来の細胞選別手順と、細胞の亜集団における代謝活性を調査することができます。これとは対照的に、代謝物のピーク面積は、ソートされた細胞と培養皿¹¹から直接抽出の抽出物との間で著しく異なります。部分的に異なる化学組成が質量分析法、いわゆる「マトリックス効果」の信号応答を変化させるためであるが、我々はまた、細胞をバッファ¹¹に保持され、一方のアミノ酸は、選別中の細胞から失われることを示しています。これは、ソートの際に、細胞の代謝状態や活動を変更することができるが、これは我々の方法のために、それ自体には無関係である：MIDの直接抽出で観察されたものにかなり近いあることは、データがVALIのままオリジナルの、複雑な文化の各亜集団の代謝状態のd測定。

私たちは、最初に細胞が急速に代謝をクエンチし、直接抽出溶液（メタノール）に分類されたメソッドをテストしまし.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H6648
流入 (inFlux v7 ソーター)	BD Biosciences
U-13C-Glucose	ケンブリッジ同位体	40762-22-9 / GLC-018
U-13C,15N2-グルタミン	ケンブリッジ同位体	CNLM-1275-H-0.1
メタノール (JTベーカー)、HPLCグレード	VWR	BAKR8402.2500
ウルトラフリー-MC-VV遠心フィルター。デュラポアPVDF 0.1 & マイクロ;m	Millipore	UFC30VV00
Ultimate 3,000 UHPLC	サーモフィッシャー
Q-Exactive Orbitrap 質量分析計	サーモフィッシャー
Merk-Sequant ZIC HILIC カラム (150 mm x 4.6 mm、5 µm)	Merck KGaA	1.50444.0001
Merk-Sequant ZIC HILIC ガードカラム (20 mm x 2.1 mm)	Merck KGaA
Acetonitrile Optima LC-MS、琥珀色ガラス	Fisher Scientific	A955-212
Milli-Q 水	Millipore		Milli-Q グラジエントシステムで製造
Myrsyra 99.5% Optima (ギ酸)	Fisher Scientific	11423423
X100 スクリューバイアル 1.5 ml、8-425 32x11.6 mm、琥珀色、100 ユニット	サーモフィッシャー科学	10560053
X100 ロック Skruv Vitt PTFE パッキン 8-425 (スクリューキャップ)	サーモフィッシャー	12458636
ProteoMass LTQ/FT-ハイブリッド ESI 位置モード Cal Mix	Sigma-Aldrich	MSCAL5	キャリブレーションキット
SNAKESKIN 10K MWCO	サーモフィッシャーサイエンティフィ	88245
Mathematica v.10	Wolframの研究