安定同位体のトレースを使用した複雑な細胞のコミュニティのソートされた亜集団で代謝を測定する方法

サマリー

この記事では、安定同位体追跡、特定の細胞タイプを分離するための細胞選別、および質量分析の組み合わせを使用して、複数の細胞タイプの複雑なコミュニティにおける細胞代謝を研究する方法について説明します。

要約

哺乳類の細胞タイプは特殊な代謝を示し、さまざまな共存する細胞タイプが代謝協力に従事しているという十分な証拠があります。さらに、単一の細胞型の培養物であっても、休止細胞や循環細胞など、異なる代謝状態の細胞を含んでいてもよい。このような亜集団の代謝活性を測定する方法は、細胞代謝を理解するための貴重なツールです。複雑な細胞集団は、セルソーターを用いて分離するのが最も一般的であり、この方法で単離された亜集団はメタボロミクス法で解析することができます。しかし、このアプローチの問題点は、細胞選別手順が細胞にストレスを与え、細胞の代謝を歪める可能性があることです。 >jove_content<これらの問題を克服するために、安定同位体標識栄養素で培養された細胞からの代謝物の質量同位体分布(MID)は、絶対代謝物濃度よりも安定している可能性が高いと推論しました。なぜなら、MIDはより長い時間スケールで形成され、細胞選別条件への短期間の曝露による影響が少ないはずだからです。ここでは、この原理に基づいて、セルソーティングと液体クロマトグラフィー高分解能質量分析(LC-HRMS)を組み合わせた方法について説明します。この手順では、3種類のサンプルを分析します:(1)複雑な集団から直接得られた代謝物抽出物。(2)特定の集団をゲートせずにセルソーター装置を通過した「模擬選別」細胞の抽出物;(3)実際にソートされた母集団の抽出。模擬ソーティングされた細胞は、直接抽出と比較され、MIDが実際に細胞ソーティング手順自体によって変更されていないことを確認してから、実際のソーティングされた集団を分析します。細胞周期の位相に従って選別されたHeLa細胞の結果の例を示し、ヌクレオチド代謝の変化を明らかにします。

概要

高等生物は、より複雑な機能をもたらすために協力異なる細胞型の複雑なコミュニティを含みます。例えば、腫瘍は、癌細胞だけでなく、線維芽細胞、血管を構成する細胞だけでなく、を含み、多くの場合、免疫細胞は^、1浸潤します;血液は、免疫細胞サブタイプ²の数十の複雑な混合物が含まれています。さらには培養細胞株は、乳癌細胞³の管腔および基底サブタイプなどの複数の亜集団、から構成されてもよいです。また、共存する異なる細胞型は、代謝、「コラボレーション」を示すことができます。例えば、脳内で、アストロサイトは、この基板^4を酸化ニューロンへのその後「摂食」である乳酸にグルコースを変換するために考えられています。 Tリンパ球は、システイン⁵の供給源として、隣接する樹状細胞に依存して、いくつかの状況です。そして癌細胞はASSOと協力することができます腫瘍⁶でciated線維芽細胞。このようなシステムの代謝挙動を理解するために、存在する種々の細胞型の代謝活動を分離して測定することが不可欠です。

はるか細胞型を分離するために最も広く使用される方法は、蛍光活性化細胞選別です。この方法は広く適用可能であり、目的の細胞型または状態は、蛍光抗体、操作された蛍光タンパク質の発現、又は他の染料を使用して、「標識された」ことができることを条件とします。 1つのオプションは、次にセルソーター、得られた再培養個々の細胞型、及び貫通最初は別個の細胞タイプは、これらの培養物⁷の代謝試験を行うことです。細胞型または表現型は、培養条件で安定であり、そのような細胞周期状態を、また、共培養における代謝協力として過渡的な挙動を捕捉することができない場合は、これは実現可能です。このような場合のために、代謝がそうで直接測定されなければなりませんRTED細胞。セルは手順をソートするので、これは困難である彼らの新陳代謝^8を歪めることがストレスに細胞を施し、そして我々はこのアプローチ^9、10を取るだけ少数の研究を認識しています。特に、我々は絶対的な代謝産物の存在量の測定は、もはや信頼性があるように、アミノ酸等の主要な代謝産物は、細胞ソーティングバッファに保持した細胞から漏れないことを見出した^11（ソートされた画分の間の相対的な比較は依然として価値があるかもしれません）。

これらの問題を回避するために、我々は、ソートする前に、安定同位体で細胞を標識し、細胞代謝産物ではなく、代謝物の存在量でのMIDに焦点を当てます。 MIDは長い時間スケール上に形成されているので、それらは以下のソート条件に短期暴露の影響を受けなければなりません。我々は、DAを提供するのに十分な感度でフルスキャンの高分解能質量分析を使用してのMIDを定量化セルソーティング時間の約30〜60分を必要とする50万選別した細胞から始まる代謝物の何百も、上のta。培養皿から直接制御（細胞は、任意の特定の集団をゲーティングすることなく、セルソーター器を通過した）および代謝物の抽出を「モックがソート」との比較は観察のMIDは、元の培養中のものの代表であることを保証するために行われます。安定同位体トレーサーの選択に応じて、様々な代謝経路は、この方法で研究することができます。

プロトコル

1.代謝物の抽出

1. 皿からの抽出
   1. 安定同位体標識された培養培地+透析サプリメント（血清または他の成長サプリメント）で三連で6ウェルプレートで培養細胞は、細胞が75％コンフルエントになるまで。
      注：U- ¹³ C-グルコース40％を含むRPMI中で48時間と70％U- ^{13 C、15} N2-グルタミンおよび5％透析FBS（ウシ胎児血清）のためにここでは、培養HeLa細胞。透析FBSは、標識されたメディアを汚染する可能性がある低分子量代謝物を取り除くために使用されます。実際の実験の前に透析したサプリメントで細胞を培養する培地で細胞を正常に増殖していることを確認することをお勧めします。サプリメントは、ヘビ肌透析チューブを用いて、0.15 M NaCl溶液で一晩透析します。
   2. 抽出廃棄培地の日に、500μLの冷HBSSで二回、ウェルを洗浄し、それを捨てます。
      注：ここでは40％を含むHBSSを使用U-13 C-グルコースは培地もあるからです。
   3. 追加600μLの100％メタノールをドライアイス上で予備冷却しました。
   4. ドライアイスに皿を転送し、セルスクレーパーで細胞材料を除去します。
   5. 注意深く質量分析まで-80℃でマイクロ遠心チューブとストアに細胞抽出物をピペット。
2. モック選別細胞の抽出
   1. 安定同位体標識された培養培地+透析サプリメントで三重100 mmディッシュで培養細胞。
      注：100ミリメートル皿で48時間ここで、培養HeLa細胞の細胞の数が多い（〜4×10 ^6）を 50万選別された細胞を得るために必要とされるからです。 HeLa細胞抽出物のこの数は、代謝物の良好な測定を得るために必要でした。培地は、40％U- ¹³ Cグルコース、70％U- ^{13 C、15} N 2グルタミン及び5％透析FBSを含むRPMIを用いました。
   2. 抽出、廃棄培地の日に、Wウェルをすすぎますi番目の1.5mLの温かいHBSSし、それを捨てます。
   3. 37℃で4分間、1.5 mLのトリプシン/ EDTAを加えることによって、細胞を切り離します。 4°Cまたは氷で次の手順を実行します。
   4. 3 mLの氷冷HBSS（ハンクス液）+透析サプリメントを追加することにより、トリプシンを無効にします。
   5. 3分間750×gで15 mLチューブと遠心分離機で細胞を収集します。
   6. 濃度1〜2×10 ⁶細胞/ mLのHBSS +透析サプリメント+ 1mMのEDTAでペレットを再懸濁し、単一細胞を得るために40μmのセルストレーナーを通過し、5 mLのチューブに移します。
   7. ソートのみ一重のためのセルソーター・ゲーティングを介して細胞、および4℃で3分間、750×gで遠心分離選別細胞。
      楽器圧力27 psiのと速度千のイベント/秒でここソートHeLa細胞、および100μmのノズルを使用します。注。 HeLa細胞は、それらが可能な限り無傷のペレットを得るために遅い事象率と大ノズルでソートされるべき大です。寒さのブロック内のセルを保つthroughou代謝を減少させるために選別T。手順ソートの完全な説明は、以前¹²に記載されています。
   8. 上清を捨て、メタノールを加える前に、均一なペレットを得るために、50μLの氷冷のdH ₂ Oにペレットを再懸濁。直接ペレットへの冷メタノールの添加は、再懸濁しにくい固体ペレットを形成しています。
   9. ドライアイスに保た540μLのメタノールを添加することにより、代謝産物を抽出し、液体クロマトグラフィーするまで-80℃で抽出を維持 - 高分解能質量分析（LC-HRMS）分析。
3. 細胞周期選別された細胞の抽出
   1. 培養培地+透析サプリメントで三重100 mmディッシュで培養細胞。
      注：GemininのFucciグリーンG1（負）とSG2M（陽性）細胞の選別を可能にします（MAG1-hGem）プローブ^13を含む。ここで、培養したHeLa細胞。細胞は用の安定同位体のトレース培地で培養することができます必要に応じて長いですよ。ここでは、我々は40％U- ¹³ C-グルコースおよび70％U- ¹³ C、ソート開始する前に^、15 N2-グルタミン2時間を含むRPMIに切り替えた、標識されていない培地で46時間のためにそれらを培養しています。これは、短いパルス標識を必要とする細胞周期段階を研究することができるようにするために行きました。
   2. 抽出、廃棄培地の日に、1.5 mLの温かいHBSSでウェルを洗浄し、それを捨てます。
   3. 37℃で4分間、1.5 mLのトリプシン/ EDTAを加えることによって、細胞を切り離します。 4°Cまたは氷で次の手順を実行します。
   4. 3 mLの氷冷HBSS +透析サプリメントを追加することにより、トリプシンを無効にします。
   5. 3分間750×gで15 mLチューブと遠心分離機で細胞を収集します。
   6. 濃度1〜2×10 ⁶細胞/ mLのHBSS +透析サプリメント+ 1mMのEDTAでペレットを再懸濁し、単一細胞を得るために40μmのセルストレーナーを通過し、5 mLのチューブに移します。
   7. セルソーターグラムをソート細胞その後、破片やダブレットをating関心の細胞マーカーのためのゲーティング、および遠心選別細胞を4℃で3分間、750×gで。
      楽器圧力27 psiのと速度千のイベント/秒でここソートHeLa細胞、および100μmのノズルを使用します。注。代謝率を減少させるためにソートを通して冷たいブロック内のセルを保管してください。
   8. 上清を捨て、メタノールを加える前に、均一なペレットを得るために、50μLの氷冷のdH ₂ Oにペレットを再懸濁。直接ペレットへの冷メタノールの添加は、再懸濁しにくい固体ペレットを形成しています。
   9. ドライアイスに保た540μLのメタノールを加えて代謝物を抽出し、LC-HRMS分析まで-80℃で抽出物を保持します。

2.質量分析

注：ここでは、LC-HRMSシステム上の細胞抽出物を分析するためのプロトコルについて説明します。細胞抽出物の分析のための任意のメタボロミクスの方法を用いることができます。フルスキャン分析は、代謝物の広い範囲を検出するのに有用である可能性があります。

1. 質量分析基準較正ミックスを使用して、機器のキャリブレーションを行います。
2. 15秒間30分間ボルテックス氷上で細胞抽出物を解凍します。
3. 4℃で13,000×gで10分間スピンフィルターや遠心分離機に細胞抽出物の100μLを転送します。
4. LC-HRMSシステムにろ液の12.5μLを注入します。
5. 0.1％のギ酸の勾配溶出を使用して、ZIC-HILICガードカラム（2.1ミリメートル×20ミリメートル）を装着した双性イオン性親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ZIC-HILIC）カラム（150ミリメートル×4.6ミリメートル、5μmの粒子サイズ）を使用して、個別の代謝物水中での酸（溶媒A）およびアセトニトリル（溶媒B）。溶剤Aの20％で勾配溶出を開始し、17分で80％まで増加。それぞれ、4 400μL分の流速で分^-1および23℃と4℃のカラム温度とサンプルトレイ中にこの割合を維持します。
6. 私を使用してください代謝物の検出、イオン化源として正と負の両方のモードで加熱エレクトロスプレー（H-ESI II）、70,000半値幅（FWHM）の質量分解能でフルスキャン取得モードのためのクロマトグラフィー分離に結合nstrument（ M / Z 200）。
7. 45と10のauの流量（任意単位）と設定し、350℃での気化温度とポジティブモードと-3.5 kVの4 kVのでエレクトロスプレー電圧でシースガスおよび補助ガスを窒素（純度> 99.995パーセント）を使用しますネガティブモードインチ

3.データ解析

1. 規格が利用可能であり、試料中の良質なピークを示しているために代謝産物の数を選択します。良質のピークは、高い信号対雑音比を有しています。ピークの品質を検証し、偽の同位体を含まないことを確認することが重要です。形状および/または保持時間が異なる同位体ピークはおそらくfalseです。
2. 同位体標識されたサンプルについて（質量アイソトポマーを計算MI）すべてのMIの総ピーク面積と各MIのピーク面積を分割することによって画分。
3. それぞれ^、13 Cおよび¹⁵ Nの濃縮をラベルされた炭素/窒素画分を計算します
   
   ここで、nは、代謝物中の炭素の総数（または窒素、それぞれ）は、ミックスは、xのMI分率です。
   注：すべての計算は、プログラミング言語を用いて行うことができます。

結果

一例として、ここでは、細胞周期の段階に応じてソートされたHeLa細胞の代謝を調べる実験を記載します。炭素と窒素の両方に中央代謝物の広い範囲を標識するために、我々はU- ¹³ C-グルコースおよびトレーサーとしてU- ^{13 C、15} N-グルタミンを使用して48時間、細胞を培養しました。同位体の中間レベルはより多様MIパターン^14を生成する傾向があるとして、検証実験のための豊富なのMIDを得るために、我々はここでは、40％U- ¹³ C-グルコースおよび70％U- ^{13 C、15} N2グルタミンの混合物を選びました。

検証実験のために我々は85の代謝産物の標的に分析を行いました。品質が低品質のLC-MSピークを削除する手順を制御した後、我々は66モック選別された細胞（96％）に...

ディスカッション

我々の方法は、細胞代謝産物中のMIDは、細胞の代謝活性の「歴史」を反映している原理に基づいています。これは、細胞の複雑なコミュニティで生じたような従来の細胞選別手順と、細胞の亜集団における代謝活性を調査することができます。これとは対照的に、代謝物のピーク面積は、ソートされた細胞と培養皿¹¹から直接抽出の抽出物との間で著しく異なります。部分的に異なる化学組成が質量分析法、いわゆる「マトリックス効果」の信号応答を変化させるためであるが、我々はまた、細胞をバッファ¹¹に保持され、一方のアミノ酸は、選別中の細胞から失われることを示しています。これは、ソートの際に、細胞の代謝状態や活動を変更することができるが、これは我々の方法のために、それ自体には無関係である：MIDの直接抽出で観察されたものにかなり近いあることは、データがVALIのままオリジナルの、複雑な文化の各亜集団の代謝状態のd測定。

私たちは、最初に細胞が急速に代謝をクエンチし、直接抽出溶液（メタノール）に分類されたメソッドをテストしまし...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
HBSS	Sigma	H6648
流入 (inFlux v7 ソーター)	BD Biosciences
U-13C-Glucose	ケンブリッジ同位体	40762-22-9 / GLC-018
U-13C,15N2-グルタミン	ケンブリッジ同位体	CNLM-1275-H-0.1
メタノール (JTベーカー)、HPLCグレード	VWR	BAKR8402.2500
ウルトラフリー-MC-VV遠心フィルター。デュラポアPVDF 0.1 & マイクロ;m	Millipore	UFC30VV00
Ultimate 3,000 UHPLC	サーモフィッシャー
Q-Exactive Orbitrap 質量分析計	サーモフィッシャー
Merk-Sequant ZIC HILIC カラム (150 mm x 4.6 mm、5 µm)	Merck KGaA	1.50444.0001
Merk-Sequant ZIC HILIC ガードカラム (20 mm x 2.1 mm)	Merck KGaA
Acetonitrile Optima LC-MS、琥珀色ガラス	Fisher Scientific	A955-212
Milli-Q 水	Millipore		Milli-Q グラジエントシステムで製造
Myrsyra 99.5% Optima (ギ酸)	Fisher Scientific	11423423
X100 スクリューバイアル 1.5 ml、8-425 32x11.6 mm、琥珀色、100 ユニット	サーモフィッシャー科学	10560053
X100 ロック Skruv Vitt PTFE パッキン 8-425 (スクリューキャップ)	サーモフィッシャー	12458636
ProteoMass LTQ/FT-ハイブリッド ESI 位置モード Cal Mix	Sigma-Aldrich	MSCAL5	キャリブレーションキット
SNAKESKIN 10K MWCO	サーモフィッシャーサイエンティフィ	88245
Mathematica v.10	Wolframの研究