ここでは、タンパク質-DNA相互作用の近塩基対分解能を達成するためのプロトコルを提示します。これは、クロマチン免疫沈降(ChIP-exo)によって選択的に濃縮されたDNA断片のエキソヌクレアーゼ処理と、それに続くハイスループットシーケンシングによって得られます。
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この記事について
サマリー
要約
クロマチン免疫沈降（チップ）エピジェネティクスと特定のタンパク質-DNA相互作用を分離する遺伝子調節の分野で不可欠なツールです。ハイスループットシークエンシング（チップ配列）に結合されたチップは、一般に、クロマチンと相互作用するタンパク質のゲノム位置を決定するために使用されます。しかしチップ-配列は数百塩基対の比較的低いマッピング分解能および高いバックグラウンドシグナルによって妨げられます。 ChIP-エキソ方法は、実質的に解像度とノイズの両方を改善するのChIP-seqのの洗練されたバージョンです。 ChIP-エキソ方法論の重要な違いは、効果的にタンパク質-DNA架橋部位の左右の5 'DNAボーダーフットプリントするためのライブラリ作成ワークフローのラムダエキソヌクレアーゼ消化の組み込みです。 ChIPのエキソライブラリーは、高スループット配列決定に供されます。得られたデータは、機能的な組織O中にユニークな超高解像度の洞察を提供するために活用することができゲノムF。ここで、我々は、哺乳動物系と次世代シーケンシング・バイ・合成プラットフォーム向けに最適化し、合理化しているのChIP-エキソ方法について説明します。
概要
クロマチン免疫沈降（チップ）が選択的に生きている細胞内の指定されたタンパク質と相互作用するDNA断片を濃縮することにより、遺伝子調節のメカニズムを研究するための強力な方法です。技術は、ハイスループットシークエンシング（チップ配列番号1）をオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（チップオンチップ）のハイブリダイゼーションを単一遺伝子座（標準のChIP-定量PCR）の検出から、改善、チップ富化DNAフラグメントの検出方法が発展してきました。 ChIP-seqが幅広い応用、クロマチン異質と非特異的なDNA相互作用を見たが、偽陽性と不正確なマッピングにつながるデータ品質を妨げてきました。これらの制限を回避するために、博士はフランク・ピューは、チップエキソ方法2を開発しました。 ChIPのエキソの顕著な特徴は、それが効果的に位置転写因子結合をフットプリンティング、エキソヌクレアーゼ5 'から3'を組み込むことです。その結果、チップエキソ方法は、より高い解像度、detectioの大きなダイナミックレンジを達成しますnおよびより低いバックグラウンドノイズ。
ChIP-エキソは、より技術的に困難なのChIP-seqのよりマスターにではあるが研究は、多様な生物学的システム3-8を使用して、ユニークな超高解像度の洞察を得ることを目指しとして、それが広く採用されています。実際に、チップエキソ正常細菌....
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プロトコル
注：ダブル蒸留H 2 Oまたは分子グレード同等物は、すべてのバッファとの反応ミックスをお勧めします。
0日目：材料の調製および細胞収穫
1.バッファの準備
- 3（ 表1 - - 3）溶解バッファ1を準備し、使用直前に、各バッファの50ミリリットルに100μlの完全プロテアーゼ阻害剤の株式（CPI）を追加します。分子グレードのH 2 Oを1ミリリットル中に1錠を溶解させることによって、CPIの株式を準備します
- （ - 7表4）内蔵バッファを準備します。ブロッキングとRIPAバッファー50mlに100μlのCPIの株式を追加します。トリスおよびChIPの溶出バッファにCPIを追加しないでください。
アダプターオリゴヌクレオチドの2アニーリング
注：特定のオリゴヌクレオチド配列は、追加情報セクションに見出すことができます。
- アダプタアニーリングミックス（ - 9表8）を準備します。ミックスする渦と簡単に内容物を収集するために、チューブをスピン。....
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結果
次の図は、ここで紹介するのChIP-エキソプロトコルから代表的な結果を示しています。いくつかの酵素工程と、伝統的なのChIP-seqの方法論とは対照的に、ChIPのエキソは11順次依存酵素反応（ 図1）が必要です。このように、注意が各反応成分が各反応マスターミックスに添加されることを確実にするために各ステップで注意しなければなりません。私たちは、自動的に反応マスターミックスの計算を実行するために、反応テーブルに基づいて、定型のスプレッドシートを生成する結果の表を印刷し、それがマスターミックスに追加された後、次に各項目をオフにチェックをお勧めします。
私たちは高品質の配列決定の結果（ 図2）を確保するためのプロトコル全体の品質管理対策の数を採用しています。各チップの反応は、3つの基本的な構成要素が含まれています：1）intereの細胞からクロマチンの抽出物を超音波処理しましたST目的のタ.......
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ディスカッション
我々は、クロマチンが近い塩基対の解像度で公平な、ゲノムワイドな方法で相互作用タンパク質の正確な結合位置を決定するために、機能ゲノムプロトコルを提示します。免疫沈降物は、磁性樹脂のままに近い塩基対のマッピング分解能を達成するための最も重要なステップは、チップに富むDNAのエキソヌクレアーゼ処理です。表向きは、タンパク質複合体は、潜在的に任意のサブユニット（ 例えば、クロマチンリモデリング複合体またはヌクレオソームコア粒子）のin vivoフットプリントをブロックすることができます。ホルムアルデヒドは、非効率的な架橋剤であるので、以前に10、報告されているように、それは、複雑な複数のサブユニットは、同じ遺伝子座で同じ細胞中のDNAと相互に架橋するであろうことがますますにくくなります。したがって、そのようなヌクレオソームの個々のヒストンサブユニットなどのタンパク質複合体の個々のサブユニットのインビボフットプリンティング、チップエキソで可能です。
tは ">のChIP-エキソの最も顕著な利点は、その近くに塩基対の解像.......アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
有益な議論をしてくださったベンターズ研究室と分子生理学・生物物理学部門のメンバーに感謝します。私が彼の研究室でポスドク研究員だった間、彼の指導、メンタリング、そしてChIP-exoのニュアンスに関する多くの洞察に満ちた議論をしてくれたFrank Pugh氏に感謝します。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 37% ホルムアルデヒド、メタノールフリー、10 x 10 ml アンプル | ThermoFisher Scientific | 28908 | セクション 3 |
| コンプリート プロテアーゼ阻害剤カクテル (CPI) | Roche Life Science | 11873580001 | セクション 4、8 |
| Bioruptor sonicator | Diagenode | UCD200 | セクション 5 |
| 15 ml ポリスチレンチューブ | BD Falcon | 352095 | セクション 5 |
| マグセファロース プロテイン G Xtra ビーズ | GE ヘルスケア | 28-9670-66 | セクション |
| 6 DynaMag-1.5 ml サイド マグネティック ラック | Invitrogen | 12321D | セクション 6-17, 22 |
| ミニチューブ ローテーター | フィッシャー サイエンティフィック | 05-450-127 | セクション 7, 22 |
| T4 DNA ポリメラーゼ | ニューイングランド バイオラボ | M0203 | セクション 9 |
| DNA ポリメラーゼ I, Klenow | ニューイングランド バイオラボ | M0210 | セクション 9 |
| 10x NEBuffer 2 (10x 反応バッファー 2) | ニューイングランド バイオラボ | B7002 | セクション 9-11、13、15、20 |
| サーモミキサー C | エッペンドルフ | 5382 | セクション 9-16 |
| ATP | ロシュ ライフサイエンス | 010419979001 | セクション 9、11、13 |
| dNTPs | ニューイングランド バイオラボ | N0447 | セクション 9、12、19、23 |
| T4 ポリヌクレオチドキナーゼ | ニューイングランドバイオラボ | M0201 | セクション9、13 |
| dATP | ニューイングランドバイオラボ | N0440 | セクション10、20 |
| ノウ3'-5'エクソマイナス | ニューイングランドバイオラボ | M0212 | セクション10、20 |
| T4 DNAリガーゼ | ニューイングランドバイオラボ | M0202 | 11、21 |
| Φ-29 DNAポリメラーゼ | ニューイングランドバイオラボ | M0269 | セクション12、19 |
| 10x&ファイ-29バッファー | ニューイングランドバイオラボ | B0269 | 12、19 |
| ダエキソヌクレアーゼ | ニューイングランドバイオラボM0262 | 14 | |
| 10xラムダバッファ | ニューイングランドバイオラボ | B0262 | セクション14 |
| RecJf エキソヌクレアーゼ | ニューイングランド バイオラボ | M0264 | セクション 15 |
| プロテイナーゼ K | ロシュ ライフサイエンス | 03115828001 | セクション 16 |
| グリコーゲン | ロシュ ライフサイエンス | 010901393001 | セクション 18 |
| 10x T4 リガーゼ バッファー | ニューイングランド バイオラボ | B0202 | セクション 21 |
| AMPure XP (クリーンアップ) ビーズ | ベックマン・コール | ターA63881 | セクション22Q5 |
| ホットスタートDNAポリメラーゼ | New England BioLabs | M0493 | Section 23 |
| 5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) | New England BioLabs | B9027 | Section 23 |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Section 25 |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Section 26 |
| Optical Clear Qubit tubes | Invitrogen | Q32856 | Section 26 |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Section 26 |
参考文献
- Venters, B. J., Pugh, B. F. How eukaryotic genes are transcribed. Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147, 1408-1419 (20....
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