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方法論記事

キャピラリーフィーダーアッセイにおいて食物摂取を測定します

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DOI:

10.3791/55024

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2017年3月17日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Zoology, Albertus-Magnus University of Cologne, 2Department of Veterinary Biomedical Sciences, Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan

この記事について

サマリー

CApillary FEeder (CAFE) assayは、食物摂取の根底にあるメカニズムを調査するためのシンプルで予算にやさしい、信頼性の高い方法です。汎用性の高い遺伝子モデル生物であるショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)と併用することで、食物摂取の調節メカニズムについて新たな知見を得るための強力な手段となります。

要約

ほとんどの動物にとって、摂食は生存を確保するために不可欠な行動であり、それは発達、移動、健康、繁殖に影響を与えます。したがって、適切な種類と量の食物を摂取することは、生活の質に大きな影響を与えます。摂食行動に関する研究は、実際の摂食を確保する根本的なプロセスに焦点を当て、内部エネルギー、恒常性、意思決定のニューロン基盤を調節する要因の役割を解明します。モデル生物であるショウジョウバエ・メラノガスターは、単一のニューロンを標識および操作するための遺伝的に追跡可能な多種多様なツールを備えており、ニューロンネットワークのマッピングと、食物摂取の調節に関与する分子シグナル伝達カスケードの同定を可能にします。このレポートでは、キャピラリーFEederアッセイ(CAFE)を実証し、数時間から数日の範囲の期間でハエのグループで食物摂取量を測定する方法を示します。この使いやすいアッセイは、ハエが自由にアクセスして餌を食べることができる液体食品で満たされたガラス毛細血管で構成されています。アッセイでの食物消費量は、簡単な測定ツールを使用して正確に測定されます。ここでは、CAFEアッセイのセットアップから成功裏に実行されるまでの方法を段階的に説明し、制御された条件下でのハエのグループの食物摂取量を分析するための実用的な例を示します。読者は、アッセイの可能な制限についてガイドされ、D. melanogasterの他の摂食アッセイと比較した方法の長所と短所が評価されます。

概要

食べるが不可欠です。しかし、このような過食症、拒食症または課しを過食する一般的な傾向として、摂食障害の結果食物摂取量の規制緩和は、個人と社会1、2、3にかかります。本研究の目的は、食物摂取の調節機構を明らかにし、障害の形成を回避するための戦略を提供することにあります。哺乳類のモデル生物を用いて、多数の研究が障害4、5、6を食べに回路及び信号システムの役割の新たな洞察を提供してきました。それにもかかわらず、これらの疾患の根底にある神経細胞および分子基盤の我々の知識は、完成には程遠いまま。近年では、果実はフライキイロショウジョウバエは metabolisの規制に基本的なメカニズムの洞察を解明するための貴重なモデルシステムとなっていますM 7、8、9。 キイロショウジョウバエのためのキャピラリーフィーダー（CAFE）アッセイはクロバエ10、11にデティアーによって以前の仕事に触発され、2007年にシーモア・ベンザーのラボに設立されました。 CAFEアッセイは直接キイロショウジョウバエにおいて食物摂取を測定することが可能となります。この行動試験システムでは、ハエがバイアル内部に配置された段階的なガラスキャピラリー内に設けられた液体食品を食べます。毛管メニスカスの減少は蒸発し、食料消費を経て食品液の損失を示しています。ハエなしでバイアルによって蒸発速度を決定することは、食物摂取量の正確な定量化を可能にします。

CAFEアッセイは、 キイロショウジョウバエで摂食を測定するために使用されるいくつかの行動パラダイムの一つであり、研究者が、特定のために最も適切なものを選択する必要があります質問。特定のアッセイを使用するという決定は、次の点を考慮する必要があります提供食品の性質を。摂食状態;吸気口や栄養素の摂取と調査の食料消費や食品への応答の測定。

このレポートに記載されているようCAFEアッセイは、直立の給電条件で液体食料源の食物摂取量を、以下のに最適です。あるいは食物摂取量をバイアル中またはプレート上の着色された食物源のフライグループに対して測定することができます。ハエは通常、殺されたり麻酔給餌後と摂取色素の量は、分析法または染色された腹部の目視検査によって決定されています。ハエは、摂取後わずか30分で摂取された食物を排出し始め、したがって、この方法は、連続的なより長い摂食行動の解析12、13のために使用することは困難です。

これとは対照的にハエがするとき、吸収性色素そのまま保持されています放射性トレーサーでsが使用され、放射性同位体の消費は、シンチレーションカウンター14,15で採点されます。フライ消化器系による放射性標識の吸収は、長期的な食品摂取の測定が可能になりますが、ために非吸収と排泄トレーサー分子の消費量の過小評価につながる可能性があります。 キイロショウジョウバエの食物に対する応答を測定するための別のアプローチは、通常、食物摂取16で発生口先拡張応答（PER）です。このエレガントな方法は、食品の刺激に対する初期応答を測定するが、摂取量を記録しません。食物摂取は、動的に給電17,18の調節に重要である、いくつかの後の消化フィードバック信号を使用して、供給中に調整されます。いくつかの試みがPERアッセイで半自動化データ収集に近年なされています 19、20アップ。 PERは、電気パッドまたは電極の組み合わせによって検出され、コンピュータを介してカウントされます。放射性同位元素の取り込みとPERアッセイを組み合わせることにより、このアッセイは違い18の供給量を検出する低感度によって制限されることを明らかにしました。ハエは、ガラスキャピラリーを用いて手動で供給された手差しアッセイ（MAFE）21は 、最近単固定化されたハエの食物摂取量を測定するために開発されました。 MAFEアッセイは、採餌給電開始の干渉を排除し、秒の時間分解能を有し、PERおよび食物摂取の開始は、アッセイにおいて独立して監視することができます。しかし、摂食行動の特定の側面（ 例えば運動、モチベーション）に影響を与えるハエのどの固定化方法はまだ調査する必要があります。 ショウジョウバエ私の中で食物消費を測定するための異なるアッセイの優れた比較レビュー用lanogasterとデシュパンデとマルクスの報告を参照して、最も適切なものを見つけるの研究者を支援します 13、22。

CAFEアッセイは、上述の他のアッセイの欠点の一部を回避し、食物摂取の信頼できる測定を使用するシンプルさを兼ね備えました。ここで、CAFEアッセイの詳細な説明が提供され、我々は、蒸発を減少させるための簡単な設定の変更を示します。 2食品の選択アッセイ（短期・長期）とハエのショ糖の取り込みを含む代表的な結果が示されています。議論では、CAFEアッセイを実行するための別の方法で私たちの説明した方法を比較し、潜在的な限界を強調表示します。

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プロトコル

1. CAFEアッセイ

注：実験バイアル、特定の蓋とマイクロキャピラリ：アッセイは3つのコンポーネントで構成されています。カバー付きプラスチック箱は、準備されたバイアルを輸送するために、より効率的に湿度を制御するために使用されます。

  1. キイロショウジョウバエ培養プラスチックバイアル（オプション8センチメートル高さ3.3センチ直径）アッセイ用チューブとして使用します。
  2. Oリング（ 図1A、1B）を含む製造プレキシガラス蓋付きバイアルを密封します。負荷が軽くたたくことによって、または、空気の循環と水の供給を可能にし、スポンジ栓に穴を塞ぐ蓋の中央開口部（1.5センチ径）を通じて吹管、と飛びます。シックス小さい円錐状の開口部（0.4センチメートル上部直径、0.3センチメートル内径）は中央の穴を囲むと2のピペットチップフィット - 代わりに毛細血管を保持するために、20μLのボリュームを。 （蓋の技術的な詳細については、補足図を参照してください。）
    注：使用代わりに、私たちの原稿に使用されるカスタムメイドの蓋の毛細血管のための開口部を有するスポンジストッパー可能です。私達のカスタマイズされた蓋が落ちて毛細血管のリスクを最小限に準備されたバイアルの安全な取り扱いを可能にします。
  3. 液体食品を提示するために、1μLのマークを5μLのマイクロキャピラリーを使用しています。穴（赤い縁の付いた図1B）に先端を20μLピペットチップと挿入- 2の上部を切断することにより、蓋で円錐形の開口部で毛細血管を置きます。同じ開口部に20μLピペットチップ - 逃げるのハエを防ぐために、ノーカット2を挿入します。
  4. 安全に複数準備されたバイアルを処理するには、グリッドインレイ（ 図2A）とプラスチック製の箱に入れます。

ハエの調製

  1. 25℃、相対湿度60％、12時間/ 12時間の明暗サイクルで、標準的な食べ物にハエを保管してください。
  2. 、飼育条件を制御する35処女雌を導入するために、AN50 mLを含むプラスチック培養瓶（9.8センチメートル高さ4.8センチ、直径）にD各実験群のための15人の男性が食べ物を飛びます。ハエは、最初の3日間、卵を産むその後、生鮮食品バイアルに大人のハエを転送し、それらをさらに2日間卵を産むせることができます。この後、再び転送を繰り返します。さらに2日後に成虫を捨てます。
  3. 食物摂取は、フライサイズに依存しているように、2〜3日齢の大人がCO 2フライパッドを使用して飛ぶと1.5 mLのプラスチックチューブにそれらを収集し、標準で測定麻酔により100ハエ群の重量を求めます実験室規模。性別（ 表1）でソートされる少なくとも4つの独立したハエ群の湿重量を決定します。 mgのフライあたりμL食品の消費量を計算するために重みを使用しています。単一のハエは、実験ごとにフィード食物の量を決定し、供給することによって毛細血管の排出を避けるために、それに応じて食品が充填された毛細血管の数を調整するには、値を使用します。
    1. 3時間アッセイの使用のため20ハエや2充填した毛細血管。長期実験（> 3時間および9日まで）については、4満たさ毛細血管（信頼性の高い結果が記載された条件の下でより少ない8ハエで得ることができない）の供給に8ハエのグループを使用します。
  4. CO 2の暴露下重量を測定した後グループに別々のハエ（8または20ハエ）。 CO 2鎮静から48時間、実験前に、リカバリを可能にするために（15 mLの標準食品を含む）新しい食品バイアルにグループを転送します。 CAFEアッセイのために4〜6日齢のハエを使用してください。
  5. 非飢えた野生型のハエは、わずか3時間の供給実験のための19、21、事前に飢えたハエを養うように。食料消費が数日間にわたって監視されているときに断食は必要ありません。断食のために、転送が優しく〜0.5 mLののddHで湿らせた唯一の45ミリメートルの直径折り畳んだろ紙を含むバイアルにそれらをタップして、試験前に16〜20時間を飛びます2 O（二重蒸留水）、およびプラグインCAFEアッセイ蓋との緊密な。

液体食品の調製

  1. 102.6グラムのスクロースを充填することによって3 M（10％、w / v）のスクロースストック溶液を準備します（C 12 H 22 O 11）を100mLのddH 2 Oピペット3μL、33μL、333μL、3.3 mLおよび6.6 mLまで15mLのプラスチックチューブ中にストック溶液。 （：;：インディゴカルミン[E132]青用のコチニール[E124]赤のため）で処理し、得られた濃度は0.001、0.01、0.1、1、および2 MスクロースあるのddH 2 Oで10mLに記入食品の色の2 mLを加え。
    注：食用色素がより容易にメニスカスを可視化することができます。しかし、染料は、食物摂取に影響を与える可能性があります。色素に食用色素を分配または実験とグループの間に食品試料への染料の使用量を無作為化によるバイアスを避けるために。
  2. 15 mLのプラスチックチューブで3 Mショ糖ストック溶液のアルコール嗜好ピペット333μLをテストします。100％のEtOH（エタノール）の1.5 mLの（2.3 ml）を加え、15％（0.25ミリモル）及び23％（0.39 mM）の作業溶液をもたらすことを10mLまでのddH 2 Oを追加します。
  3. -20℃でストック溶液を維持し、4℃でのソリューションの作業。 1週間以内に使用します。
  4. 毛管力により、着色された食品の溶液と同時に10キャピラリを埋めます。ショ糖液（溶液に対して45°の角度で毛細血管を保持）に毛細血管の端を挿入します。液体が毛細管のトップ（5μL）マークに達した場合に停止し、ティッシュペーパーで外側に、内部に余分な溶液を除去します。

4.アセンブリおよび毛細血管フィーダーアッセイを行います

  1. 断食が必要とされていない場合は、タップすることで、またはブローパイプによってアッセイの実験的なハエを転送します。蒸発を定量化するためにハエずに3つの制御バイアルを含めるようにしていることを確認します。
  2. 外openinの1を閉じている - （20μLのボリューム2）慎重にピペットチップを削除GSと、第1充填されたガラスキャピラリー、ボトムエンドを挿入します。戻って次のキャピラリーにピペットの先端を配置することにより、キャピラリを固定します。いくつかの食品ソリューションがテストされている場合は、それに応じてこの手順を繰り返します。
  3. 置き、毛細管は、食料源が異なる高さに配置された場合に発生する可能性バイアスを避けるために、同じレベルのすべてのバイアルの中で終わる（3 - ふた〜4センチ）。誤っ濾紙または食物源の異なる粘度をタッチして漏れる毛細管を防止するために、濾紙の距離を保ちます。
  4. マーカーペン（マーク始まる）を使用して着色液の上端部にラベルを付けます。別の毛細血管が識別することができることを確認するには、色やストライプのコードを使用して個別にラベルを付けます。
  5. グリッドインレイとプラスチックの箱の内側に複数用意CAFEアッセイを置き、実験室条件下で、または、温度、光-及び湿度制御CLIMに安全な位置に（ 図2A）ボックスを転送実験期間（ 例えば、3 Hまたは日間）：室（25℃、相対湿度60％、12時間/ 12時間の明暗サイクルパラメータ）を食べました。
  6. アッセイは、数日間にわたって行われた場合に底ろ紙が乾燥したように、アッセイの内部の湿度を一定に保つためにスポンジ栓（100μL） を経由して 24時間毎に新鮮な水を適用します。湿度デバイスとして30ミリリットルのddH 2 Oを充填した4つの別々のバイアル（8センチ、高さ3.3センチ直径）を使用し、プラスチック製のボックス内のCAFEアッセイの隣に配置します。実験（ 図2A）の間、湿度制御された環境を作成するために、プラスチック製のボックスのカバーを使用してください。
    注：より広範な変動は実験室条件下で発生します。しかし、室温（ 例えば 、教室内）でCAFEアッセイを実行することが可能です。加湿装置（プラスチックの箱のための水のバイアルとカバーを埋め濡れたスポンジの栓を伴うまたは伴わないろ紙、、）を使用することは非常に蒸発を減少することが奨励されています（ 図2B）。
  7. 長期間の実験ごとに24時間、新鮮に満たされたものと毛細血管を交換してください。各24時間間隔の前に死んだハエをメモして、次の期間にフライあたりの消費量を計算するために生きたハエの数を使用します。 （5.1を参照）メニスカスの低下を測定した後、古い毛細血管を捨てます。
    注：私たちはほとんど任意の死んだハエを見ない3時間の実験中。 3死んだハエ - 4日の研究の間、私たちは通常1を見つけます。
  8. CAFEアッセイは直立位置にある間に、アッセイの終わりに、またはキャピラリーを交換する前に、マーカーペンでキャピラリー（マーク端 ）の下メニスカスをマーク。マークの端が最初のマーク（マークが始まる ）以下でない場合はデータを破棄します。これは、メニスカスを変更する可能性があるため、蓋を削除しないでください。
  9. 慎重に分析から毛細血管を削除し、データ収集のためにそれらを格納します。 discarない場合は、キャピラリー内部の液体が下端に達しているかどうかを確認Dデータ、食品はハエにアクセスできなかったとして。グループとして1バイアル当たりすべての毛細血管を収集します。逃げるのハエを防ぐために、すべての開口部に切断されていないピペットチップを挿入します。セットアップを解体し、更なる使用のために室温で石鹸バス、一晩乾燥にバイアル、蓋とスポンジ栓を洗います。
    注：ハエは、さらに分析した後に分析することができます。目によって、または解剖顕微鏡下で食品の摂取量を確認してください。
  10. 少なくとも三つの異なる日に同じ遺伝子型を有する繰り返し実験。

5.データの収集と分析

  1. キャリパーや定規を使用して、キャピラリー上のマークの始まりとマークの端部との間の距離を測定します。スプレッドシートに直接データを転送するには、デジタルキャリパー（ 図1E）接続されたUSB（ユニバーサル・シリアル・バス）を使用します。測定後の毛細血管を捨てます。
  2. 毛管サイズのアカウントは、食物摂取または蒸発を計算します。例えば、キャップを考えますそのillary 73ミリメートルの長さであり、食品溶液5μLが含まれています。メニスカスで14.6ミリメートルの減少は、1μL液の取り込みを反映しています。以下の式を使用して食物摂取を計算します。
    食品摂取量（μL）=測定距離（mm）の/ 14.6ミリメートル
  3. 食物摂取に対する蒸発の影響を排除するために、ハエのない3（最低でも）制御バイアル中の蒸発を意味計算します。ハエによって食料消費のために得られた値から、この平均値を減算します。
  4. フライあたりの総消費量を決定するには、次の式を使用します。
    食品の消費量（μL）=（食品摂取[μL] - 蒸発損失[μL]）/バイアル中のハエの総数。長期的な実験のために、24時間間隔の開始前に、生きたハエの数を使用します。
  5. そのような男性と女性のハエの間のような体の大きさの違いを考慮して、体重（μL食品/ mgでハエ）に摂餌量を正規化します。
  6. データ分析のための統計ソフトウェアを使用してください。ノルムのための味方分散データは、2フライ群間の差を決定し、二つ以上のグループのための事後テューキークレーマー検定でANOVA（分散分析）を使用するスチューデントのt -testsを使用しています。選択肢の状況では、ノンパラメトリック1標本符号検定を用いてランダムに選択との違いを分析します。

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結果

ワット1118の遺伝子型のハエは、アッセイが行われる方法を示すために使用されています。 W 1118変異体は、一般的にトランスジェニック系統を生成し、導入遺伝子の遺伝的背景が白の遺伝子でマーク制御するために使用されます。通常、行動実験のために、すべてのトランスジェニック系統は、実験対照として使用されているのと同じワット1118株、に5世代戻し交配されています。我々は、さまざまな実験を示しています。私たちの修正されたセットアップ、短期的な食品の選択実験、長期的な食物摂取実験、および異なるショ糖の希釈での実験の蒸発損失の比較を。

蒸発は、CAFEアッセイの性能において重要な役割を果たしています。私たちは、蒸発を減少させるために我々のアッセイに追加のアプローチを含めた：i）中央スポンジ栓は、24時間ごとに水を補充されます...

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ディスカッション

報告書は、技術的なセットアップと実験室での成功のパフォーマンスに焦点を当て、ステップ・バイ・ステップ方式でCAFEアッセイを説明します。 、その単純さのために、このアッセイはまた、学校の実験として、教育的に使用することができます。例としては、アッセイが短く、より長い期間（数時間から数日）にわたってキイロショウジョウバエにおける食物センシング、好みや消費の調査を可能にすることを示しています。 CAFEアッセイは、食品や薬の消費、中毒、エネルギー恒常性と給電16の神経制御、18、24、25などの科目を調査する分野で広く用いられています。

CAFEアッセイでは、実験的なハエは成功し、このような採餌、センシングおよび歩行のように、食べ物を得るために、いくつかのタスクを実行する必要があります。これらのタスクを実行できな...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

議論をしてくださったショルツ研究室の過去と現在のメンバーと、優れた技術サポートを提供してくださったヘルガ・デーリングに感謝します。特に、ケルン大学のバイオセンターワークショップのメンバーの支援と創造性に感謝します。この作業は、SFB 1340、SysMedAlc、およびDAAD-Siemensによってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
バイアル(育種)Greiner Bio-One960177www.greinerbioone.com
Vials(CAFEアッセイ)Greiner Bio-One217101www.greinerbioone.com
Lid-CAFE assayWorkshop––
プラスチックの箱、プラスチックPlastime353 www.plastime.it
カバーワークショップ––
毛細血管BLAUBRAND 参照 7087 07www.brand.de
ピペットチップGreiner Bio-One771290www.greinerbioone.com
ろ紙サークルWhatman10 311 804www.sigmaaldrich.com
D(+)-ショ糖AppliChem57-50-1www.applichem.com
エタノール 絶対VWR 化学薬品20,821,330www.vwr.com
食品色 (赤、E124)Backfun10027www.backfun.de
食品色 (青, E133)Backfun10030www.backfun.de
石鹸液 (CVK 8)CVH103220www.cvh.de
デジタルノギスGARANT412,616 www.hoffmann-group.com
バイアル (繁殖)高さ 9.8 cm、直径 4.8 cm 
バイアル(CAFEアッセイ)高さ8cm、直径3.3cm
Lid-CAFEアッセイ大学のワークショップで制作、製図付属
このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
プラスチックボックス、低壁プラスチックグリッドインレイは、8 x 10バイアルの位置用にカスタムメイドされました 
プラスチックボックス寸法(37 x 29 x 18 cm)
キャピラリーDINISO 7550規格、 IVD-ガイドライン 98/79 EG、端部は磨かれています
ピペットチップ外側の円のピペットは蓋に従ってカットされています
濾紙の円は直径45mmで、使用したバイアルに折りたたむとうまく機能します
D(+)-ショ糖有害ではない
エタノール絶対可燃性の高い液体と蒸気
食品着色料(赤、E124)記載なし
食品着色料(青、E133)記載なし
石けん液(CVK 8)臭気中性石鹸
デジタルノギス
スタンダードフライフード(20L用)
寒天160g
ビール酵母299.33g
コーンミール1,200g
糖蜜1.6L
プロピオン酸57.3mL
ニパギン 30%160mL
の箱のための低壁のカバー

参考文献

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