方法論記事

の栽培線虫（Caenorhabditis elegans）ラボにおける三次元で

DOI：

10.3791/55048

⸱

2016年12月12日

 ,  , 
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

この記事について

サマリー

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我々はNGT-3DとNGB-3Dと呼ばれる3D線虫の栽培システムを構築するための簡単な方法を提示します。これらは、標準的な2D実験室のC.エレガンス培養プレートより自然な線虫（Caenorhabditis elegans）の生息地に類似している生息地における線虫のフィットネスや行動を研究するために使用することができます。

要約

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Caenorhabditis elegansのような遺伝子モデル生物の使用は、過去50年間にわたって生物学における独創的な発見をもたらしました。C.エレガンスについて私たちが知っていることのほとんどは、線虫の実験室での培養に限定されており、必ずしも彼らが自然界に通常生息する環境を反映しているとは限りません。自然界の腐った果物や栄養堆肥で線虫が遭遇する3Dマトリックスにより類似した3D生息地でC.エレガンスを培養すると、2Dでは観察されない新しい表現型と行動が明らかになる可能性があります。さらに、3Dでの実験は、2Dで観察する表現型が自然界の線虫にどのように関連しているかを解決できます。ここでは、C.エレガンスが3次元で正常に成長・繁殖する新しい方法を紹介します。線虫Growth Tube-3D(NGT-3D)でのC.エレガンスの培養により、C.エレガンス株の生殖適応度や3D環境でのさまざまな条件を測定できます。また、線虫成長ボトル-3D(NGB-3D)と呼ばれる新しい方法も紹介し、顕微鏡分析のためにC.エレガンスを3Dで培養します。これらの方法により、科学者は、自然界で遭遇する環境をより反映した条件でC.エレガンスの生物学を研究することができます。これらは、実験室で観察されるC.エレガンスの生理機能と行動の根底にある進化的関連性を理解するのに役立ちます。

概要

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実験室での線虫Caenorhabditis elegansの研究は、過去50年間にわたる生物学の分野での独創的な発見につながっています。C.エレガンスは、1998年にゲノム配列が決定された最初の多細胞生物であり2、生物全体の発生、生理学、および行動に対する個々の遺伝子の寄与を理解する上で非常に貴重でした。科学者たちは現在、これらの遺伝子が自然環境での生物の生存と生殖適応度にどのように貢献するかをさらに理解しようとしており、遺伝子レベルでの生態学と進化について疑問を投げかけています3-5。

C. elegansは、これらの質問に答えるための優れたシステムを再び提供することができます。しかし、自然界の線虫の生息地におけるC.エレガンスの生物学についてはほとんど知られておらず、実験室でC.エレガンスの制御された自然条件をシミュレートする現在の方法はありません。研究室では、C.エレガンスを大腸菌6を播種した寒天板の表面で培養しています。しかし、自然界では、C.エレガンスと関連する線虫は、世界中の土壌にまばらに生息しているのを見つけることができますが、特に腐った果物や栄養物質で繁栄していることがわかります7,8。これらの 3 次元 (3D) 複雑な環境は、実験室でワームがさらされる単純な 2D 環境とは大きく異なります。

より自然な3D環境での線虫の生物学についての質問に答えるために、私たちは線虫の実験室栽培のための3D生息地を設計しました。私たちはNematode Growth Tube 3Dまたは略してNGT-3Dと呼んでいます。その目標は、標準的な2D線虫増殖培地(NGM)プレート10に匹敵する成長、発達、および繁殖力を可能にする3D成長システムを設計することであった。このシステムは、細菌や線虫のライフサイクル全体にわたって3Dでの成長をサポートし、線虫が3次元で自由に動き、行動することを可能にし、製造と使用が簡単で安価です。

現在の研究では、NGT-3Dを製造し、線虫の発生と繁殖力を評価するための段階的な方法を提供します。3Dでの線虫の適応度の評価に加えて、3D培養における線虫の行動と生理学を画像化、ビデオ、評価することを目指しました。したがって、NGT-3Dに加えて、ここでは、3D培養中のC.エレガンスの顕微鏡イメージングのためのNematode Growth Bottle 3DまたはNGB-3Dと呼ばれる代替方法を紹介します。これは、2Dで同定された既知の挙動の研究や、3D培養に特有の新たな挙動の同定にとって特に重要となります。

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プロトコル

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1. NGT-3DとNGB-3Dのためのソリューションを準備

  1. 0.1454 M NaCl溶液1 L、1 MのCaCl 2、1MのMgSO 4、溶原性ブロス（LB）、KH 2の1 M KPO 4緩衝液（108.3グラムの1 Lの1 Lの1 L：以下の無菌溶液を準備しますK 2 HPO 4のPO 4 35.6 gであり、1 LにH 2 Oを充填します）。これらのソリューションを使用してNGMの生産は以前のプロトコル10で見つけることができます。
  2. 121℃、15分のオートクレーブソリューション。
  3. 無菌の5mg / mlのコレステロール溶液50mlを準備します。 50ミリリットルの円錐管では、コレステロールの0.25グラムと99.99％のエタノール50mlを混合し、よく混ぜます。 オートクレーブしないでください 。 0.45μmのシリンジフィルターで50mlの注射器を用いてコレステロール溶液を滅菌します。これはまた、任意の溶解していないコレステロールを除去します。
  4. 2'-デオキシ-5-フルオロ（FUDR）株式の150 mMのの10ミリリットルを用意（オプション）。 15ミリリットルコニカルチューブでは、0.3693グラムを混ぜますFUDRおよび蒸留水10mlを。よくまぜろ。

2. NGT-3DとNGB-3Dのための細菌培養を準備

  1. 細菌と10mlのLBブロスに接種。 C.エレガンス供給のために使用される標準的な細菌は、 大腸菌株OP50です。
  2. 文化一晩振とう培養器で37℃で細菌接種。
  3. 連続希釈の準備のために、滅菌した15ミリリットルコニカルチューブにNaCl溶液のアリコート9ミリリットル。例えば、7チューブの合計に一定分量9mlをOP50株大腸菌の10 -7希釈を行います。
  4. NaCl溶液の9ミリリットルで、無菌の新しいチューブに無菌千μlのピペット、ピペット1mlの細菌培養物または希釈した細菌培養物を使用して、よく10ミリリットルの混合物をボルテックス。目的の細菌の希釈が達成されるまで繰り返します。
    注：希望の細菌希釈タイプと条件細菌のと同様に、正確な実験条件に依存します。例えば、10 -6 - 6.5ミリリットルNGT-3Dのチューブ当たり200細菌コロニー- OP50株大腸菌の10 -8希釈は1から生成するのに十分でした。 10 -7 -コロニーの数は60を超えていたとき、ワームは、10 -6の希釈で発生し、確実に開発され、正常に再生しました。 NGB-3Dの場合は、10 -8の希釈を使用します。

3.メイキングNGT-3DとNGB-3D（200ミリリットル）

  1. 細菌培養物を準備した後、0.6グラムのNaCl、1グラムの造粒寒天、および500mlのフラスコ内の0.5グラムペプトンを混ぜます。フラスコに磁気攪拌棒を挿入します。
  2. 195ミリリットルに蒸留水を加え、アルミホイルでフラスコの口をカバーしています。
  3. 15分間121℃でオートクレーブ。
  4. 撹拌プレート上にホットオートクレーブ処理フラスコを置き、少なくとも2時間、中程度の速度で攪拌します。 40℃にフラスコを冷却します。完成した寒天の曇りにつながる可能性があり、ここで、高温でから継続して十分に冷却するようにしてください。しかしながら、より低い温度は、寒天の早期硬化をもたらすことができます。
    1. 撹拌プレート上に配置する前に、40℃の水浴で15分間でフラスコを置き、冷却プロセスをスピードアップする（オプション）。
  5. 寒天培地の温度が40℃に達したとき、溶液を攪拌し続けるように、200μlの1 MのCaCl 2、5 mg / mlでのコレステロール溶液200μl、200μlの1 MのMgSO 4および5 mlの1 M KPO 4緩衝液を加えます1mMのCaCl 2を、5μg/ mlのコレステロール、1mMのMgSO 4を、1 mMのKPO 4の最終濃度まで。
    1. NGT-3Dの寿命アッセイのために（オプション）120μM12の最終濃度に150mMのFUDRの80μlを添加します。
  6. 直接フラスコにステップ2.4からの細菌培養物を希釈した10ミリリットルの6ミリリットルを追加します。
    1. （オプション）NGT-3Dの場合は、ステップ3.6前の寒天培地の6ミリリットルを削除し、別にそれを暖かく保ちます。このメディアが使用されます細菌フリー上層。
  7. 滅菌手順を使用して、無菌培養室にメディアを分配します。チャンバーのカバーがしっかりと閉じていることを確認します。
    1. ステップ3.7からのメディアが完全に硬化する前に、上のステップ3.6.1から細菌を含まない寒天培地の層を作る、寒天の上面に形成されるの細菌コロニーを防止するために、（オプション）。これはNGT-3Dの上部にある細菌フリーゾーンを作成します。
    2. NGT-3Dの場合は、細菌の寒天層を作り、そして慎重に薄いbacteria-を作るために半硬化3Dメディアの上に細菌を含まない培地200μlのを分配するために8ミリリットル透明なプラスチック製試験管に6.5ミリリットルのメディアを注ぎます上部の自由層。
    3. NGB-3Dの場合は、25cm 2の透明なプラスチックの細胞培養瓶にメディアの65ミリリットルを注ぎます。この量は、25cm 2の細胞培養ボトルのボディを埋める必要があります。
  8. 細菌コロニーが成長できるようにするために、室温で1週間垂直室を残します少なくとも直径1mmのかなりの大きさ。
    1. （オプション）NGT-3Dで寿命アッセイのために、FUDRの光劣化を防止するために、アルミホイルでチャンバーをカバーしています。

NGT-3D（相対同腹サイズアッセイ）上でワームの人口の4メジャーフィットネス

  1. ピックや細菌フリーNGMプレート上の転送白金線を使用して、L4段ワームを選びます。ワームは自由に体に付着した細菌を除去するために、数分間に移動できるようにします。
  2. ステップ4.1を繰り返して、このワームは細菌から自由であることを確認してください。一般的に、4.1の2反復が十分にあります。
  3. 慎重に白金線ピックで3Dメディアの表面にきれいなワームを置きます。ワームは、最終的には3D寒天マトリックス中に寒天を入力する必要があります。
  4. ゆるくいくつかの空気がチューブに入るためにできるようにカバーを閉じますが、寒天培地の乾燥を防止します。
  5. 20℃で96時間インキュベートします。
  6. 4日後、しっかりと蓋を閉じて置きます88℃の水浴にNGT-3D培養チャンバは、寒天を融解します。熱は虫を殺すが、自分の体はそのまま残ります。
    注：NGT-3Dのための8ミリリットルのチューブを使用して、20から30分間のインキュベーションは、通常は十分です。
  7. ガラスピペットを使用して9センチプラスチックシャーレ上に溶融したメディアを転送します。ワームは、多くの場合、それらに固執することができますようにプラスチックピペットは、お勧めされていません。
  8. 送信立体解剖顕微鏡を用いて、L3、L4でワーム、および成体段階の数を数えます。 F1及びF2世代はここで混乱することができますように、L2ステージと若いワー​​ムをカウントしないでください。したがって、このアッセイは、相対的なひなサイズ分析ではなく、合計ひなサイズのアッセイです。

5.イメージとNGB-3Dでの録音ワームの動作

  1. 白金線を使用して、L4段ワームをピックし、細菌フリーNGMプレートに移し、それが自由に数分間移動させることにより、表面に付着した細菌を除去します。
  2. インクルードをめざし確実にする手順を繰り返し5.1rmが細菌から自由です。
  3. 慎重に白金線ピックと瓶の首に近いNGB-3Dの寒天表面の中央にきれいなワームを配置します。ワームは、最終的には3D寒天マトリックス中に寒天を入力する必要があります。
  4. 寒天培地の乾燥を防止しながら、緩やかにいくつかの空気がチューブに入るためにできるようにカバーを閉じます。
  5. 画像または伝送ステレオ解剖顕微鏡下でワームを記録。ワームが3Dマトリックスを通って移動するようにフォーカスを調整します。

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結果

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NGT-3Dの建設は、寒天（ 図1A）全体に間隔をあけ小さな細菌コロニーを寒天で満たされた試験管になり、シンプルで簡単なプロトコルです。ワームは自由に細菌コロニーを発見し、消費し、寒天マトリックスを通って移動することができます。 C.エレガンスが再現し、NGT-3Dで正常に成長できるかどうかを確認するために、我々は標準的な2D NGMプレートで3Dで不妊治療や幼虫の発育を比較しました。相対ひなサイズのアッセイでは、成人のC.は NGT-3Dで雌雄同体はちょうど同様に細菌コロニーは、少なくとも60個のコロニー（ 図1B）と豊富で、標準的な2D NGMプレートで雌雄同体を再現エレガンス 。また、NGT-3Dで幼虫の開発も96時間（ 図1C）後の大人の状態でのワームの大半は細菌コロニーがたくさんあるときに通常進みます。しかし、細菌コロニーが疎である場合に3Dマトリックス中に、相対的なひなサイズ（ 図1B、<...

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ディスカッション

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古典的な線虫の増殖培地プレートを使用して、 線虫の実験室での栽培は、 線虫の研究が提供していることが重要な発見の数百に非常に重要でした。ここで、我々はより正確に自然な立体生息環境を反映している環境で、 線虫を育成する新たな方法を提示します。他の方法は、3D 13の線虫を観察するために使用されているが、これは、固体三次元マトリックスにワームの栽培を可能にする最初のプロトコルです。ここに示されている二つの方法、NGT-3DとNGB-3Dは、科学者が3D栽培でフィットネス、発展と成長の質問をし、また、画像や3Dでワームを記録することができます。 NGT-3DとNGB-3Dは、標準的な2D NGMプレートにいくつかの違いがありますが、彼らはこのオリジナルの方法と同様であり、唯一のz軸にワーム栽培を追加するように調整します。したがって、我々は、開発、生殖能力と寿命が私たちの条件で正常に進行していることを見つけます。ザ目標は、任意の研究室が自分の研究のために使用することができるプロトコルを作成することでした。これらの方法は、非常に低コストで容易に再現、非常...

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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この作品は、韓国国立研究財団（NRF）からJILへの新しい研究者グラント【2014R1A1A1005553]によってサポートされていました。 [2015-22-0133] JILへと延世大学の未来のリーダーチャレンジグラント

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
LBブロス、Miller(Luria-Bertani)Difco224620
塩化ナトリウムDAEJUNG7548-440058.44 MW
寒天、粒状Difco214530
ペプトンバクト211677
塩化カルシウム、二水和物Bio BasicCD00502*H2O; 147.02 MW
コレステロールバイオベーシックCD0122386.67 MW
エチルアルコールB&JRP090-199.99%; 46.07 MW
硫酸マグネシウム、無水Bio BasicMN1988120.37 MW
リン酸カリウム、一塩基性、無水Bio BasicPB0445136.09 MW
2'-デオキシ-5-フルオロウリジン東京化学工業D2235246.19 MW
リン酸カリウム、二塩基性、無水Bio BasicPB0447174.18 MW
多目的試験管ストックウェル・サイエンティフィックST.85708 ml
試験管閉鎖ストックウェル・サイエンティフィックST.8575
細胞培養フラスコSPL ライフサイエンス7012525 cm2
Research 実体顕微鏡ニコンSMZ18
高精細カラーカメラヘッドニコンDS-Fi2
PCベースコントロールユニットニコンDS-U3
NIS-Elements 基礎研究、顕微鏡イメージングソフトウェアニコンMQS32000

参考文献

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タグ

C elegans 3D NGT 3D NGB 3D

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