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方法論記事

サポートされている脂質二重層中のリガンドナノクラスター配列

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DOI:

10.3791/55060

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2017年4月23日

 ,  ,  ,  , 
1Aix-Marseille Université, CNRS, UMR 7325, CINaM, 2State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science of Jiangnan University

この記事について

サマリー

私たちは、流体脂質二重層によって取り囲まれるナノメートルタンパク質のパッチでガラスを官能化するプロトコルを提示します。これらの基板は、高度な光学顕微鏡と互換性があり、細胞接着および遊走の研究のためのプラットフォームとして機能することが期待されます。

要約

現在、細胞生物学的研究のための不動態化表面の海で接着性タンパク質の島々の注文したアレイを作成するにはかなりの関心が寄せられています。過去数年間で、それは彼らに提示する分子の生化学的性質のためにも、これらの分子が提示されている方法にするだけでなく、生きている細胞が応答することがますます明らかになっています。タンパク質のマイクロパターンを作成することになりましたので、多くの生物学の研究室では標準的なものです。ナノパターンは、よりアクセス可能です。しかし、細胞間相互作用の文脈では、パターンにする必要はありませタンパク質だけでなく、脂質二重層があります。このような二重プロテオ脂質パターニングは、これまで簡単にアクセスされていません。私たちは、ガラス上でサポートタンパク質ナノドットを作成して、支持された脂質二重層（SLB）とドット間のスペースを埋め戻す方法を提案すること容易な手法を提供します。 SLBに含まトレーサー蛍光脂質の光退色から、私たちは二重層がで-PLかなり呈することを示していますANE流動性。蛍光基とタンパク質のドットを官能基化すると、イメージ、彼らと彼らは通常の六角格子に順序付けられていることを示すために私たちをことができます。代表的なドットサイズは約800nmであり、ここで実証間隔は2ミクロンです。これらの基板は、細胞接着、移動およびメカノセンシング研究用として有用なプラットフォームを提供するために期待されています。

概要

細胞接着は、細胞外マトリックス上で、または別の細胞上のそれらの対応物に結合することができる細胞膜上に存在する特殊な細胞接着分子（CAM）、タンパク質を介して行われます。接着した細胞に、ユビキタスインテグリンおよびカドヘリンを含むほとんどの接着分子は、クラスター1の形態で見出されます。多くの場合、免疫学的シナプスと呼ばれる - 抗原提示細胞（APC）とTリンパ球（T細胞）の相互作用は、二つのセルの間の界面に形成された受容体クラスターの重要性の特に顕著な図を提供します。プラットフォーム2をシグナルとして働くT細胞形態ミクロンスケールクラスターの表面上のAPC、T細胞受容体（TCR）との最初のコンタクトを形成する際に、3、4、および最終的には大きな中央超分子クラスターを形成するために集中している（CSMAC ）LASS = "外部参照"> 5、6、7。最近、APC側に、TCRのリガンドはまた、8クラスタ化されることが示されました。

T細胞-APC相互作用の文脈では、APCは、関連するタンパク質で官能人工表面によって模倣されたハイブリッドシステムの展開は、非常にシナプスインタフェース2、3、4、5、6、7の我々の理解が進んでいます。この文脈では、標的細胞の1つのまたは複数の態様を捕捉APC模倣表面を設計することが非常に適切です。リガンドが支持された脂質二重層上にグラフトされた場合、彼らは、二重層の面内に拡散するAPC表面上の状況を模倣すると同時に、の形成を可能にすることができますCSMAC 6、7。同様に、APC上のクラスターはポリマー9、10、11、12、13、14の海でのリガンドのアイランドを作成することによって模倣されてきました。しかし、これら2つの機能は、これまで併用されていません。

ここでは、拡散する脂質と脂質二重層に囲まれた抗CD3（TCR複合体を標的とする抗体）のナノドットを作成するための新規な技術を説明します。二重層は、ラングミュア-ブロジェット/ラングミュア-シェーファー法7、15、16を用いて堆積され、必要に応じて、特定のタンパク質で官能化することができる-例えば、T細胞インテグリンのリガンド（ICAM1と呼ばれます）。また、抗CD3タンパク質ドットCOULDは、別の抗体またはCAMに置き換えること。我々はT細胞接着研究のためのプラットフォームとして、将来の使用のためのタンパク質を選択しているが、ここでは詳細な戦略は、任意のタンパク質、さらにはDNAに適合させることができます。

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プロトコル

1.クリーニングガラスカバー・スライドと観察室

  1. ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）のような不活性材料で作られたマルチスライドトレイ上のガラスカバースライドを配置。
  2. 界面活性剤溶液中にスライドを有するトレイと観察室（適切である石英キュベットを洗浄するために推奨される任意の製品）を浸します。
  3. （20と30℃の間）、室温で30分間、界面活性剤溶液中で超音波浴、超音波処理を使用して。
  4. 超純水で5回（18.2MΩ.cm、0.059μS/ cm）をすすぎます。
  5. （20と30℃の間）、室温で30分間、界面活性剤溶液中の超音波処理。
  6. 超純水で10回洗浄します。
  7. 繰り返しは二回1.5と1.6を繰り返します。
  8. 最大1週間（20〜30°Cの間）、室温で水に保管してください。

タンパク質ナノドットの2製作

  1. ビーズの沈着
    1. Deposiシリカビーズ（2％v / v、70μL）の懸濁液tを15度の傾斜で保持カバースライド（24×24ミリメートル、厚さ170ミクロン）に一滴ずつ。
    2. 90°ごとに15秒でガラスを反転しながら、約1分間のサスペンション広がりをしてみましょう。
    3. 液体は、周囲条件下で蒸発することを許可します。
    4. 最大2日間周囲条件で清浄なガラスまたはPTFE室に保管してください。
  2. アルミの蒸着
    1. シリコン（1％）ターゲット：アルミニウム（99％）から約105ミリの間隔で回転テーブル上に、マグネトロンスパッタリング装置8（RF）無線周波数内部（セクション2.1で調製）スライドを置きます。
    2. ターボ分子ポンプを用いて2.6×10 -4 Paまで堆積チャンバをポンプダウン。このステップでは、可能なガス状不純物の除去のために重要です。
    3. 0.8 PA（6.6ミリトール）の圧力で10sccmの束と純アルゴン雰囲気（5N、99.999％）を導入。
      注：着信アルゴンフラックスはマスフローコントローラによって制御され、プロセス圧力が圧力計を用いて監視されます。アルゴンガスの流れは連続的であり、バルブを開く入口と出口との間のバランスによって制御されます。
    4. RF電力発生器のスイッチをオンにします。
      注記：ここでは、13.56MHzの周波数で400〜600 Wの高周波電力の典型的な範囲を使用しました。 RF発生器は、容量性プラズマ結合モードにおける整合ネットワークと共に使用されます。反射電力を監視し、ネットワークの適応を使用して最小化されます。
    5. プラズマが安定した後、シャッターを保持する2分間スパッタリングターゲットの表面から可能な不純物を除去するために閉じ。
    6. シャッターを開き、スパッタリングが200nmの厚さのガラススライド上にアルミニウムを堆積させるために60分間継続することを可能にします。
    7. 堆積室からターボ分子ポンプを分離し、清浄なNでチャンバを通気するゲートバルブを閉じ、アルゴンの流れをカット部屋の圧力を得ることがitrogen。アルミニウム被覆スライドを回復します。月までの周囲条件下で、清潔で密閉されたガラスやPTFEボックス内のために保管してください。
  3. 有機シランの蒸着
    1. （20と30℃の間、50 W、50/60 Hz）で室温超音波浴中で30秒間超音波処理で超純水にステップ2.2.6で調製したアルミニウム被覆スライドを浸します。
    2. デポジットデシケーターの底部の（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン（APTES）の0.5 mLです。
      注意：APTESを容易に蒸発し、有毒であるオルガノシランです。 APTESは、フローフードの下と手袋で処理する必要があります。
    3. デシケータ内部セラミックグリッド及び場所に（2.3.1で調製）ガラススライドを置きます。
    4. 膜ポンプにデシケーターを接続し、低真空を生成するために30分間、最大パワーで動作。
    5. デシケーターのバルブを閉じ、ポンプのスイッチを切ります。
    6. デシケーターを熱し1時間約50℃です。
    7. デシケーターを開き、スライドを集めます。
    8. 室温（20℃〜30℃）で最大48時間保存のために別の清浄なデシケーターに移します。
  4. タンパク質の第一の層の堆積 - ビオチンで標識したウシ血清アルブミン（BSAビオチン）
    1. PTFE支持体上のセクション2.3で調製されたスライドの1を置きます。
    2. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解を25μg/ mLのBSAビオチンの預金1 mLです。室温（20〜30℃）で30分間放置します。
    3. PBSで10回洗浄します。光源から離れて4℃で最大24時間、サンプルを保存します。
  5. アルミニウムマスクの除去
    1. （20と30℃の間）を、室温でオーバーナイト（pH≈12を得るために、約100 mLのPBSに1 M NaOHを滴下することにより調製）PBS中のNaOHの溶液でスライドをインキュベートします。
      注意。 NaOHが腐食性であり、手袋を使用して処理されなければなりません。
    2. リンス超純水で10倍。

サポートされている脂質二重層の3堆積（SLB）

  1. ラングミュアトラフのクリーニング
    1. ポンプを使用してラングミュアトラフのPTFEの筐体に水を除去します。
    2. クロロホルムに浸したリントフリー不織布使い捨てタオルできれいにします。
      注意。クロロホルムは有毒であり、マスク（またはフローフード下）で、適切な手袋で、よく換気された場所で操作しなければなりません。
    3. ぬるま湯超純水できれいに4回（40〜50゜C）。
    4. 冷たい超純水で少なくとも6回を清掃してください。
  2. 第1の脂質層の堆積
    1. ラングミュアトラフのPTFEの筐体にPTFEトレイを置き、その後、超純水でそれを埋めます。
    2. 0 MN / mで測定された圧力を設定するためにラングミュア装置の制御ソフトウェアを使用します。
    3. （1mg / mlの脂質溶液30μLを堆積するために1を気密ガラス/金属シリンジを使用クロロホルム中、2- dioleoyl- SN -glycero -3-ホスホコリン（DOPC））水の表面に。クロロホルムを蒸発し、脂質分子が自発的に単層を形成します。
    4. 到達する（DOPC 27のMN / m）の所望の圧力までPTFEバリアを閉じることにより、脂質単層を圧縮するために制御ソフトウェアを使用。
    5. 電動式クランプを使用して、PTFEエンクロージャにセクション2.5.2で調製したスライドガラスを浸漬する制御ソフトウェアを使用。
    6. 空気 - 水界面に垂直なクランプで、スライドを保持します。 27のMN / mにおける一定の圧力を維持しながら、インタフェースを介してゆっくり（15ミリメートル/分）を上昇させる制御ソフトウェアを使用。
    7. 即時使用のいずれかまたは（20と30℃の間）を室温で24時間までの貯蔵のために乾燥した環境内の場所。
  3. 第2の脂質層の堆積
    1. 27のMN / Mの所望の値にラングミュアトラフにおける面圧を維持します。使用して圧縮制御ラングミュア装置のソフトウェア及び/又は所望の圧力を達成するために、脂質を少量加えます。
    2. 水平に水の表面上に、セクション3.2.6で調製した脂質単層を担持するスライドガラスを置き。各スライドは、PTFEトレイの上に浮いていることを確認してください。
    3. ダウンガラススライドを押し、それらが水に浸漬されるように、PTFE又は金属ピンセットを用いて、その対応するPTFEトレイに一度にスライド。押しながらスライドを傾けないでください。
    4. 超純水は、スライドが空気にさらされていないことを確認することで満たさ晶析にスライドを含むPTFEトレーを転送するためにPTFEや金属ピンセットを使用してください。
    5. 観察室に、二重層コーティングされたガラススライドを水中作業中に、転送するためにPTFE又は金属ピンセットを使用します。
      注：観測室が晶析装置内の水の下に配置されます。観察室は、カスタムメイド、ゴムガスケットANとPTFEリングから構成されていますその底面以前に脂質二重層でコーティングされたスライドガラスから作られて水密容器を製造するために水中で組み立てることができるD鋼ケーシング、。
    6. 水の下で動作を続け、水約1mlをチャンバ内に閉じ込められていることを保証しながら、チャンバを閉じます。
    7. 水の中から組み立て室を取ります。それは水を通さないと、漏れがないことを確認してください。
    8. PBSで観察室に超純水存在1mLの10倍を添加し、500μlのPBSを除去することによって置き換えます。チャンバーは、液体の決して欠いていることを確認してください。
  4. SLBブロッキング工程
    1. スライドセクション3.3.6で調製し（20と30℃の間）を、室温で30分間インキュベートを含む観察室にウシ血清アルブミン（BSA）の100μg/ mLのを導入します。
    2. 除去し、PBS 10倍の500μLを添加することによって二重層をすすぎます。二重層は、4℃で24時間維持することができます。

リガンド4.機能化

  1. 20と30°の間（室温で30分間セクション3.4.2で調製したスライドを含むチャンバ内を2μg/ mLの蛍光性または非蛍光ニュートラビジン（NAV、pH7で充電されていないアビジンの脱グリコシル化されたバージョン）を追加C）。
  2. 10回添加し、500μlのPBSを除去することによってリンス。
  3. セクション3.4.2で調製したスライドを含むチャンバーに2μgの/ mLのビオチン化抗CD3を加えます。 SLBドットの二重官能化のため、（ここで、二重層はニトリロ三酢酸（NTA）脂質+ 1％DOPCで作られている）を5μg/ mLでのFc-ICAM1 Hisタグを追加します。 （20と30℃の間）を室温で30分間放置。
  4. 10回添加し、500μlのPBSを除去することにより、リンス
  5. 10回の細胞培地の500μLを添加して除去することによって、細胞培地（PBS + 0.1％BSA）を含むPBSを置き換えます。
  6. chambeに細胞培地の200μLを残しますスライドでrを。
  7. 細胞を添加する前に37°Cで10分間チャンバを置きます。

前記細胞堆積（詳細は文献7を参照されたいです）

  1. 注意深くチャンバー内に細胞懸濁液400μLを堆積させます。 37℃で30分間細胞をインキュベートします。
  2. 37°Cで15分間パラホルムアルデヒドの2％（PFA）で細胞を固定します。繰り返し除去し、PBSの500μLを添加することによってPBSでPFAを交換してください。

6.観察

  1. プロテオ脂質ナノパターンとSLB流動
    1. 例えば、ここで適切な照明波長（639 nm）をフィルタキューブ（EX TBP 483 + 564 + 642を用いて画像を落射蛍光モードでのタンパク質パターンを蛍光顕微鏡を使用して、BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688）。
      注：信号の強度は、ドットの内側と外側のタンパク質の量を推定するために定量化することができます。適切な照明波長（330 nm）を使用してF画像ILTERキューブ暗い穴を有する明るく見える二重層（BP 12分の365、FT 395、LP 397）。
    2. 二重層におけるトレーサー脂質の拡散定数を測定するために、連続的な光退色（CPB）技術13、15を使用します。この観察は、好ましくは、ちょうどSLBの堆積後に行われています。
      注：拡散定数を定量化するために、2つのパラメータは、CPBプロセス中に測定される：染料（緊張状態）と漂白領域（TAUD）の周囲に形成されたハローの蛍光プロファイルの減衰長の特定の漂白時間。第一は、CPBプロセス中に照明視野の中心での蛍光強度の時間変化をプロットしたものです。第二は、（定常状態に達した後12行と5枚の画像にわたって平均）照射ゾーンのエッジに強度プロファイルをプロットしたものです。曲線は、タウトとTAUDを取得するために取り付けられています。拡散定数は、TAによって与えられます。UD 2 /タウト（D = figure-protocol-1 ）。

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結果

蛍光画像は、ドットの間隔や大きさを測定するために分析しました。典型的な間隔があることが判明した1,900±80nmであり、典型的なドットサイズ600±100nmで（ 図1グラム ）でした。間隔は、マスクのために使用されるビーズのサイズによって設定されます。ドットサイズは、ビーズのサイズだけでなく、成膜条件によって設定されています。 SLBは、SLB撮像チャネルで見られる孔及びNAVイメージングチャネルに見られるドット間の完全な相補性と、それらに一意タンパク質ドットの周囲としない（ 図2）が堆積されます。連続写真漂白データの分析は、パターン化された二重層中の脂質は、流体のままであり、5μm²/秒（ 図3）の典型的な拡散定数を有することを示します。

figure-results-1
図1：製造工程の概略図。...

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ディスカッション

上述のプロトコル内の重要なステップは、サポートされている脂質二重層によってタンパク質ナノドットまたはドットの周囲の空間の背面充填の形成に関連しています。タンパク質ナノドットに対する第1の重要なステップは、ビーズ、マスクの製造です。カバースライドの洗浄が重要です。スライドはいずれか、または酸素プラズマで石英キュベットを洗浄するために推奨される洗剤液で洗浄する必要があります。エタノールまたはイソプロパノールの治療への浸漬のような他の洗浄技術は、十分に親水性のガラスをレンダリングしていないため、大カバレッジビーズ単層の形成をサポートしていません。これと同時に、スライドの表面は、ラングミュア-ブロジェット技術7、15、16によってSLBの形成後の工程との互換性が必要です。次の重要なステップはの堆積と除去でありますluminum。堆積は、スパッタリング法によるものである場合、ここで行ったように、ターゲットは、（1％）のシリコンでドープするべきです。ターゲットは、...

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開示事項

著者は、開示することは何もありません。

謝辞

私たちは、携帯アプリケーションについて実りある議論を継続するためローランLimozin、ピエール・ディラードとアストリッド・ワル感謝します。また、SEM観察と彼の助けをPLANETEのクリーンルーム施設からフレデリック・ベドゥ感謝します。この作品は、部分的に助成金番号307104 FP / 2007から2013 / ERC経由の欧州研究評議会によって資金を供給されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ガラスカバースリップアシスト、カールヘクトKG 
観察室自家製
アルカリ界面活性剤濃縮物(Hellmanex)Hella Analytics9-307-011-4-507
処理装置サーモフィッシャー
乾燥装置Labbox
晶析装置 ショット
ニュートラアビジンサーモフィッシャーサイエンティフィック84607
PBS シグマ・アルドリッチP3813
ウォーター MQ ELGA、ヴェオリア フランス
シリカビーズCorpuscular Inc147114-10
APTESSigma-aldrichA3648
BSA-ビオチンSigma-aldrichA8549
DOPCAvanti Polar Lipids850375C
Dansyl-PEAvanti Polar Lipids810330C
クロロホルムSigma-aldrich650471
ガスタイトシリンジ ドミニク・ダッチャー、フランス74453
フィルムバランスNIMA中型
顕微鏡ツァイス、ドイツTIRF-IIIシステム
アルミニウムターゲット Kurt J. Lesker Compagny、米国
無線周波数マグネトロンスパッタリングシステムè私 フランス、アルカテル
超音波による改造SMC 600ツール

参考文献

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