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方法論記事

マウス全層皮膚移植

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DOI：

10.3791/55105

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2017年1月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sidney-Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Liver and Transplantation Surgery, Chang-Gung Transplantation Institute, Chang-Gung Memorial Hospital, Chang-Gung University College of Medicine, 3Vascularized Composite Allotransplantation Laboratory, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

マウス全層皮膚移植は同種免疫設定で拒絶反応を研究するために、十分に確立されたモデルです。 > C57BL / 6全層皮膚移植 - ここでは、BALB / cと実行に関与し、各ステップのチュートリアルを提供しています。

要約

マウスの全層皮膚移植は、同種免疫反応および移植片拒絶を研究するためのインビボモデルで十分に確立されています。ヒトへのその限られた用途にもかかわらず、マウスでは皮膚移植が広く移植研究のために採用されています。手順は、学び、実行することが容易であり、それは繊細な顕微技術も広範囲の訓練を必要としません。また、このモデルにおける移植片拒絶は、非常に再現性の免疫反応で発生しやすい直接検査や触診によって監視されます。また、ドナーをマッチさせた、またはサードパーティの皮膚移植片を有する二次皮膚移植はドナー特異的寛容を評価するための代替と合併症のない方法として、より複雑な移植モデル上で実行することができます。合併症は低く、一般的に手順の後、麻酔の過剰摂取や呼吸困難に限定されています。移植の失敗は、他の一方で、GRの準備不足の結果として、一般的に発生します移植床における後方、不正確な位置決め、または包帯の不適切な配置。この記事では、我々は、マウスの全層皮膚移植のためのプロトコルを提示し、成功した手順のために必要な重要な手順を説明します。

概要

臓器移植は、末期の臓器不全を有する患者のための選択の治療法である、と結果は外科的手順および免疫抑制プロトコルの進歩と飛躍的に向上しています。しかし、長期的な免疫抑制は、重大な副作用に関連付けられている、と寛容を促進する新たな戦略の開発は、現代の移植研究の目標のままです。

多数の動物モデルが、移植片拒絶反応を予防するため、長期的な耐性1-3を促進するための接近同種移植片拒絶反応のメカニズムを研究するために、および免疫抑制を試験するために、移植における基礎研究のために開発されています。マウスモデルは、原因、診断と治療用抗体の排他的で広大な可用性と明確に定義された近交系およびトランスジェニック株と免疫学研究の主力となっています。皮膚移植は特別な顕微スキルや缶を必要としない簡単な手順であります簡単に術後監視されます。まとめると、マウスの皮膚移植は、移植片拒絶4,5中の抗原送達、細胞輸送、および組織破壊を含む同種免疫応答に関与する多くの側面を研究するための例外的なツールとなっています。

ここでは、マウスモデルを用いた全層皮膚移植のためのステップバイステップの手順を示し、我々は移植皮膚の生着の成功のために必要な重要な手順を説明します。

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プロトコル

すべての手順は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針（NIH）に従って行ったし、ジョンズ・ホプキンス大学動物実験委員会（JHUACUC）によって承認されました。具体的な手順は、承認されたACUCプロトコルMO13M292とMO13M370下で行いました。

1.ドナー皮膚の収穫

  1. イソフルラン（ - マウスコーンを介して、2％、4％で誘導気化器、1でのメンテナンス）でドナーマウスを麻酔。麻酔深度を監視するために、つま先のピンチ引っ込め反射を使用してください。
  2. 電気かみそりを使用して、動物の背中を剃る、10％ポビドンヨード（ 例えば 、ベタジン）でそれを消毒します。
  3. 疎性結合組織のレベルで鈍的切開して、滅菌はさみ、手袋、無菌技術、収穫ドナー首の後ろに腰から皮膚を使用しました。
  4. 収穫後に頸椎脱臼により動物を安楽死させます皮膚移植。
  5. 顕微鏡下で、微細な腱切除はさみを使用して、背中の皮膚からの結合組織、脂肪組織、および皮筋層を分離します。皮筋層は、皮膚のけいれんの動きに責任薄い透明筋肉です。
  6. 無菌の楽器の技術を用いて、15ミリメートル×15 mmの移植床に10ミリメートル×10ミリメートルのための背中の皮膚から15ミリメートル×15 mmの移植片を切り出します。
  7. 氷上のペトリ皿中の滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に浸したガーゼに移植片を保管してください。
    注：8 - 10の移植片は、1つのドナーマウスから得ることができます。

2.受信者の皮膚移植

  1. イソフルラン（ - マウスコーンを介して、2％、4％で誘導気化器、1でメンテナンス）とレシピエントマウスを麻酔。麻酔深度を監視するために、つま先のピンチ引っ込め反射を使用してください。
  2. 術後の疼痛緩和のためのブプレノルフィンの0.02ミリグラム/ kg体重を管理します。
  3. グラフトのWi動物の背中側を剃ります挿入され、10％ポビドンヨードで消毒することでしょう。
  4. はさみを使用して、皮膚の15ミリメートル×15ミリメートル四方に10ミリメートル×10ミリメートルを切りました。欠陥サイズは、グラフトより（10％）、わずかに大きくする必要があります。表面的に可能な限りカットします。皮筋層および血管を維持するために注意してください。皮筋層は、その移動性によって、根底にある筋膜およびそれに表面的な実行の血管と区別することができます。
  5. エッジに沿って折り目を避け、移植床に移植片を配置します。
  6. 四隅と各辺の中央に8縫合糸を配置します。各縫合糸のために、移植片を通過し、その後、周囲のレシピエントの皮膚下の移植床の皮筋層を介して針を渡します。
  7. 麻酔マスクを外し、動物が粘着包帯を適用する前に麻酔から部分的に回復してみましょう。
  8. グラフト折り重ねガーゼ絆創膏でレシピエントマウスをラップします。切断、2包帯を組み合わせることにより、包帯を作ります接着剤の1の部分と一緒に2吸収パッドを配置します。
  9. 包帯は、胸部の遠足と呼吸を制限しないことを確実にするためにリカバリ時に密接にマウスを監視します。呼吸数が減少または動物が浅く息をのむか、息を開始した場合に包帯を外します。

3.術後ケア

  1. 感染予防のための手術後のエンロフロキサシン5ミリグラム/キログラムを管理します。
  2. それは完全に麻酔から回復するまで電子レンジで加熱パッドの上にきれいなケージに移植したマウスを置きます。
  3. 術後の前の住宅施設に戻すに1時間、マウスを観察します。
  4. 七日手術後、ステップ2.1のように、マウスを麻酔。包帯の腹側を介してのみ切断することにより包帯を外します。
  5. 観察し、痂皮形成、収縮、または硬さの兆候が次の日に移植片を触診します。存在する場合、移植片は、適切vascularizaを達成していない可能性がありますションとは、技術的な失敗とみなされるべきです。
  6. 拒絶反応の徴候について毎日監視します。移植片組織の≥90％が壊死性になったときに拒否された移植片を考えてみましょう。
  7. 拒否された動物を安楽死させると分析のためにそれらを収穫。

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結果

レシピエントマウスに包帯の配置は、手順の重要なステップです。皮膚移植は、肩、腰、及び背骨（ 図1）との間で、受信者の胴体上に配置されます。包帯は、折り畳まれたガーゼと2プラスチック絆創膏の組み合わせで作られています。レシピエントマウスは、包帯の中心にガーゼの上にダウン移植片で配置されています。 2つの湾曲マイクロ鉗子を用いて、包帯の下側端部が最初に引っ張られ、その後包帯の上面は腹部に、マウスの上にラップされます。

完全なミスマッチのモデルでは、全層皮膚移植片は、通常8〜12日で拒否されます。マイナーミスマッチモデルにおいて、拒絶反応は、多くの変数、遅い、および皮膚移植の出現は、収縮または毛髪の喪失（ 図2）として以下の異なる変化によって特徴付けられます。急性移植片拒絶の属LLY移植片の腫脹および紅斑から始まります。これらのイベントは、グラフト乾燥、収縮、およびかさぶたの形成（

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ディスカッション

メダウォアによるその導入されて以来、最初のヒトの研究で、その後、ウサギおよびマウスで、皮膚移植、同種免疫応答6,7の研究のための貴重なモデルとなっています。この原稿では、上下の背中の皮膚を用いた大規模な、非血管新生化、全層皮膚移植のモデルを提示します。移植組織の供給源として、マウスの尾の皮膚又は耳の皮膚を使用することを含む様々な代替方法は、8,9までに報告されています。これらのモデルは、技術的なシンプルさの明確な利点を提示し、大容量のスループットを可能にします。表皮ランゲルハンス細胞と尾皮膚移植片における真皮樹状細胞の相対的な欠乏は、しかし、特にマイナーMHCの不一致モデル10,11に、ホストによってグラフト受け入れを促進するために遅れて拒絶につながるだけでなく、。このため、全層トランク皮膚移植は、T細胞メディアを研究するためのより強固なモデルと、より適していると考えられますテッドは拒絶12急性 。

加えて、我々のモデルは、単純な技術を使用し、高度な顕微スキルを必要としません。運転時間（麻酔の発...

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

この作品は、NIHの助成金R01AI077610によって賄われていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ストレートマイクロ鉗子シグマF4017
湾曲マイクロ鉗子AesculapBD333R
湾曲したスティーブンス 腱切開ハサミAesculapBC905R
メイヨー解剖ハサミSigmaS3146
マイクロニードルホルダーAesculapBM563R
滅菌ガーゼCovidien
6-0ナイロン縫合糸MWI31849
プラスチックストリップバンド-エイド・ジョンソン&ジョンソン薬局から取得
10 cm シャーレフィッシャーブランドFB0875712
PBS品質 生物学的119069131
ブプレノルフィンDEA 番号が必要です。病院薬局
エンロフロキサシンバイエルヘルスケア186599
441218から取得

参考文献

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