この原稿は、レシオメトリック指標であるセミナフトロダフルーア(SNARF)-1またはS-1を使用して、ヒトおよびマウスの好中球のファゴソームpHと面積、および細胞質pHを測定する簡単な方法について説明しています。これは、生細胞共焦点蛍光顕微鏡法と画像解析を使用して達成されます。
この記事について
サマリー
要約
好中球は宿主の自然防御に不可欠であり、したがって、医学研究の重要な領域を構成しています。ファゴソームは、飲み込まれた粒子の殺傷と消化が行われる細胞内コンパートメントであり、好中球病原体を殺すための主要な舞台であり、厳格な制御が必要です。ファゴソームのpHは、慎重に制御される1つの側面であり、抗菌プロテアーゼ活性を調節します。多くの蛍光pH感受性色素は、ファゴソーム環境を視覚化するために使用されてきました。S-1は、デュアル発光スペクトル、光退色に対する耐性、高いpKaなど、他のpH感受性色素に比べていくつかの利点があります。この方法を用いて、好中球ファゴソームが他のファゴサイトと比較して異常にアルカリ性であることを示しました。色素のさまざまな生化学的結合を使用することにより、ファゴソームを細胞質から描写し、ファゴソームのサイズと形状の変化を評価できます。これにより、イオンの動きをさらに監視することができます。
概要
好中球は体内で最も豊富な自然免疫細胞です。その主な機能は、血流をパトロールし、食作用として知られるプロセスで遭遇する可能性のある異物を飲み込んで消化することで構成されています1,2.粒子は、ファゴソームと呼ばれる細胞内コンパートメントで分解されます。好中球NADPHオキシダーゼ(アイソフォームNOX2)の活性化は、病原体の死に至る一連の生化学反応を開始します。NOX2タンパク質サブユニットは、ファゴソーム膜3で電子伝達鎖複合体を形成し続けます。活性化されると、NADPHから電子が膜を通ってファゴソーム内の酸素分子に輸送され、スーパーオキシドアニオンとさらに活性酸素種が生成されます。これは呼吸バーストとして知られており、効率的な微生物の死滅と消化に不可欠であると考えられています2。しかし、膜を横切る負電荷のこの排他的な移動は、正電荷がファゴソームに移動するおよび/または負電荷が移動することによって補償されない場合、NOX2をすぐに不活性化します。好中球の電荷補償の大部分は、陽子チャネルHVCN14,5によって行われることは十分に確立されています。このチャネルは、サイトゾルからファゴソームへの電気化学的勾配を下る陽子の受動的な移動を可能にします。プロトン濃度はpHに反映されるため、特定のレベルのオキシダーゼ活性について、ファゴソームのpHを測定することで、電荷補償におけるプロトン経路と非プロトン経路の相対的な関与に関する情報を得ることができます。
ヒト好中球ファゴソームは、食作用後20〜30分間、約8.5のアルカリ性pHを持っています5.これは、酸性顆粒の内容物の融合と放出、およびHVCN1による唯一の補償が、観察されたものとは対照的に酸性環境を維持することから、NOX2誘導電荷補償に追加の非プロトンイオンチャネルが存在することを意味します。この負電荷を補償するためのイオンの移動は、浸透を介してファゴソームサイズの変化も及ぼす可能性があります。これらは、好中球に生理学的に高い濃度で存在するイオンである可能性があります:カリウムイオンはファゴソーム6に移動することが示されており、塩化物イオンの移動は好中球機能7にとって重要な別の候補です。
ファゴソームのpHの調節は、抗菌プロテアーゼ活性にとって不可欠です5.ミエロペルオキシダーゼ(MPO)はpH 6で最適な活性を示すように見えますが、カテプシンGとエラスターゼの場合、最適なレベルはpH 7-9とpH 8-10、それぞれ5です。したがって、ファゴソームpHの一時的な変化は、さまざまな酵素が機能するための活性ニッチを提供する可能性があります。pHが好中球微生物の死滅にどのように関与しているかを理解することは、新しい好中球増強微生物剤の設計に有用な情報を提供する可能性があります。
好中球ファゴソームは反応性の高い環境です。これにより、染料は酸化しやすく、技術的なアーティファクトにつながる可能性があるため、pHを正確に評価することが困難になります。歴史的に、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)は、細胞内pHの測定に最適な色素でした8,9。ただし、好中球ファゴソームpHの測定に使用することにはいくつかの欠点があります。pKa は 6.410 で、pH < 811 で飽和するため、5 から 7.58 の pH レベルを評価するためにのみ正確に使用できます。好中球のファゴソームpHははるかにアルカリ性になる可能性があるため5、FITCは潜在的なpH変化の全範囲を捉えることはできません。好中球の文脈におけるFITCのさらなる重大な問題は、MPO12によって光退色されると考えられていることです。MPO阻害剤であるアジ化ナトリウムは、光退色を制限するために使用できます13、しかし、アジ化ナトリウムはMPOに依存しない方法でファゴソームpHを直接低下させることが示されています。したがって、そのようなアッセイでの使用には不適切です5。
他の細胞内色素と比較して、S-1は7.510と比較的高いpKaを持っています。酸性条件下では、分子はプロトン化され、488 nm以上で励起されると560〜600 nmの発光シグナルを生成します。分子がよりアルカリ性の条件で脱プロトン化されると、発光波長は600nmを超えます。これら2つの波長での蛍光強度の比は、蛍光色素の濃度や細胞構造の影響を受けないため、単一の蛍光測定よりも信頼性が高い発光シフトを示しています。S-1は、zymosan14などの抗原性物質に結合させることができますが、表面積が大きいほど蛍光の読み取りが安定するため、熱死滅(HK)カンジダアルビカンスが好まれます。
この方法の修正版を使用して、pHの時間的変化を研究しました（図3)5.この細胞質pHの測定方法は、他の場所で説明しているように、他の細胞タイプにも簡単に適用できます15,16、およびよりアルカリ性のファゴソームを持つ細胞14。
プロトコル
倫理に関する声明:すべての動物の作業は、英国内務省の許可と承認を得て行われました。この研究への人間の参加は、UCL/UCLH合同委員会によるヒト研究の倫理に関する承認を得ました。すべての参加者はインフォームドコンセントを提供しました。
1. C. albicansの調製
- 製造元の指示に従って、YPD寒天プレート上にカンジダディスク(材料リストを参照)を成長させます。コロニーを選び、15mLのYPDブロスに加えます。30°C、200rpmの振とうインキュベーターで、ブロスが濁るまで(通常は約2日、または約1 x 109/mLを超える濃度になるまで)インキュベー トします。
- カンジダ培地をスピンダウンし、50 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁します。3,000 x gで10分間遠心分離します。この手順を 2 回繰り返します。
- 50 mLのPBS/カンジダ培地を含むチューブを60°Cに予熱した水浴に入れ、チューブ全体を1時間沈めます。
- カンジダが加熱死したことを確認するには、YPD寒天プレートにサンプルを縞状にし、30°Cで一晩インキュベートします。カンジダの増殖に応じて、加熱死(HK)カンジダ濃度を5-9 x 108 / mLに調整し、-20°C冷凍庫の1mLアリコートで保存します
注:このプロトコルのすべての細胞カウントは、自動セルカウンターを使用して実行しました。
- カンジダが加熱死したことを確認するには、YPD寒天プレートにサンプルを縞状にし、30°Cで一晩インキュベートします。カンジダの増殖に応じて、加熱死(HK)カンジダ濃度を5-9 x 108 / mLに調整し、-20°C冷凍庫の1mLアリコートで保存します
2. S-1 Heat-kill (HK) Candida への結合
- カルボキシ-S-1スクシンイミジルエステル(50μg)を100μLの高品位ジメチルスルホキシド(DMSO)で希釈してアリコートを調製します。渦をよく混ぜます。
- 1 mLチューブ内の0.1 M重炭酸ナトリウム(pH 8.3)中の1 x 108 HKカンジダ1 mLを調製します。
- HKカンジダに100μLのカルボキシS-1を1滴ずつ加え、約2,000rpm(中高速)の渦で混合します。チューブにアルミホイルを巻き付け、室温でローラーに1時間置きます。
- HK Candida-S-1(HKC-S-1)を2,250 x gで遠心分離し、各10分間3回洗浄します。最初の 2 回の洗浄では、ペレットを 15 mL の 0.1 M 重炭酸ナトリウム (pH 8.3) に再懸濁します。3回目の洗浄後、1 mLの平衡塩溶液(BSS)バッファーに再懸濁します(表1を参照)。
- HKC-S-1懸濁液を100μLアリコートのチューブに移し、-20°Cで保存します
注:HKC-S-1粒子は通常の遠心分離管の壁に付着する可能性があるため、可能であれば、表面結合材の少ないチューブを使用してください。 - オプソナイズ HKC-S-1
- ヒト好中球の場合は、解凍したHKC-S-11100μLに100μLのヒトIgG血清を加えます。
- マウス好中球については、正常マウス血清50μLとマウスCandida免疫血清(HKカンジダを注射したC57B6マウスから生成)50μLをHKC-S-15からHKC-S-1を100μLに加えます。
- 37°C、1,100rpmのヒートシェーカーで60〜90分間混合し、次に4°Cローラーで2時間混合します。
- BSSバッファー中で17,200 x gを遠心分離し、それぞれ1分間3回洗浄します。100 μLのBSSバッファーに再懸濁します。
3. 好中球の単離
- ヒト末梢血好中球の場合は、健康なドナーから静脈穿刺により15mLの血液を採取し、1,000IU/mLのヘパリンナトリウム溶液90μL(ヘパリン60μL/血液10mL)が入った20mLの注射器に入れます。
- ピペットチップを使用して、1.5mLの10%デキストラン溶液をシリンジに注入します。そっと3回ひっくり返し、ベンチに直立させておきます。
- 血液がほぼ半分に分割され、麦わら色のバフィーコート層と赤血球を含む下部層が整うまで、30〜60分待ちます。
- 最上層を針で慎重に押し出すか、ピペットチップで取り外します。15mLのチューブに入れます。赤いレイヤーを取り出すことは避けてください。5 mLピペットを使用して、バフィーコート層の下のチューブの底に3〜4 mLの密度勾配培地(材料リストを参照)を加え、2つの異なる層を得ます。913 x gで10分間遠心分離します.
注:マウス好中球を使用する場合(マウス好中球の単離については、reference17を参照)、代わりに骨髄から洗い流された細胞懸濁液を使用してください。 - 上澄みを注ぎ、赤いペレットを残します。ペレットを乱すために穏やかに渦を巻きます。蒸留してオートクレーブ滅菌したH2O7 mLをペレットに加え、20秒間反転させてペレットを再懸濁します。7mLの2倍生理食塩水を加え、数回反転させて混合し、残りの赤血球を溶解します。
- 300 x gで5分間遠心分離し、上清を注ぎ取り、ペレットをBSSバッファーに再懸濁して約4 x 106 / mL
注:細胞の最適な顕微鏡観察のために、細胞懸濁液濃度を1.5〜6 x 106 / mLに保ちます。
4. スライドの準備
- 8ウェル顕微鏡プレート(材料リストを参照)を、各ウェルに200 μLのポリ-L-リジン(0.01%溶液)を入れて室温で40〜60分間前処理します。
- ポリ-L-リジン(再利用可能)を取り出し、蒸留したH2O200 μLでウェルを2回洗浄します。
- ステップ3.6で調製した細胞懸濁液200μLを各ウェルに加えます。室温で30〜60分間インキュベートします。
- 1本のチューブに100μLの高品位DMSOを添加して、5-(および-6)-カルボキシS-1アセトキシメチル(S-1-AM)エステル(50μg)のアリコートを調製します。渦を混ぜます。使用しないときは、-20°Cで保存してください。
- 小さなチューブに、1.7 mLのBSSバッファーと20 μLのS-1-AMを加えます。渦を混ぜます。
- ウェルを200 μLのBSSバッファーで2回洗浄し、バッファーをS-1-AM溶液と交換します。ウェルの底に付着した細胞の単層を乱さないように、ウェルの壁を静かにピペッティングして下ろします。室温で少なくとも25分間インキュベートします。
- ウェルを200μLのBSSバッファーで2回洗浄します。阻害剤をテストするには、BSSバッファーで適切な薬物の「マスターミックス」を作ります。阻害剤溶液でウェルを2回洗浄します.
注:コントロールウェルでは、阻害剤に使用したのと同じ量の薬物ビヒクル(DMSOやエタノールなど)を使用してください。.塩化亜鉛の影響をテストする場合は、亜鉛がリン酸塩とともに沈殿するため、KH2PO4を欠くBSSバッファーを使用してください(HEPESは溶液のみを緩衝できます)。 - オプソニン化したHKC-S-1(セクション6.2)を5振幅μmで約3秒間超音波処理し、各ウェルに10μLを加えます。プレートを37°Cで15〜20分間インキュベートして食作用を可能にし、細胞を食作用のスナップショットにイメージングする準備を整えます。
5. 共焦点顕微鏡
- 共焦点顕微鏡を使用して、細胞が555 nmで励起され、発光が560〜600 nmおよび600 nmを超える2つのチャネルまたは検出器によって検出されるように、レーザー波長を調整します< br /> 注:特定の顕微鏡パラメータは顕微鏡ごとに異なるため、研究者が最適化する必要があります。
- オイル入りの63倍レンズを使用して細胞を観察します。連続設定でタイルスキャン画像を使用して、中央のタイルを表示します。検出器チャンネルの蛍光強度とゲインを使用して、レーザーの焦点と強度、および2つのチャンネルのゲインを調整して、画像を最適化します。
- 設定を使用して画像を分割し、両方のチャンネルを表示し、細胞質または液胞に蛍光強度の飽和がないことを確認します。彩度は赤い点で表示されます。レーザー強度を下げて、赤い点の数を最小限に抑えますが、細胞とファゴソームははっきりと見えるほど明るくなります。
- 問題がなければ、「実験を開始」をクリックします。9タイルのスキャン画像が生成されます。2 つのチャンネルの合成画像 (jpeg や tiff ではない) を含む、ソフトウェアが推奨する複雑なファイルとして画像を保存します。
6. キャリブレーション実験
- カンジダ菌のみでpH標準曲線を作成します。
- 表1に従って、pH 3.0から13.0までの緩衝液を調製します。
- HKC-S-1を1アリコート(100μL)お召し上がりください。17,200 x gで1分間スピンダウンします。割り当てられたバッファーの500μLに再懸濁します。
- 最も低いpH範囲から始めて、懸濁液を前処理した1つのウェル(ステップ4.2から)に添加します。スライドを共焦点顕微鏡の37°Cに設定された加熱ステージに置きます。
- 蛍光を毎分10分間記録し、各バッファーについて繰り返します。
- サポニン標準曲線。
- 1 x 107 ヒト好中球5を単離し、最低pH緩衝液1 mLに再懸濁します。
- 好中球のファゴソームpHを測定するには、セクション4で説明されている方法に従ってください。
- カンジダ懸濁液と20分間インキュベートした後、0.3%サポニン(10%ストック15μLを前処理ウェル1つ(ステップ4.2))にディッシュに加え、37°Cで20分間インキュベートします。10分間、1分ごとに画像を撮ります。バッファごとに繰り返します。
- 高K+/ニゲリシン法を用いた細胞質pH標準曲線5,18,19.
- 表1に記載されているpH 4.0から13.0までの緩衝液を調製します。
- 手順4.1〜4.7に従い、前処理されたウェルに好中球のみを残し、各ウェルに異なるバッファーを含めます。スライドを37°Cの加熱ステージに加え、10分間、毎分蛍光を記録します。
- 注:細胞質のpHが外部溶液で安定するまでに時間がかかる場合がありますが、この時点以降、S-1比の値は一定になります。各実験で細胞外HKC-S-1を測定することは、添加された阻害剤がS-1放出蛍光を妨げたり、バッファーのpHに影響を与えたりしないことを確認するためのコントロールとして役立ちます。
7. 画像解析
注:ここでは、フリーソフトImageJを使用した画像解析(蛍光の定量)の手順が提供されています。ImageJの使用を推奨します。
- 開発者の指示に従って、ImageJバージョン>1.46rをダウンロードしてインストールします(https://imagej.nih.gov/ij/)。このプロトコルに添付されている「Phagosomal measurement」という補足コードファイルをインストールします。
- 画像Jを開き、解析用に選択した画像ファイルをツールバーに読み込みます。2 つのチャネルを組み合わせるには、Image>Color>Make コンポジットを使用します。
- 結果を保存するファイルを右クリックして選択します。
- ツールバーの線ツールをクリックし、ダブルクリックして幅を「2」に増やします。
- ファゴソームの幅に線を引き、右クリックして「pHを測定」します。2つのチャンネルの平均強度が取得され、その比率はImageJのコードファイルによって自動的に計算されます。
- 測定が終了したら、右クリックして「ファイルを保存」を選択します。
- ファゴソーム領域を測定するには、ツールバーの4番目のアイコンを使用して、領域の周りにフリーハンドで描画します。右クリックして「measure area」を選択します。
メモ: 結果は保存され、選択したディレクトリにログファイルが生成されます。結果は、スプレッドシート、R、または同等のソフトウェアを使用して処理できます。蛍光比と pH の関係はほぼシグモイドであり、ImageJ 分析によって生成された比率値は、一般化ロジスティック関数またはシグモイド関数を使用するか、線形スプライン補間またはキュービクスプライン補間によって pH に変換できます。 - 細胞質を測定するには、細胞質を横切る線を引き、右クリックして「pHを測定」します。
結果
図1は、異なる由来の好中球のスナップショットを示しており、ファゴソーム環境が多様であることを実証しています。定量分析を容易にするためには、ウェルに適切な数の細胞を播種することが重要です。細胞数が多すぎると細胞が重なり合い、封入されたファゴソームを正確に観察することが困難になります。一方で、細胞数が少なすぎれば、当然ながら得られる結果が少なくなります。特に、すべての好中球が食作用を行うわけではないため注意が必要です。図2は、飽和状態にある画像です。これは、（材料リストで推奨されている顕微鏡ソフトウェアまたは同等のソフトを用いて）画像を2つのチャネルに分割することで評価でき、赤色の点で最大蛍光が検出された箇所が示されます。この問題は、レーザー強度を下げることで解消できます。さまざまな緩衝液系を用いた検量線は図3に示されており、これはLevine et al.5から改変したものです。エラーバーは、測定値間に蛍光強度のばらつきがあることを示しています。図4は、ファゴソームのpHと面積のデータの提示例です。この手法では、個々の測定値を表示し、その上にボックスプロットを重ねて表示させることができます。また、データはヒストグラム形式の棒グラフで表示することも可能です。
図1：ヒトおよびマウス好中球の代表的なスナップショット画像。右端にあるのは、pHに対応するS-1染色ファゴソームのおおよその色を示す定性的な視覚的キーである。黄色はより高い酸性度を、赤色はより高い塩基性度を示す。( A ) は、食作用から20分後の Hvcn1-/- マウス骨髄好中球である。ファゴソームは非常に赤く、塩基性で、腫脹している。画像右下の赤色の矢印は細胞内の Candida を、左上の矢印は細胞外粒子を指している。( B ) は、 Candida を取り込んだ野生型マウス骨髄好中球であり、 Hvcn1-/- 細胞よりも塩基性がかなり低い。( C ) は、食作用後の同じ時点におけるヒト末梢血好中球である。これらはマウス野生型細胞よりもわずかに塩基性が高いが、ファゴソームは依然として Hcvn1-/- 細胞ほど大きくなく、赤くもない。( D ) は、5 µM diphenylene iodonium (DPI) 存在下で Candida を食作用したヒト好中球である。すべてのファゴソームは非常に酸性で、pHは6以下である。この薬剤はNADPHオキシダーゼを阻害するため、代償的なイオン移動が起こらない。ファゴソームに融合した酸性顆粒から放出されたプロトンが酸性pHの原因となり20、DPI処理によってファゴソーム膜へのV-ATPaseのリクルートが増加する9。また、細胞質は他の条件の細胞と比較してより塩基性に sichtbar である。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2： Hvcn1-/-マウス骨髄好中球の過飽和。蛍光データが過飽和している画像は、解析から除外することが重要です。セクション5.3で説明したように、合成画像は2つの画像（左上、赤色の矢印）に分割され、両方のチャンネルが個別に表示されます。このソフトウェアでは、レンジインジケーターがオン（左下、赤色の矢印）になっており、過飽和しているピクセルは明るい赤色で表示されます。両方のチャンネル（1および2）に過飽和が見られます。右下には、一部の細胞と細胞外のCandidaの拡大図が表示されており、矢印で影響を受けている領域が示されています。これらの点を解析すると、誤った比率測定につながります。こちらをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
図3：S-1蛍光比をpH測定値に変換するための標準校正曲線。異なるバッファー（「Tris」と表記）中でのCandida単独の場合と、サポニンで細胞を透過性にした場合（「Saponin」）の標準曲線は非常に類似しており、細胞内外（ファゴソームおよび細胞外培地）のS-1読み取り値が同等であることが示されている。エラーバーは平均値 ± SDを表す。細胞質（「Cytoplasm」）でテストした場合、S-1比/pH曲線は短縮されるため、画像解析において考慮する必要がある。この図はLevine et al.5から改変したものである。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
図 4: ファゴソームのpHおよび面積の定量化。この図はデータ提示の一例である。グラフはプログラミングソフトウェアRを用いて作成した。A: Hvcn1-/-マウス骨髄好中球、B: 野生型マウス骨髄好中球、C: ヒト末梢血好中球、D: 5 µM DPI処理したヒト好中球におけるファゴソーム比と対応するpHを示す（n = 3/300）。個々の測定値は小さな正方形で示され、その上に中央値と四分位範囲を示す箱ひげ図を重ねている。赤色のバーは平均値を表す。図 1の画像に見られるように、Hvcn1-/-細胞は野生型マウスおよびヒト好中球と比較して、非常にアルカリ性のファゴソームを有している。また、これらはより大きなファゴソーム面積を有している（図 4B、n = 3/300）。ヒト好中球のファゴソームは野生型マウス好中球よりもわずかにアルカリ性が強く、サイズも大きいが、DPIでインキュベートしたヒト好中球は、非常に酸性で小さなファゴソームを有している。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。
| 平衡塩溶液 (BSS) バッファー | |||
| NaCl | 156 mM | ||
| KCl | 3 mM | ||
| MgSO4 | 2 mM | ||
| KH2PO4 | 1.25 mM | ||
| CaCl2 | 2 mM | ||
| Glucose | 10 mM | ||
| Hepes | 10 mM | ||
| NaOHまたはHClを用いてpH 7.4に調整 | |||
| YPDブロス | |||
| YPD broth | 50 g | ||
| 蒸留水 | 1 L | ||
| 121 °Cで15分間オートクレーブ滅菌 | |||
| YPD寒天培地の場合：オートクレーブ前にアガー 15 g/Lを添加 | |||
| 10% デキストラン溶液 | |||
| デキストラン（臨床グレード） | 50 g | ||
| NaCl | 4.5 g | ||
| 蒸留水 | 500 mL | ||
| ガラス瓶に入れ、121 °Cで15分間オートクレーブ滅菌 | |||
| 2x 生理食塩水溶液 | |||
| NaCl | 18 g | ||
| 蒸留水 | 1 L | ||
| ガラス瓶に入れ、121 °Cで15分間オートクレーブ滅菌 | |||
| 10% サポニンストック溶液 | |||
| BSSバッファー | 50 mL | ||
| サポニン | 5 g | ||
| BSSバッファーを37 °Cに加熱し、サポニンを添加して混合する。 | |||
| 保存剤として0.1% アジ化ナトリウムを添加し、混合液を4 °Cで保存する。 | |||
| 校正用バッファー | |||
| Candida 標準曲線 | |||
| まず、各バッファーの0.15 Mストック溶液を調製する | |||
| 0.15 M NaCl溶液を調製する | |||
| 最終容量 15 mL：目的のバッファー溶液 0.15 Mを5 mL ＋ 0.15 M NaCl溶液 10 mL | |||
| pH 3 | 100 mM NaCl | 50 mM glycine | |
| pH 4 | 100 mM NaCl | 50 mM acetate | |
| pH 5 | 100 mM NaCl | 50 mM acetate | |
| pH 6 | 100 mM NaCl | 50 mM acetate | |
| pH 7 | 100 mM NaCl | 50 mM Tris | |
| pH 8 | 100 mM NaCl | 50 mM Tris | |
| pH 9 | 100 mM NaCl | 50 mM Tris | |
| pH 10 | 100 mM NaCl | 50 mM glycine | |
| pH 11 | 100 mM NaCl | 50 mM phosphate | |
| pH 12 | 100 mM NaCl | 50 mM phosphate | |
| pH 13 | 100 mM NaCl | 50 mM phosphate | |
| 細胞質標準曲線 | |||
| あらかじめ調製した0.15 Mストックバッファー溶液を使用する | |||
| 0.15 M KCl溶液を調製する | |||
| 最終容量 15 mL：目的のバッファー 0.15 Mを5 mL ＋ 0.15 M KCl溶液 10 mL | |||
| エタノール溶液の nigericin 10 mMストックを用い、各最終容量溶液に15 µL添加する | |||
| pH 3 | 100 mM KCl | 50 mM glycine | 10 µM nigericin |
| pH 4 | 100 mM KCl | 50 mM acetate | 10 µM nigericin |
| pH 5 | 100 mM KCl | 50 mM acetate | 10 µM nigericin |
| pH 6 | 100 mM KCl | 50 mM acetate | 10 µM nigericin |
| pH 7 | 100 mM KCl | 50 mM Tris | 10 µM nigericin |
| pH 8 | 100 mM KCl | 50 mM Tris | 10 µM nigericin |
| pH 9 | 100 mM KCl | 50 mM Tris | 10 µM nigericin |
| pH 10 | 100 mM KCl | 50 mM glycine | 10 µM nigericin |
| pH 11 | 100 mM KCl | 50 mM phosphate | 10 µM nigericin |
| pH 12 | 100 mM KCl | 50 mM phosphate | 10 µM nigericin |
| pH 13 | 100 mM KCl | 50 mM phosphate | 10 µM nigericin |
| すべての校正溶液のpHをHClまたはNaOHで調整する | |||
表1：緩衝液の組成。この表は、プロトコルで使用されるさまざまな緩衝液の適切な組成について説明しています。
補足コードファイル。このファイルには、画像解析に必要なA. P. Levineによって作成された多数のマクロが含まれています。著者らは、このコードの使用に関連するいかなる問い合わせにも喜んで対応いたします。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。
ディスカッション
適切な試薬、顕微鏡設定、および校正実験が設定されれば、この方法は比較的簡単に実行できます。重要な手順には、色素に過負荷がないことを確認するために カンジダ にS-1をラベル付けすること、画像のキャリブレーション、分析が含まれます。
S-1は、よりアルカリ性のpH環境に適した試薬であり、好中球21 にとって特に重要ですが、特定の細胞タイプでの使用は制限されます。マクロファージファゴソームなどのより酸性の環境には、pKa22が低いため、SNARF-4またはS-4がより適しています。さらに、より正確な細胞質測定値を得るには、S-1の標準曲線が蛍光比がpH 6を下回って頭打ちになり始めることを示しているため、S-4を使用することをお勧めします(図3)。2',7'-ビス-(2-カルボキシエチル)-5-(および-6)-カルボキシフルオレセイン(BCECF)やpHrodo Redなどの他の色素も、酸性が予想される状況により適している可能性があります。しかし、細胞質染色は、 カンジダを含むファゴソームを正しく同定するために依然として必要です。
ファゴソーム pH インジケーターの重要な特徴は、反応性ファゴソーム環境によって不可逆的に変化しないことです。S-1は好中球環境に耐性があるようです。これはLevineらによって示されています。5 (参考文献5 の補足ビデオ 4 を参照) は、Hvcn1-/- 好中球による S-1 標識カンジダ粒子の食作用およびその後の放出を示します。貪食すると、粒子は黄色/オレンジ色から赤色(中性からアルカリ性pH)に変わりますが、粒子が好中球によって放出されると元の色に戻ります。
S-1の使用に関連するいくつかの制限について言及することが重要です。この色素は2つの発光スペクトルを持ち、レシオメトリック測定が可能であるという事実は利点ですが、画像を取得するには専門の機器が必要です。実験に使用される顕微鏡は、2つの画像を同時に、またはわずかな時間遅延で記録できなければなりません。著者らは、このプロトコルを試みる研究者が共焦点顕微鏡の使用経験があるか、訓練を受けた専門家にアクセスできると想定しています。顕微鏡ごとに異なるため、特定の顕微鏡パラメータをすべてリストすることはできません。色素が細胞質に拡散することを可能にするS-1に結合したアセトキシメチルエステルは、細胞質内の非特異的エステラーゼによって分解され、蛍光分子を形成します。アルカリホスファターゼなどのエステラーゼは、細胞培養培地を補うために使用されるヒト血清およびウシ胎児血清に存在します。したがって、細胞にS-1-AM(セクション4.5)をロードする培地には、血清が含まれていてはなりません。このプロトコル全体で使用されるバランスのとれた塩溶液よりも、それらを維持するためにより栄養豊富な培地を必要とする細胞を使用する場合、これは困難であることが判明する可能性があります。同様に、フェノールレッドなどの他の蛍光媒体成分は、S-1測定を妨げる可能性があります。
図3のエラーバーは、各pHでの比率測定値に多少のばらつきがあることを示しています。液胞間変動を克服するには、各実験の適切な数の繰り返し(少なくともn = 3)と、各実験でできるだけ多くの個別測定が必要です。したがって、各条件と、カンジダ菌を1つしか含まないように見えるファゴソーム領域をできるだけ多く測定する少なくとも100のファゴソームのpHを測定することをお勧めします。定量のために測定するファゴソームは、カンジダ粒子を完全に飲み込んだファゴソーム(つまり、細胞質に完全に囲まれたファゴソーム)である必要があります。定量用の細胞/ファゴソームの選択における意図しないバイアスを軽減するために、すべての分析は実験条件を知らせずに実行する必要があります。
ここでは、全血のデキストラン沈降とそれに続く密度勾配による血漿層の遠心分離による好中球の単離について説明します。この技術は、好中球の純粋な(>95%)集団を迅速かつ効率的に生成するため、他の密度勾配式による全血遠心分離や、抗体または磁気ビーズを含む専門キットを使用した好中球の陰性選択など、他の方法も利用できます。ただし、後者は、好中球を日常的に分離するほとんどのグループにとって法外に高価になる可能性があります。さらに、私たちは採血チューブに抗凝固剤ヘパリンを使用していますが、他の研究者はエチレンジアミン四酢酸 (EDTA) または酸性クエン酸ナトリウム (ACD) の使用に慣れている場合があります。さまざまな方法から選択できるため、研究者の個人的な好み次第です。
さらに、好中球を分離して操作するときは、過度の活性化を避けるためにある程度の注意を払って取り扱う必要があります。予防措置には、プラスチック製品のみを使用し、ガラスを使用しないことが含まれます。すべてのバッファーをフィルター滅菌して、汚染エンドトキシンを除去します。好中球を回転させるときは、過度の振動を避けるために遠心分離機のバランスが取れていることを確認してください。遠心分離後に好中球がペレットにとどまる時間を可能な限り制限します。好中球を5 x 106 / mLを超える溶液に維持しないでください。分離後できるだけ早く実験を行います。
この方法は、顕微鏡で37°Cに設定された加熱ステージを使用し、校正ステップで説明されているように、同じ位置から30〜60秒ごとにスナップショットを撮ることにより、pHおよびファゴソーム面積の経時的な変化を測定するように適応させることができます。また、理論的には、96ウェルプレートなどのハイスループット実験や、S-1をpH指示薬として使用できるフローサイトメトリー実験にも適応できます23。ただし、これらの設定では、個々の細胞活性への重点は、細胞集団に対するよりグローバルな影響に置き換えられます。
この方法は、個々の研究者が関心のある分野に合わせて適応できる比較的単純な実験セットアップを提供することを目的としています。研究者は、好中球の食体のpHと面積を調査しながら、細胞内カルシウム濃度などの他のイオンの動きも測定したい場合があります。Indo-1など、共焦点顕微鏡で容易に利用できる蛍光Ca2+ 指示薬がいくつかあり、これも400nmと475nm24で二重発光スペクトルを持っています。これらの発光波長はS-1発光スペクトルと重なりませんが、励起波長はスペクトルの紫外線(UV)端にあるため、細胞に損傷を与える可能性があり、UVレーザーはすべての顕微鏡で一般的ではありません。細胞内カルシウムフラックスを測定するためのさまざまな指標の包括的なレビューは、Takahashi らによってカバーされています 。25 およびヒルソン ら。26.
結論として、Nunesらのように、さまざまな蛍光色素を使用してファゴソームpHを測定するために利用できる他の方法があります。13 と他のグループ27,28 を実証しました。他の研究者もS-1を使用して、細胞質ゾルのpH29またはファゴソームのpH14を測定しています。しかし、このプロトコルは、サイトゾルとファゴソームの両方のpHを同時に測定する点でユニークであり、ファゴソーム断面積の変化を観察し、野生型およびHvcn1-/-マウス好中球、およびNADPHオキシダーゼが機能する有無にかかわらずヒト好中球を区別する機会を提供する。
開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
この研究は、ウェルカム・トラスト、バイオテクノロジー・生物科学研究評議会、アーウィン・ジョフィ記念フェローシップから資金提供を受けました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Candida albicans ATCC 10231 Vitroids 80 CFU | Sigma-Aldrich | RQC14003-10EA | メーカーの指示に従って、スプレッド寒天プレートに直接置き |
| YPDブロス | Sigma-Aldrich | Y1375 | メーカーの指示に従って、さまざまなプロバイダーが存在します |
| デキストラン 臨床グレード MW = 200,000-300,000 | MP バイオメディカル | 2101514 | 手袋をご使用ください |
| 輸液用ヘパリンナトリウム溶液(防腐剤不使用)、1,000 IU/mL | Fannin, Wockhardt UK Ltd | FP1077 | UCH入院薬局から購入しました |
| SNARF-1 カルボン酸、酢酸、スクシンイミジルエステル - 特殊包装 | Thermo Scientific/Invitrogen | SS22801 | 手袋 |
| 5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | Thermo Scientific/Invitrogen | C1272 | 手袋 |
| Vivaglobin human IgG 160 mg/mL solution | CSLベーリング | は贈り物として受け取った | 様々なプロバイダーが存在する |
| 正常なマウス血清 | アブカム | ab7486 | 様々なプロバイダーが存在する |
| Lymphoprep(密度勾配中) | Alere Ltd | 1114547 | 無菌状態を保ち、直射日光から遠ざけ、Ficoll-Paque |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic、手袋を使用し、様々なプロバイダーが存在する |
| サポニンが存在する | Sigma-Aldrich | 47036 | 有毒、手袋を使用し、さまざまなプロバイダーが存在する |
| ジメチルスルホキシド (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | 有毒、手袋を使用し、さまざまなプロバイダーが存在する |
| 4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸 (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | さまざまなプロバイダーが存在する |
| トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン (トリス) | Sigma-Aldrich | T1503 | さまざまなプロバイダーが存在します |
| 塩化カリウム (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | さまざまなプロバイダーが存在する |
| 塩化ナトリウム (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | さまざまなプロバイダーが存在する |
| 塩化マグネシウム (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | さまざまなプロバイダーが存在する |
| 硫酸マグネシウム (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | さまざまプロバイダーが存在する |
| リン酸二水素カリウム (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | さまざまなプロバイダーが存在する |
| 塩化カルシウム (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | さまざまなプロバイダーが存在する |
| グルコース | Sigma-Aldrich | D9434 | さまざまなプロバイダーが存在する |
| 無臭エタノール | Sigma-Aldrich | 2860 | 様々なプロバイダーが存在する |
| ジフェニレンヨードニウム(DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | 様々なプロバイダーが存在する |
| 塩化亜鉛 | Sigma-Aldrich | 208086 | 沈殿させるので、リン酸塩ベースの緩衝液で希釈しないでください |
| プロバイダーが存在する | |||
| レーザースキャン共焦点顕微鏡 (ツァイス LSM 700) | カールツァイス | 顕微鏡は555 nmで励起し、2つのチャネルで同時に発光を測定できなければならない（560-600 nm、>610 nm) | |
| 同上 & マイクロ; スライド 8 井戸 ibiTreat | シスル科学 | IB-80826 | 他の適切なイメージング皿は代用することができます |
| Soniprep 150 | MSE | 任意の適切な超音波処理器は | |
| TC20自動セルカウンターで十分です | バイオラッド | 様々なプロバイダーが存在する | |
| 1.5 mL タンパク質 LoBind チューブ | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | カンジダとして特別に使用され、通常のエッペンドルフに固執することができます |
参考文献
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