方法論記事

反応性アストロ サイトと増殖の in Vitro虚血のような条件下での監視

DOI：

10.3791/55108

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2017年10月21日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Universidad Central del Caribe, 2Department of Biochemistry, School of Medicine, Universidad Central del Caribe, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Medical Sciences, Campus, University of Puerto Rico

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

虚血性脳卒中、酸素無グルコース (OGD) に影響を受ける脳の領域にアストロ サイトの特定の貢献がさらされて複雑なイベントは調査しにくい。孤立したアストロ サイトを取得し、反応性、OGD 条件下での増殖を研究する手法を紹介します。

要約

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虚血性脳卒中は血栓や塞栓脳の部分への血流を妨害によって引き起こされる複雑な脳損傷です。これは、酸素とブドウ糖のエネルギー不全や神経細胞死を引き起こすの剥奪に します。虚血性脳卒中の侮辱後、アストロ サイトは反応になるし、それが発展するにつれ、損傷部位の周囲増殖します。このシナリオの下では、虚血にさらされている脳の領域にアストロ サイトの特定の貢献を研究することは困難です。したがって、プライマリ アストロ サイトの反応と酸素無グルコース (OGD) と呼ばれる虚血のような環境の生体外モデルの下で増殖を検討する方法を紹介します。アストロ サイトは 1-4 日から分離された-古い新生児ラットと非特異的アストロ サイト細胞の数は、アストロ サイト選択的マーカー グリア線維性酸性蛋白質 (GFAP) と染色性が核を使用して評価されました。公開されている酸素の割合のと同様、OGD 条件に服従するアストロ サイトの期間をカスタマイズできます。この柔軟性により、細胞の試験管内のさまざまなグループの虚血のような条件の期間を特徴付けるための科学者です。この資料では、反応性アストロ サイト、肥大形態と増殖細胞核抗原 (PCNA) を用いた蛍光抗体法によって測定される増殖を誘発する OGD の時間枠について説明します。増殖、ほかアストロ サイトはエネルギーと酸化ストレスを受けるし、細胞培地に可溶性因子を放出し OGD に対応します。このメディアを収集し、分子細胞間相互作用のない初代神経細胞培養アストロ サイトによるリリースの影響を分析するために使用することができます。要約すると、傷害に孤立したアストロ サイトの役割を理解するこの一次電池文化モデルを効率的に使用できます。

概要

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ストロークは、「、急性神経障害血管由来の症状と脳の焦点区域の関与に対応する徴候の突然または急速な開発と」1,2として定義されます。ストロークの 2 つの種類があります: 出血性および虚血性。動脈瘤や、動脈の破裂の後弱体化を伴う動静脈の故障により血管機能不全が引き起こされるときほとんどの場合、死につながる3出血性脳卒中と呼びます。血栓または塞栓は、血流を妨げ、脳の領域に酸素とグルコースの一時剥奪の原因と呼びます虚血性脳卒中4。影響を受ける地域や恒常性、代謝の不均衡、エネルギッシュな不全、神経細胞死および炎症5患者6生涯障害を誘発することができますに虚血性の芯線の周りの細胞に栄養を与えるに失敗しました。

虚血性脳卒中は多因子性傷害を含むいくつかの種類の細胞が反応し、異なる時点でその効果を発揮します。多くの相互作用は、個々 の細胞の挙動を調べるための困難な環境を作成します。だから、どのようにこのような複雑な環境下で特定のセルタイプの寄与を調べたか?虚血の認められた体外モデルは、平地の環境に、細胞の修復に続く一定の期間酸素とグルコースの剥奪 (OGD) へ細胞を公開するための構成されます。このシステムは、脳虚血再潅流をシミュレートします。この方法では細胞や組織が削除されるは特殊な低酸素室を用いた酸素環境のブドウ糖自由な媒体に公開されます。最大 24 h で、テストしたい仮説によって数分から OGD インキュベーション時間は異なります。研究が示している OGD 回数に応じて、平地環境、ストローク (すなわち、急性または亜慢性) の特定の表現型が実現できます。平地の条件に後部修復 OGD にさらされる主の孤立したアストロ サイトは、ストローク体外7を模倣するよく研究細胞モデルです。OGD を使用してストロークのような環境下での隔離されたセルの独立した分子メカニズムを明らかにすることができます。

アストロ生物学の知識が増えると、彼らがシナプスを維持し、神経の修復、開発、および可塑性8を維持するために重要なことは明白になりました。通常の条件下でアストロ サイトは解放し、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、gliotransmitters、新陳代謝のバランスとシナプス5,9内の恒常性を維持に対応します。虚血性脳卒中などの急性 neuroinflammation でこれらの細胞が反応になって、長期的な過剰発現のグリア線維性酸性タンパク質 (GFAP) を示し肥大の形態5,10,11,12. 虚血性梗塞が発展すると、アストロ サイトによって提供される恒常性、通常グルタミン酸取り込み、エネルギー代謝、活性と抗酸化活性13の交換に関する影響になります。

再アクティブ化されたアストロ サイトは、白血球の破壊領域14に向けて移行中周囲の梗塞組織増殖します。アストロ サイトの増殖は、増殖細胞核抗原 (PCNA)、キ67、ブロモデオキシウリジン (BrdU)15などのマーカーを使用して測定できます。この増殖応答が時間依存的に生成されます、それグリア瘢痕、外傷9後破損したサイトの実質に沿って不可逆的反応性アストロ サイトの配列を形成できます。この傷跡の初期の機能の 1 つはこの区域から免疫細胞漏出を制限します。しかし、研究では、傷跡が拡張、軸索の成長を阻害する分子をリリースおよび軸索が16患部の周りを拡張することを防ぐ物理的な障壁を作成する軸索の物理的な障害になることを示しています。それにもかかわらず、脊髄損傷後完全にグリア瘢痕の形成を防止するが17軸索の再生を損なうことができるを示す科学的な証拠があります。したがって、傷害の検討の枠組みに、測定する特定のアストロ サイトの応答コンテキストを考慮されなければなりません。

酸素無グルコース後アストロ サイトの個別の機能の研究に提示された方法論を適用できるし、調査官が答えたい質問に応じて変更することができます。たとえば、形態変化、OGD 時期を表明したマーカーのほか OGD にさらされているアストロ サイトから清さらに分析できる可溶性因子これらの細胞によって解放または評価するために調節されたメディアとして使用を識別するために、他の脳細胞に影響します。このアプローチにより、支配すると虚血性脳卒中のシナリオでその応答を調節する因子の解明につながる可能性がアストロ サイトの反応性に関する研究です。

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プロトコル

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生後ラット (スプレイグ ドーリー) 1-4 日古い皮質を分離する使用されます。安楽死の方法は斬首、NIH ガイドラインで認められています

。

1。 器具用材料手術準備

  1. 定置滅菌器オートクレーブ (温度: 121 ° c、圧力: 15 psi、時間: 30 分) スチール ボックスまたは瞬時滅菌袋のシールを使用。材料表 の材料を参照してください
    2. 。

2。DMEM 準備完了

  1. 700 mL オートクレーブ処理した水を含む 1 リットル ビーカー、追加ダルベッコ ' s 修正イーグル ' s 常温中粒
    2. 。
  2. 磁性攪拌器で、溶液を攪拌しながら炭酸水素ナトリウム 3.7 g/L を追加
    3. 。

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結果

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培養アストロ サイトの主な懸念の 1 つは、ニューロン、オリゴデンドロ サイト、線維芽細胞、ミクログリアなど他の細胞の存在です。図 1、ラット皮質から隔離されたセルごとに 3 日間メディアの変更があったし、か未処理または処理追加 LME 1, 24 時間後の細胞 GFAP の immunostained, DAPI で counterstained。未処理の細胞は、LME 処理細胞を示した 8% 陽性細胞 39% 非 GFAP の平均を示した。これらの結果は、どのように LME 治療とメディアは 4.75 倍、濃縮アストロ文化生産によって効果的に減らされた非 GFAP 陽性細胞を変更を示します。1 h や 6 h の OGD がこの方法論後アストロ サイトの生存率を与える影響かどうかは、図 2は、アストロ サイト文化、侮辱後 24 h の MTT の試金を示しています。二回とも使用できるアストロ サイトの反応性を研究する表示の状態で生存率に有意差が見つか...

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ディスカッション

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このプロトコルでは、ラット皮質アストロ サイトの分離について説明します。このメソッドは、線維芽細胞、オリゴデンドロ サイト、ミクログリアなど他の細胞の種類と汚染を減らすために重要です。ミクログリアの数を減らすためには、いくつかの手順を取ることができる: メディア、揺れ、軌道と化学治療を変更します。選択的細胞マーカーを用いた蛍光抗体法によって、最も顕著な細胞汚染物質文化の純度を確認すると、実験を実行できます。例えば、イオン化カルシウム結合アダプター分子 1 (Iba-1) に対する抗体は、ミクログリアを検出する使用できます。神経細胞死は文化初期段階から始まりますとこれらの細胞がフラスコめねじオリゴデンドロ サイト前駆細胞 (Opc) と共に除去してメディア変更 3 日目31。Oligodendrocytic の前駆細胞は、olig2 など NG2 抗体を使用して識別できます。GalC は未熟か成熟オリゴデンドロ サイトを識別するために使用することができますが、この文化段階でこれらで発見される可能性はありません。または、非 GFAP 陽性細胞を定量化することができ、汚染物質を推定できます。この...

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者のテクニカル サポート パオラ ・ ロペス Pieraldi を感謝したいです。A.H.M. は助成金 8G12MD007600 と U54 NS083924 このパブリケーションをサポートに感謝しています。NIH NIMHD-G12 MD007583 助成施設支援に感謝いたします。D.E.R.A. は、NIHNIGMS R25GM110513 によって提供される交わりに感謝しています。共通の計測領域の使用のため感謝しております、博士プリシラ サナブリアの RCMI プログラムでの光イメージング施設の使用のための援助を与える G12MD007583。さらに、私たちは撮影・編集視覚的プロトコルの彼の顕著な役割のホセパディーヤを感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
手術用器具 - ステップ1
手術用ハサミ5.5インチRoboz CompanyRS-6812ネズミの首を切るために使用されるツール。
湾曲した鉗子7インチ Roboz CompanyRS-5271頭蓋骨を取り外した状態でラットの皮膚を保持します。
マイクロ解剖ハサミ4インチ Roboz CompanyRS-5882ラットの皮膚と頭蓋骨の両方を切断します。
マイクロ解剖鉗子4 "角度付き、細かいシャープ ロボズ社RS-5095頭蓋骨を取り外した状態でラットの皮膚を保持します。
マイクロ解剖鉗子 4インチ わずかに湾曲した 0.8Roboz CompanyRS-5135皮質を分離するために使用されるツール。
マイクロ解剖ピンセットRoboz CompanyRS-4972脳の髄膜を剥がします。
解剖顕微鏡オリンパスSZX16皮質から髄膜を除去するために重要です。
DMEMの準備 - ステップ2
ダルベッコ'のモディファイドイーグル」s Medium (DMEM)GibCo.会社11995-065細胞の成長をサポートします。
重炭酸ナトリウムSigma-Aldrich CompanyS7277細胞培養培地用サプリメント。
ウシ胎児血清(FBS)GibCo.会社10437-010細胞培養用の血清サプリメント。
ペニシリン-ストレプトマイシン ギブコ。会社15140-148細胞培養中の細菌の増殖を阻害します。
0.22umの細孔を持つフィルターシステム 1Lコーニング431098
アストロサイト培養 - ステップ 3
Serological ピペット 5mLVWR89130-896DMEMを細胞の入った容器にピペットで移します。
血清ピペット 10mLVWR89130-898DMEMを細胞の入った容器にピペットで
血清ピペット 25mLVWR89130-900DMEMを細胞の入った容器にピペットで
遠心分離機の円錐管15mLサンタクルスバイオテクノロジーsc-200250
セーフロックチューブ1.5mLエッペンドルフ022363204
バリアチップ200 uLサンタクルスバイオテクノロジーsc-201725
バリアチップ1mLサンタクルーズバイオテクノロジーsc-201727
バイオハザードオレンジバッグ 14 x 19インチVWR14220-048
60mmのペトリ皿の鷹の351007
の生殖不能のガーゼのパッドHoneywell社の安全89133-086
Stomacher 80 BiomasterのSewarの実験室システム030010019脳のティッシュを三面的に。
ストマッカー80ブレンダー滅菌バッグセワールラボシステムBA6040ストマッカーセルホモジナイザー用滅菌バッグ。
ビーカー 400mLパイレックス1000
滅菌細胞解離ふるい、メッシュ #60 Sigma-Aldrich CompanyS1020均一な単一細胞懸濁液を得るため。
滅菌細胞解離ふるい、メッシュ#100Sigma-Aldrich CompanyS3895均一な単一細胞懸濁液を得るため。
反転相顕微鏡ニコンエクリプス Ti-S細胞の汚染や異常な細胞増殖を確認します。
75cm2 滅菌フラスコファルコン353136
マルチウェルプレートファルコン353046
マイクロカバーグラス(カバースリップ)、18mm、丸型VWR48380-046
ブライトライン血球計算計シグマ・アルドリッチ社Z359629
パスツールピペットフィッシャー・サイエンティフィック13-678-20D
エチルアルコール シグマ・アルドリッチ社E7023
L-ロイシンメチルエステル塩酸塩 98% (LME)シグマ・アルドリッチ社L1002初代皮質アストロサイト培養におけるミクログリア細胞の排除を促進します。
シトシン &β;-D-アラビノフラノシド (Ara-C)Sigma-Aldrich CompanyC1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000Sigma-Aldrich CompanyP0899
Trypsin/EDTAGibCo.会社15400-054
トリパン ブルーシグマ-アルドリッチ カンパニーT8154
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 錠剤カルバイオケム524650
滅菌水シグマ-アルドリッチ カンパニーW3500
 OGD培地調製 - ステップ5
遠心分離機コニカルチューブ50mLVWR89039-658
ダルベッコ'修正されたイーグル」中性血糖Sigma-Aldrich CompanyD5030細胞の成長をサポートします。
重炭酸ナトリウムSigma-Aldrich CompanyS7277細胞培養培地用サプリメント。
ペニシリン-ストレプトマイシン ギブコ。会社15140-148細胞培養中の細菌の増殖を阻害します。
200mM L-グルタミン ギブコ。会社25030-081細胞の成長を補うアミノ酸。
ホスパヘット緩衝生理食塩水(PBS)錠剤Calbiochem524650
フィルターシステム 50mL 0.22um 細孔付きCorning430320
遠心分離機コニカルチューブ 50 mLVWR89039-658
シングルフローメーター Billups-RothenbergSMF3001酸素パージにおけるガス流量を測定します。
低酸素インキュベーターチャンバー StemCell27310細胞培養のための低酸素環境を生成します。
トレーサブルな溶存酸素計VWR21800-022
95% N2/5% CO2ガス混合物リンデ酸素の環境をパージします。
primary astrocyte immunofluorescence - step 6
Phosphate buffer saline (PBS) tabletsCalbiochem524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10%Sigma-AldrichHT501128細胞の固定に使用される溶液。
メタノール フィッシャーA4544溶液は細胞を固定するために使用されます。
非イオン性界面活性剤 (Triton X-100)Sigma-AldrichT8787
ウシ胎児血清 (FBS)GibCo.会社10437-010細胞培養用の血清サプリメント。
Anti-NeuNCell Signaling24307成熟ニューロンを検出し、アストロサイト培養の検証に役立ちます。
Anti-PCNACell Signaling2586増殖する細胞を検出します。
ヨウ化プロピジウム(PI)Sigma-Aldrich CompanyP4170アポトーシス染色。
Anti-Olig1AbcamAB68105成熟したオリゴデンドロサイトを検出します。
アンチイバ1+ワコー016-20001ミクログリア細胞を検出します。
Cy3と結合した抗GFAP Sigma-Aldrich CompanyC9205処理した細胞内の反応性アストロサイトを検出します。
Alexa Fluor 488Molecular Probe Life TechnologyA1101抗マウス二次抗体。
Alexa Fluor 555Molecular Probe Life TechnologyA21428抗ウサギ二次抗体。
4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)Sigma-Aldrich CompanyD9542核染色.
共焦点顕微鏡オリンパス
移します。移します。

参考文献

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GFAP PCNA

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