生理的酸素条件に曝露されたヒト細胞におけるキャップ結合タンパク質の解析

サマリー

ここでは、生理的酸素条件下でmRNAの5'キャップに結合する翻訳開始因子を分析するためのヒト細胞培養プロトコルを紹介します。この方法は、アガロース結合m⁷GTPキャップアナログを利用しており、キャップ結合因子とその相互作用パートナーの研究に適しています。

要約

翻訳制御は、特に細胞ストレスの期間中の遺伝子調節の焦点です。eIF4F複合体を介したキャップ依存性翻訳は、真核細胞でタンパク質合成を開始する最も一般的な経路ですが、この複合体のストレス特異的な変異が現在出現しています。アガロース結合m⁷GTP(5' mRNAキャップアナログ)からなるアフィニティー樹脂でキャップ結合タンパク質を精製することは、翻訳開始の制御に関与する因子を同定するための有用なツールです。低酸素症(低酸素)は、胎児の発育や腫瘍の進行時に遭遇する細胞ストレスであり、翻訳調節に大きく依存します。さらに、最近、ヒトの成体臓器は、細胞が日常的に培養される周囲の空気よりも低酸素に近い低酸素含有量(フィジオクシア1〜9%酸素)を持っていることが報告されました。低酸素eIF4F複合体(eIF4F^H)の特性評価が進む中、5' mRNAキャップを介した酸素依存性翻訳開始の理解への関心が高まっています。私たちは最近、酸素の利用可能性によって制御されるキャップ結合タンパク質を解析するためのヒト細胞培養法を開発しました。このプロトコルは、酸素への曝露を排除するために、細胞培養と溶解を低酸素ワークステーションで行うことを強調しています。液体培地がワークステーション内の雰囲気と平衡化するために、細胞を少なくとも24時間インキュベートする必要があります。この制限を回避するために、より短い時点が必要な場合は、事前に調整された培地(脱酸素化)を細胞に添加することができます。特定のキャップ結合タンパク質は、第2塩基との相互作用を必要とするか、またはm⁷GTPを加水分解する可能性があるため、精製プロセスで一部のキャップ相互作用器が見逃される可能性があります。酵素耐性キャップアナログに結合したアガロースをこのプロトコルで置換できます。この方法により、ユーザーはキャップ依存性翻訳に関与する新しい酸素調節翻訳因子を特定できます。

概要

翻訳制御は、特に細胞ストレス¹の期間中に、遺伝子発現の転写調節にも等しく重要なステップとして浮上しています。翻訳制御の焦点は、タンパク質合成の最初のステップは7-メチルに真核生物の開始因子4E（のeIF4E）の結合を伴う開始の律速段階（メートル⁷ GTP）のmRNA ²の5 'キャップであります。 eIF4EはeIF4A、RNAヘリカーゼ、およびeIF4Gを、他の翻訳因子と40Sは^{3リボソーム}の募集に必要な足場タンパク質を含んでeIF4Fという名前の三量体複合体の一部です。正常な生理的条件下では、mRNAの大半はキャップ依存性機構を介して翻訳されていますが、細胞ストレスの期間の下で人間のmRNAの約10％が^1,4- intiationキャップ非依存性翻訳される可能性があり5'UTRを含まれています。キャップ依存性翻訳は、歴史的に同義語となっていますOUのeIF4Fで、しかし、eIF4Fのストレス固有のバリエーションが話題に^5-8となっています。

様々な細胞ストレスはのeIF4E活性がラパマイシン複合体1（mTORC1）の哺乳類標的を介して抑制させます。このキナーゼは、その目標の一つ、4E結合タンパク質（4E-BP）の活性の増加をもたらすストレス、下損なわれる。非リン酸化4E-BPはのeIF4EとブロックのeIF4Gは、キャップ依存性翻訳^9,10の抑制を引き起こすと相互作用する能力に特異的に結合します。興味深いことに、eIF4E2（または4EHP）という名前のeIF4Eのホモログは、おそらく、それがストレス媒介抑制を回避することができ、4E-BP ¹¹のためのはるかに低い親和性を有します。確かに、最初は原因のeIF4G ¹²との相互作用の欠如への翻訳のリプレッサーとして特徴づけ、eIF4E2は、低酸素ストレス^6,13の間にそれらの3 'UTR中のRNAの低酸素応答エレメントを含むmRNAの何百もの翻訳を開始します。この活性化IeIF4G3、RNA結合タンパク質モチーフ4、および低酸素誘導因子、低酸素eIF4F複合体を構成する（HIF）2α、またはeIF4F ^{H 6,13}との相互作用を介して達成秒。通常の条件下ではリプレッサーとして、eIF4E2はGIGYF2とZNF598 ¹⁴と結合します。これらの複合体は、部分的には、アガロース結合M ⁷ GTPの親和性樹脂を介して同定されました。この古典的な方法^15は、翻訳の分野における標準であり、最高の、最も一般的にプルダウンでキャップ結合複合体を単離するための技術を使用し、in vitroでの結合アッセイ^16-19です。キャップ依存性翻訳機構の間に変化する部分^6-8,13のように柔軟で適応浮上しているように、この方法は急速にストレス応答に関与する新規キャップ結合タンパク質を同定するための強力なツールです。いくつかの真核生物のモデル系は、このようなストレス応答のためeIF4E2ホモログを使用するように見えるようさらに、eIF4Fの変動は、広い意味を持っている可能性がシロイヌナズナ ²⁰として、S.ポンベ ^21は 、Dは ²² ショウジョウバエ 、およびCは ^{23 エレガンス} 。

証拠は、eIF4Fの変動がストレス条件に厳密に限定されないが、通常の生理²⁴に関与することを示唆しています。 （微小電極を介して測定）（キャピラリー端で）または組織内の組織への酸素供給は、脳²⁵で2から6パーセントから変化し、肺²⁶内^の百分の3から12まで、腸^27、4％でで3.5から6パーセント肝臓^28、腎臓²⁹内の7から12までパーセント、筋肉³⁰で4％、および骨髄³¹で6から7パーセント。細胞およびミトコンドリアは、1.3％未満の酸素^32を含ん^でいます 。これらの値は、細胞が日常的に培養される周囲の空気よりも低酸素状態に非常に近いです。これは、どのような以前に低酸素症特異的な細胞過程であると考えられたが、生理的環境の中で関連するかもしれないことを示唆しています。興味深いことに、eIF4FとeIF4F ^H 積極的に生理学的な酸素または^{「physioxia」24}に露出し、いくつかの異なるヒト細胞株におけるmRNAの異なるプールまたはクラスの翻訳開始に関与します。低酸素はまた、適切な胎児の発育^33を駆動し、細胞は、一般physioxia ³⁴においてより高い増殖速度、より長い寿命、より少ないDNA損傷の少ない一般的なストレス応答を持っています。したがって、eIF4F ^Hは、おそらく生理的条件下で、選択遺伝子の発現の重要な要因です。

ここでは、固定された生理的酸素条件や組織の微小環境の可能性が高い、より代表的であるダイナミック変動範囲内の培養細胞へのプロトコルを提供します。この方法の一つの利点は、細胞が低酸素ワークステーション内に溶解されることです。細胞溶解に低酸素細胞培養物からの遷移は、他のプロトコルで実行される頻度は明らかではありません。細胞は、多くの場合、最初の小さな低酸素培養器から除去されること酸素に対する細胞応答が速いようフォア溶解するが、酸素へのこの暴露は^35（1または2分）生化学的経路に影響を与える可能性があります。特定のキャップ結合タンパク質が第2の基地との相互作用を必要とするか、またはメートル⁷ GTPを加水分解することができ、したがって、いくつかのキャップ相互作用は、精製プロセスにおいて見落とされる可能性があります。アガロース結合酵素耐性キャップ類似体には、このプロトコルで置換されていてもよいです。ここに記載の方法によりeIF4F ^HとeIF4Fの他のバリエーションの活性および組成を探ることは、細胞が生理的条件やストレス応答の際に利用する複雑な遺伝子発現機械に光を当てるます。

プロトコル

細胞培養のための1.準備

1. ヒト細胞の市販の株式を購入します。
   注：このプロトコルは、HCT116結腸直腸癌および初代ヒト腎近位尿細管上皮細胞（HRPTEC）を利用します。
2. HCT116の培養のための500ミリリットルの媒体を作る：ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）/ 7.5％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）を補充した高グルコース培地。
3. HRPTECの培養物を500 mlの培地を加える：5％FBS、1％の上皮細胞成長サプリメント、1％P / Sを補充した上皮細胞培地。
4. 140mMのNaClを、3のKCl、10mMののNa ₂ HPO _4、15mMのKH ₂ PO _4：1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の500ミリリットルを準備します。 pHを7.4に調整し、121℃で40分間オートクレーブで滅菌します。

細胞培養の2開始

1. 慎重トンを乱すことなく、80〜90％のコンフルエント皿から培地を吸引彼は細胞。
2. アリコート培養皿あたり1×PBS 3〜5mlの、静かにコーティングするために皿の表面積を各フラスコを揺らして、慎重に1×PBSを吸引します。第1×PBS洗浄のために繰り返します。
3. 各培養皿に小分けし、0.05％トリプシン - エチレンジアミン四酢酸（EDTA）の3ミリリットルを、穏やかにトリプシンEDTAで均一にコート細胞をに揺すります。 2-3分間37℃でインキュベートします。
4. 90秒間4000×gで15ミリリットルの遠心分離管と遠心分離機に剥がれた細胞を転送します。
5. 完全DMEM 1ml中に再懸濁細胞ペレット。
6. 血球計数器を用いて細胞数を計測します。 100mMの細胞培養皿は、1cm ²あたり約2,500〜5,000細胞の初期播種密度を達成するために必要とされるどのように多くの非発熱性及びポリスチレン計算します。
7. ステップ30から45分間、37℃の水浴中で1.2または1.3で行われたプレ暖かい完全な細胞培養培地。
8. 70％エタノールを含む培地ボトル細胞バイアルを除染。この点から前方すべて操作は無菌的に行われるべきです。
9. ステップ2.6で述べた播種密度内で凍結細胞のボリューム全体を使用するために必要な限り多くの100mmの細胞培養皿にアリコート完全DMEM 6ミリリットル。
10. 100mm培養皿のそれぞれに、ステップ2.6で算出された細胞懸濁液の量を転送します。均等にプレートの表面上に細胞を分配するために、手動で各プレートを揺らし。
11. 5％CO ₂雰囲気中で37℃のインキュベーター内でシードされた100ミリメートル細胞培養皿を置きます。細胞は、次のステップの前に、少なくとも24時間インキュベートすることを許可します。

3.継代

1. 細胞集密度の割合（皿の面積をカバー％細胞）を決定するために、顕微鏡下で各細胞培養皿を表示します。インキュベーターとプリ暖かい完全培地および1×PBSに細胞を返します。細胞は、80から100までパーセントのコンフルエントであれば次のステップに進みます。
2. 慎重に乱すことなく、使用済み培地を吸引各培養皿中の細胞。
3. アリコート培養皿あたり1×PBS 3〜5mlの、静かにコーティングするために皿の表面積を各フラスコを揺らして、慎重に1×PBSを吸引します。第1×PBS洗浄のために繰り返します。
4. 各培養皿に小分けし、0.05％トリプシン-EDTAの3ミリリットルを、穏やかにトリプシンEDTAで均一にコート細胞をに揺すります。 2-3分間37℃でインキュベートします。
5. このインキュベーションの間に、多くの培養皿にアリコート完全培地10mlを1cm ²あたり2,500〜5,000の細胞の細胞密度を得るために必要とされます。
6. 細胞がプレートから剥離したら、すぐに1×定義されたトリプシンインヒビターの3ミリリットルを追加し、穏やかにトリプシンEDTAの全てが中和されていることを確認するために、1分間の皿を旋回。
7. 無菌の15mlの遠心管に剥がれた細胞を移し、脇に置きます。残りの細胞を収集し、同じ15ミリリットルの遠心管にそれを転送するために皿にPBS 1×3ミリリットルを追加します。
8. 150 XGを遠心分離して細胞をペレット化5分間。
9. 上清を吸引し、完全培地3mlに細胞ペレットを再懸濁します。
10. 血球計を用いて細胞を計数し、1cm ²あたり2,500〜5,000の細胞の細胞密度を得るために完全培地15 mlを含むの150mm培養皿に播種。各キャップ結合アッセイのための2つの150ミリメートルを使用してください。
    注：液体培地を介して細胞への酸素の拡散は、ボリューム³⁶に依存しています。懸濁液中の接着細胞や細胞を使用するかどうかの実験の間で一貫性のメディアの容量を維持することが推奨されています。メディアが拡散でこれらの変動性を回避するために、（議論で説明したように24時間のワークステーションでインキュベート）予め調節することができます。
11. 5％CO _2雰囲気中で37℃のインキュベーターで播種し、培養皿を置きます。細胞は、次のステップに進む前に、少なくとも24時間インキュベートすることを許可します。

4. Physioxic露出

1. 顕微鏡下で細胞を見ます。 BESのためのトンの結果は、細胞が24時間の暴露70〜80％コンフルエント、48時間の暴露50〜60％コンフルエント、および72時間の暴露40〜50％コンフルエントであることを確認してください。
2. 所望の時間（24、48、または実験に応じて72時間）のための低酸素ワークステーションにセルを配置します。
3. 適切なphysioxiaにワークステーションを設定します。
   注：たとえば、3％O ₂設定は、5％のCO ₂および92％N ₂を伴うことになります。
   注：ダイナミックレンジ内の酸素変動が機器内に特定のタイムライン、プログラムのスケジュールを超える希望するか、手動で任意の間隔で酸素の設定を調整している場合。
4. 60％の湿度を設定します。ワークステーションの雰囲気は、それにもかかわらず、非常に乾燥している、とメディアが著しく長い実験（> 48時間）の間に蒸発します。 （メディアは、ワークステーションの雰囲気で平衡化されるように）細胞培養DISのメディアを補充するためにワークステーション内の細胞培養フラスコ内のメディア予約を保ちます彼は。
   注：溶存酸素は大気中の酸素³⁶と均衡するような（例えば、PBSおよびトリプシンEDTAなど）、溶解前に細胞と相互作用する任意のソリューションは、低酸素ワークステーション内で使用する前に24時間事前に調整されなければなりません。
5. 溶解するまでワークステーション内の細胞を保管してください。

キャップ結合アッセイ5.準備バッファ

1. 調製1×トリス緩衝食塩水（TBS）。
   1. dH ₂ Oの800ミリリットルで、8.76グラムのNaClおよび6.05グラムトリス塩基を溶解します。
   2. 1 M HClを用いて7.4の最終pHに対する解決策をもたらします。
   3. dH ₂ Oを使用して、1リットルに最終容量を持参
2. 非変性溶解バッファーを準備します。キャップ結合アッセイの日を緩衝溶解準備します。空白のアガロースビーズとγアミノフェニルメートル⁷ GTPアガロースC10-リンクビーズ（7.9および7.13ステップ）を洗浄するために余分な溶解バッファーを作成します。
   1. dH ₂ Oの7ミリリットルで、160μlの5 MのNACを追加リットル、160μlの1 Mトリス塩酸pH7.4の、40μlの200mMのNaFを、40μlの1 MのMgCl _2、および40μlの1mMのオルトバナジウム酸ナトリウム。
   2. 7ミリリットル溶液にイゲパールの40μLを加えます。それは非常に粘性があるようイゲパルを取得支援するためにピペットの先端をカットします。
   3. イゲパルの全てが溶解するまで、ピペッティング、またはボルテックスによって7ミリリットルの溶液を混ぜます。
   4. 8ミリリットルの溶液の最終容量を上げ、氷上に保ちます。
3. 4xのドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-PAGEサンプルバッファーを準備します。
   1. ビーカーに、16ミリリットルの1MのTris-HCl pHが6.8、12.64ミリリットルグリセロール、および8ミリリットルジチオスレイトール（DTT）を組み合わせます。
   2. SDSの3.2グラムとブロモフェノールブルーの0.16グラムを追加します。粉末が完全に磁気攪拌棒を混合することにより溶解させます。
   3. -20℃で1.5 mlマイクロチューブに小分けし、店舗。

6.細胞溶解

1. 非変性溶解緩衝液を準備し、氷の上で目の日を保ちます電子キャップ結合アッセイ。
2. 前加温1×PBSと30分間37℃の水浴中でトリプシン。
3. 各キャップ結合アッセイ1.5 mlマイクロ遠心チューブに溶解緩衝液のアリコート980μlを行っています。
4. 溶解緩衝液980μlに、4-（2-アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩および100Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを10μlの10μLを加えます。氷の上に保管してください。
5. 低酸素ワークステーション内の廃棄物容器内の各150ミリメートル皿からメディアを破棄します。
6. 暖かい1×PBS 3-4 mlの細胞を洗浄し、液体のすべてを捨てます。
7. 各皿に暖かい0.05％トリプシンEDTAの1ミリリットルを加え、2分間、または細胞がもはやプレートに接着されるまで放置します。
8. ピペットを用いて1.5 mlのマイクロ遠心チューブに1プレートの細胞を移します。必要に応じてセルの各プレートが別々の1.5mL微量遠心管に転送されるように繰り返します。
9. 90秒tの6000×gで1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブを遠心O細胞をペレット。
10. ペレットを乱すことなくピペットを用いてトリプシンを吸引します。ペレットを1.5 mlのマイクロ遠心チューブは、90秒間6000×gで再遠心分離、乱された場合。
11. 優しくちょうどペレット上記チューブに200μlのPBSをピペットで暖かい1×PBSで細胞を洗浄。再び遠心分離し、ペレットを乱されている場合。
12. ペレットを乱すことなくPBSを吸引します。
13. 1ミリリットルからピペット500μlを最初に携帯ペレットに溶解緩衝液を調製しました。ピペッティングにより完全にペレットを再懸濁。
14. 第二の細胞ペレットに再懸濁された細胞を組み合わせて、上下にピペッティングすることにより、第2のペレットを再懸濁。すべてのペレットを合わせ、各サンプルのために再懸濁されるまで、このプロセスを繰り返します。
15. 1.5ミリリットルマイクロチューブに溶解バッファーの残りの500μlの溶解液を兼ね備えています。
16. 低酸素ワークステーションからのサンプルを削除します。
    注：溶解緩衝液を添加した後、LL以降の工程は、低酸素ワークステーションを37℃に設定し、次のステップは、冷（4℃または氷上で）実行されるべきであるよう、周囲空気中で実施されます。
17. 溶解1.5-2時間、4℃でサンプルを回転させることにより、穏やかな攪拌を使用して細胞。
18. 細胞破片を除去するために、4℃で15分間12,000×gで溶解した細胞を遠心します。
19. 新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブにライセートを移し、ペレットを捨てます。
20. 将来のウェスタンブロット分析のための全細胞溶解物の入力制御として使用される上清の一部（5~10％）を予約します。

7.キャップ結合アッセイ

1. 各サンプルについて、1.5ミリリットルのマイクロチューブを分離するために、ブランクアガロースビーズ制御スラリー50μlのとγアミノフェニルメートル⁷ GTPアガロースC10-リンクビーズスラリー50μlのを転送します。ビーズスラリーの収集を容易にするために、ピペットの先端を除去するために、はさみを使用してください。
2. ビーズbをペレットyが30秒間500×gでスラリーを遠心分離します。
3. 慎重に上清を除去し、TBS500μlのビーズを再懸濁します。
4. 繰り返しは、7.2と7.3を繰り返します。 30秒間500×gでビーズをペレット化し、上清を除去します。
5. 空白のアガロースビーズを含む1.5 mlマイクロチューブにステップ6.19からの溶解物を含有する上清を移します。
   注：空白のアガロースビーズは非特異的にビーズと相互作用する溶解物からタンパク質を除去するためのプレクリアステップとして機能します。
6. 穏やかに攪拌しながら4℃で10分間インキュベートします。
7. 30秒間500×gで遠心分離することにより、ブランクのアガロースビーズをペレット化。
8. γアミノフェニルメートル⁷ GTPアガロースC10-リンクビーズを含む1.5 mlのマイクロチューブにライセートを移します。
9. 30秒間500×gで遠心分離し、supernaを廃棄することによりビーズをペレット化し、溶解緩衝液500μlでビーズを再懸濁することにより、ブランクアガロースビーズを洗浄タント。 5回の洗浄の合計のために、この4回繰り返します。
10. 1×SDS-PAGEサンプル緩衝液中でブランクアガロースビーズを再懸濁し、そして95℃で90秒間のビーズを沸騰させます。将来のウェスタンブロット分析のために-20℃で保存は、目的のタンパク質は、ビーズに非特異的に結合するかどうかを観察しました。
11. キャップ結合タンパク質を捕捉するために4℃で1時間穏やかに攪拌しながらγアミノフェニルメートル⁷ GTPアガロースC10-リンクビーズと溶解液をインキュベートします。
12. 30秒間500×gで遠心分離することにより、γアミノフェニルメートル⁷ GTPアガロースC10-リンクビーズをペレット化。上清を捨てます。
13. ステップ7.9を繰り返して、γアミノフェニルメートル⁷ GTPアガロースC10-リンクビーズを洗ってください。
14. 溶解緩衝液600μlの中でビーズを再懸濁します。
15. 1mMの最終濃度にGTPを加えます。
16. 4°Cで1時間穏やかに攪拌しながらγアミノフェニルメートル⁷ GTPアガロースC10-リンクビーズ+ 1 mMのGTPをインキュベートします。注：このを非特異的（ すなわち、非メチル化GTPとの相互作用）は、m ⁷ GTPと相互作用するタンパク質の関連付けを解除します。
17. 30秒間500×gで遠心分離することにより、γアミノフェニルメートル⁷ GTPアガロースC10-リンクビーズをペレット化。
18. 新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移し、4×SDS-PAGE試料緩衝液（50mMのトリス-HCl、100mMのDTT、2％SDS、0.1％ブロモフェノールブルー、10％グリセロール）の200μLを加えます。将来のウェスタンブロット分析³⁷のために-20℃でのGTPコントロールサンプルを保管してください。ステップ7.9を繰り返してビーズを洗浄します。
19. 1×SDS-PAGE試料緩衝液（50mMのトリス-HCl、100mMのDTT、2％SDS、0.1％ブロモフェノールブルー、10％グリセロール）中でビーズを再懸濁し、90秒間、95℃で沸騰します。将来のウェスタンブロット分析³⁷のために-20℃でメートル⁷ GTP結合画分を保管してください。

結果

メートル⁷ GTPアフィニティーカラムでのeIF4EとeIF4E2の酸素に応答したキャップ結合能の解析

Fのigure 1及び結腸直腸癌において、初代ヒト腎近位尿細管上皮細胞（HRPTEC）（： 図1および2は、2つのヒト細胞株中での酸素の変動に応じて二つの主要なキャップ結合タンパク質の典型的なM ⁷ GTPアフィニティ精製のウエスタンブロットを表します図2のHCT116）。細胞は、液体培地中の溶存酸素は、低酸素ワークステーション内の空気で平衡化したことを確認するために、24時間指示された酸素の可用性に維持されています。 M ⁷ GTP結合アガロースビーズは、キャップ結合タンパク質を捕捉するために添加される前の入力レーン（IN...

ディスカッション

生理的酸素条件に曝露したヒト細胞中でのキャップ結合タンパク質の分析は、新規な酸素調節翻訳開始因子の同定を可能にすることができます。 mRNA又は他のキャップ結合タンパク質の5 'キャップのためのこれらの因子の親和性がm ⁷ GTP結合アガロースビーズへの関連の強さを測定することができます。この技術の一つの注意点は、それがタンパク質ポスト溶解のキャップ結合能を測定するが、それは、タンパク質 - タンパク質相互作用、および翻訳後修飾（PTMを）を維持し、非変性条件下で行われることです。いくつかのタンパク質 - タンパク質相互作用は、5 'キャップへのeIF4Eファミリーの結合を媒介します。 4E-BPは結合してのeIF4Gとの相互作用を遮断し^、38複雑な開始前43Sの動員を防止することによってのeIF4Eを抑制する。 eIF4E / 4E-BP複合体は、その転写物から任意の開始を阻止する、5 'mRNAキャップに結合したままで、とすることができますM ⁷ GTPアフィニティーカラムでのeIF4Eの阻害のためのマーカーとして使用することができます。逆に、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
γ-アミノフェニル-m7GTP アガロース C10結合ビーズ	イエナ バイオサイエンス	AC-1555	アガロース結合 m7GTP
100 mm 培養皿	コーニング	877222	10 cm 培養皿
150 mm 培養皿	サーモフィッシャー		130183 15 cm 培養皿
AEBSF 塩酸塩	ACROSOrganics	A0356829	AEBSF
アガロースビーズ	イエナ バイオサイエンス	AC-0015	アガロースビーズ制御
ブロモフェノールブルー	フィッシャー	BP112-25	SDS-PAGEローディングバッファーの成分
1.5 ml 遠心分離管	FroggaBio	1210-00S	少量の遠心分離に使用
15 ml 円錐形遠心分離管	フィッシャー	1495970C	初代細胞の培養に使用
定義されたトリプシン阻害剤	フィッシャー	R007100	DTI
ジチオスレイトール	フィッシャー	BP172-25	DTT
上皮細胞培地 (コンプリートキット)	ScienCell	4101	血清と成長因子のサプリメントを含む)
グリセロール	フィッシャー	BP229-1	SDS-PAGEローディングバッファーの成分
100 mM グアノシン 5'-三リン酸、1 ml	イエナバイオサイエンス	272076-0251M	GTP
HCT116結腸直腸癌	ATCC	CCL-247	ヒト癌細胞株
ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞	ATCC	PCS-400-010	HRPTEC
ハイクロンDMEM/高グルコース	GEライフサイエンス	SH30022.01	ヒト細胞培養用標準培地
ハイクロンペニシリン-ストレプトマイシン溶液	GEライフサイエンス	SV30010	DMEM
H35 HypOxystation	Hypoxygen	N/A	Hypoxia workstation
Igepal CA-630	MP Biomedicals 2198596		溶解バッファーの洗剤成分
リン酸一カリウム	Fisher	P288-500	KH2PO4
Potassium chloride	Fisher	P217-500	KCl
塩化マグネシウム	Fisher	M33-500	MgCl<サブ>2塩化
ナトリウム	フィ	ッシャーBP358-10	NaCl
ッ化ナトリウム	フィッシャー5299-100	NaF(溶解緩衝液のホスファターゼ阻害剤成分)
リン酸二ナトリウム	フィッシャー5369-500	Na<サブ>2HPO<サブ>4
プレミアムグレードウシ胎児血清	血清	1500-500	FBS
プロテアーゼ阻害剤カクテル (100x)	細胞シグナル伝達	58715	溶解バッファーの成分
ドデシル硫酸ナトリウム	フィッシャー	BP166-100	SDS
オルトバナジン酸ナトリウム	シグマ	56508	Na3VO4
>Tris Base	フィッシャー	BP152-5	バッファー
0.05% トリプシン-EDTA (1x)	Life Technologies	2500-067	接着細胞の剥離に使用されるトリプシン