複数の蛍光によるインター染色体安定型異常の検出その場でハイブリダイゼーション（mFISH）と照射されたマウスにおけるスペクトル核型分析（SKY）

Summary

現在のプロトコルは、全身照射への曝露後のマウスの骨髄細胞における染色体間安定異常の同定における多重蛍光in situハイブリダイゼーション(mFISH)およびスペクトル核型分析(SKY)の有用性を説明しています。

Abstract

電離放射線(IR)は、多数の安定した染色体および不安定な染色体異常を誘発します。染色体形態が大幅に損なわれる不安定な異常は、従来の染色体染色技術で容易に同定できます。しかし、染色体形態に大きな変更を加えずに遺伝物質の交換または転座を伴う安定収差の検出には、蛍光標識DNAプローブのin situハイブリダイゼーションに依存する高度な染色体塗装技術、一般に蛍光in situとして知られている染色体塗装技術が必要ですハイブリダイゼーション(FISH)。FISHプローブは、全染色体または染色体上の正確なサブ領域に特異的にすることができます。この手法は、安定な収差を可視化するだけでなく、特定の異常形成に関与する染色体や特定のDNA配列を検出することもできます。細胞遺伝学では、さまざまな染色体塗装技術が利用可能です。ここでは、全身照射後にマウスの骨髄細胞に形成される染色体間安定異常を同定するために、多重蛍光in situハイブリダイゼーション(mFISH)とスペクトル核型解析(SKY)の2つの高感度法について説明します。どちらの技術も蛍光標識DNAプローブに依存していますが、検出方法と蛍光シグナルの画像取得プロセスは異なります。これら2つの手法は、放射線生物学、がん細胞遺伝学、遡及的放射線生物線量測定、臨床細胞遺伝学、進化細胞遺伝学、比較細胞遺伝学など、さまざまな研究分野で使用されています。

Introduction

放射線誘発性染色体間安定異常を特定する最も信頼性の高い2つの方法は、2つ以上の染色体を同時に描画できるMultiple Fluorescence in situハイブリダイゼーション(mFISH)と、ゲノムの各相同染色体ペアに明確な色を付与するスペクトル核型分析(SKY)です。不安定な異常とは異なり、安定な異常は本質的に持続性があり、放射線を浴びた集団¹で数世代にわたって伝播する可能性があり、放射線誘発性細胞遺伝学的病変²の重要な分子「シグネチャー」と見なされています。さまざまなグループによる研究により、安定した異常は、がん³を含む多くの疾患の病因と発症に関連していることが示されています。染色体描画(分子細胞遺伝学とも呼ばれる)の時代以前は、従来のGバンディング技術が安定した染色体異常を検出する唯一の方法でした。しかし、染色体バンディングは、分解能が限られており、再現性が不確実であり、労働集約的な手順であり、信頼性の高いデータ解釈のために高度なスキルと経験豊富な細胞遺伝学者が必要であるため、細胞遺伝学者にとって課題です⁴。さらに、従来のバンディング技術では、放射線損傷の一般的な結果である、2つ以上の染色体に分布する3つ以上の切断の相互作用を伴う複雑な染色体再配列の検出ができません。複雑な異常は、放射線被曝後も何年も経ってから個人に持続する可能性があるため、遡及的生物線量測定に有用です⁵。したがって、安定し....

Protocol

すべての動物実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って実施しました。動物プロトコルは、アーカンソー医科大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。新鮮な空気と、標準的なげっ歯類の餌と水に自由にアクセスの15時間ごとのサイクル - すべての動物は、10と20±2℃で、標準的なエアコン付きの動物施設で飼育されました。到着すると、マウスを1週間検疫で開催されたと認定齧歯動物食を提供しました。

1.Radiation曝露と中期細胞のインビボ逮捕で

1. 照射室で2 Gyの全身照射に非麻酔したマウスを公開します。照射中、彼らは自由に移動し、均一な線量を受けていないことを確認する風通しのよい保持室にマウスを置きます。
2. 0.05％コルヒチン溶液100μLを注入（C腹腔内に1mlの使い捨て注射器を取り付けた25 G針を使用して、カルシウム及びマグネシウムを含まないPBSに溶解olchicine粉末）。任意の器官に直接注入は避けてください。
3. 骨髄細胞の収穫前に2時間ケージに動物を残します。痛みや苦痛の徴候のために動物を観察します。

2.骨髄細胞収穫と密度勾配遠心分離により骨髄単核細胞の単離

1. CO ₂窒息によりマウスを安楽死させます。
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Results

全身照射は、照射したマウスの骨髄細胞における多数の染色体異常を誘発します。現在のプロトコルは、放射線暴露後の骨髄細胞のin vivoでの有糸分裂停止のために最適化され、密度勾配遠心分離、中期細胞スプレッドの調製、およびそれに続くによって照射されたマウス骨髄単核細胞の単離の後脚から骨髄細胞の採取mFISHとSKY技術による放射線誘発安定した染色体異常の検出。これらの技術を用いて塗装染色体は、種々の病態生理学的状態のリスクを検出し、評価することができます。

図1は、代表的な中期細胞は、正常と異常なマウス染色体のペア-1、-2、および-3で広がりを示しています。 図2は 、正常と異常のマウスの中期染色体のスペクトル核型分析を示しています。これらの結果は、電離放射線は、主に、多様な細胞型への自己再生および分化に関与している幹細胞および前駆細.......

Discussion

いくつかの重要なステップは、mFISHとSKYの成功を決定します。最初の最も重要なステップは、骨髄単核細胞のin vivoでの有糸分裂停止のためのコルヒチン処理を最適化することです。コルヒチン濃度と処理時間個別に、または分裂指数だけでなく、染色体凝縮-2効果的な染色体の絵画のための重要な前提条件を決定コンサートインチ高コルヒチン濃度や長い処理時間は、適切な変性およびハイブリダイゼーションのための互換性のない非常に凝縮した染色体につながります。また、凝縮された染色体で拡散中期細胞における複雑な再配列の正確な識別が達成するために簡単な作業ではありません。 22と26グラムの間の体重を有するマウスで2時間100μL、0.05％コルヒチンの腹腔内投与は、中期細胞の十分な数が適度に凝縮した染色体に広がる生産します。第二の重要なステップは、低張処理です。ボリューム、処理時間、および低張液の影響染色体の形態の温度及びスライドガラス上に染色体の広がり。短時間または準最適温度での低張処理は、適切な染色体重複、染色体との中期細胞の広がり、その結果、拡散を防止することができます。染色体重複はin situハイブリダイゼーシ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ホルムアミド	Sigma-Aldrich	221198-100ML
SSCバッファー20倍;マウス用濃縮	シグマ-アルドリッチ	S6639-1L
SKY実験用試薬	応用スペクトルイメージング	FPRPR0030/M40
CAD - 濃縮抗体検出キット	応用スペクトルイメージング	FPRPR0033
シングルペイント カスタマイズ - 3色;マウス染色体1:赤、マウス染色体2:緑、マウス染色体3:Aqua	Applied Spectral Imaging	FPRPR0182/10
ガラスカバースリップ	Fisher Scientific	12-545B
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
塩酸、37%、Acros Organics	Fisher Scientific	AC45055-0025
フィッシャーブランドガラス染色皿 スクリューキャップ付き	フィッシャーサイエンティフィック	08-816
KaryoMAX塩化カリウム溶液	Life Technologies	10575-090
フィッシャーブランド スーパーフロスト プラス 顕微鏡スライド	フィッシャー サイエンティフィック	12-550-15
コルセミド粉末	フィッシャー サイエンティフィック	50-464-757
Histopaque-1083	シグマ・アルドリッチ	10831
シェパード マーク I モデル 25 137Cs 照射器	J. L. シェパード &Associates	Model 484B
Syringe 1 mL	BD Biosciences	647911
Ethyl Alcohol, 200 Proof	Fisher Scientific	MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and Magnesium	Fisher Scientific	ICN1860454
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	10-437-010
メタノール	Fisher Scientific	A454SK-4
氷酢酸	フィッシャーサイエンティフィック	AC295320010
ツァイス顕微鏡	ツァイ	ス AXIO イメージャー.Z2