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方法論記事

複数の蛍光によるインター染色体安定型異常の検出

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DOI:

10.3791/55162

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2017年1月11日

 ,  , 
1Division of Radiation Health, Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Environmental Health, Fay W. Boozman School of Public Health, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Surgical Service, Central Arkansas Veterans Healthcare System

この記事について

サマリー

現在のプロトコルは、全身照射への曝露後のマウスの骨髄細胞における染色体間安定異常の同定における多重蛍光in situハイブリダイゼーション(mFISH)およびスペクトル核型分析(SKY)の有用性を説明しています。

要約

電離放射線(IR)は、多数の安定した染色体および不安定な染色体異常を誘発します。染色体形態が大幅に損なわれる不安定な異常は、従来の染色体染色技術で容易に同定できます。しかし、染色体形態に大きな変更を加えずに遺伝物質の交換または転座を伴う安定収差の検出には、蛍光標識DNAプローブのin situハイブリダイゼーションに依存する高度な染色体塗装技術、一般に蛍光in situとして知られている染色体塗装技術が必要ですハイブリダイゼーション(FISH)。FISHプローブは、全染色体または染色体上の正確なサブ領域に特異的にすることができます。この手法は、安定な収差を可視化するだけでなく、特定の異常形成に関与する染色体や特定のDNA配列を検出することもできます。細胞遺伝学では、さまざまな染色体塗装技術が利用可能です。ここでは、全身照射後にマウスの骨髄細胞に形成される染色体間安定異常を同定するために、多重蛍光in situハイブリダイゼーション(mFISH)とスペクトル核型解析(SKY)の2つの高感度法について説明します。どちらの技術も蛍光標識DNAプローブに依存していますが、検出方法と蛍光シグナルの画像取得プロセスは異なります。これら2つの手法は、放射線生物学、がん細胞遺伝学、遡及的放射線生物線量測定、臨床細胞遺伝学、進化細胞遺伝学、比較細胞遺伝学など、さまざまな研究分野で使用されています。

概要

放射線誘発性染色体間安定異常を特定する最も信頼性の高い2つの方法は、2つ以上の染色体を同時に描画できるMultiple Fluorescence in situハイブリダイゼーション(mFISH)と、ゲノムの各相同染色体ペアに明確な色を付与するスペクトル核型分析(SKY)です。不安定な異常とは異なり、安定な異常は本質的に持続性があり、放射線を浴びた集団1で数世代にわたって伝播する可能性があり、放射線誘発性細胞遺伝学的病変2の重要な分子「シグネチャー」と見なされています。さまざまなグループによる研究により、安定した異常は、がん3を含む多くの疾患の病因と発症に関連していることが示されています。染色体描画(分子細胞遺伝学とも呼ばれる)の時代以前は、従来のGバンディング技術が安定した染色体異常を検出する唯一の方法でした。しかし、染色体バンディングは、分解能が限られており、再現性が不確実であり、労働集約的な手順であり、信頼性の高いデータ解釈のために高度なスキルと経験豊富な細胞遺伝学者が必要であるため、細胞遺伝学者にとって課題です4。さらに、従来のバンディング技術では、放射線損傷の一般的な結果である、2つ以上の染色体に分布する3つ以上の切断の相互作用を伴う複雑な染色体再配列の検出ができません。複雑な異常は、放射線被曝後も何年も経ってから個人に持続する可能性があるため、遡及的生物線量測定に有用です5。したがって、安定した染色体再配列を検出するための従来のバンディング技術の限界を克服するために、別のアプローチが必要でした。

1960年代後半、放射性物質で標識された核酸プローブを用いた分子ハイブリダイゼーションに関するGall and Pardue(1969)の先駆的な研究は、細胞遺伝学の分野における新しい時代を開始し、染色体上の特定のDNA配列の検出を可能にしました6。しかし、分子ハイブリダイゼーションのための放射性プローブの使用にはいくつかの欠点がありました:放射性プローブは比較的不安定であり、プローブ活性は使用される同位体の放射性崩壊に依存し、ハイブリダイゼーションはより長い時間がかかり、分解能は制限され、プローブは比較的高価であり、放射性物質は健康に有害です。そのため、非放射性プローブの開発と設計が必要になりました。1980年代と1990年代の蛍光タグ付き核酸プローブの導入により、放射性プローブの限界が克服され、ハイブリダイゼーション技術7-10の安全性、感度、および特異性が大幅に向上しました。蛍光プローブは、適切な励起フィルターと蛍光フィルターを備えた蛍光顕微鏡で観察すると、非常に明るいシグナルを生じさせます。蛍光標識染色体または染色体の一部の損失、獲得、または再配列は、このFISH技術で容易に識別できます。

FISHペインティングによる染色体異常の解析は、長年にわたって細胞遺伝学的研究の顕著な進歩をもたらしてきました。遺伝子座特異的プローブから全染色体塗装プローブまで、特定のアプリケーション向けの蛍光標識プローブを設計することで、この分野は大幅に進歩しました。これにより、従来の染色体バンディングでは不可能だった超微視的(「不可解」)な再配列の検出も容易になりました。mFISHとSKYによる染色体ペインティングは、単純な染色体間再配列と複雑な染色体間再配列の同定のための貴重なツールであることが証明されています。両技術の基本原理は似ていますが、in situハイブリダイゼーション後の蛍光シグナルの検出と識別の方法と画像取得のプロセスは異なります。mFISHでは、4つの蛍光色素のそれぞれの別々の画像が、ナローバンドパス顕微鏡フィルターを使用してキャプチャされます。その後、専用のソフトウェアを使用して画像を結合します。一方、SKYでは、画像取得は落射蛍光顕微鏡、電荷結合デバイスイメージング、およびフーリエ分光法の組み合わせに基づいており、すべての画像ポイントで1回の露光で発光スペクトル全体を測定できます。mFISHとSKYの両方で、モノクロ画像は独立してキャプチャされ、マージされ、最終的に、各蛍光色素プローブに付着した特定の色素に基づいて、モノクロ画像の染色体に固有の疑似色が割り当てられます。

放射線生物学分野におけるmFISHおよびSKY分析の貢献は、特にIR(放射線生物線量測定)11-14、放射線発がんリスク評価15、放射線治療関連の二次がん16の検出とリスク推定において顕著です。.マウスに関する最近の研究では、FISHベースの染色体描画技術も放射線対策の有効性を評価するための重要なツールであることが示されている17。本研究では、mFISHおよびSKYの手法を用いて、マウスの骨髄細胞における安定染色体異常の誘発に対する全身放射線被ばくの影響を実証した。

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プロトコル

すべての動物実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って実施しました。動物プロトコルは、アーカンソー医科大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。新鮮な空気と、標準的なげっ歯類の餌と水に自由にアクセスの15時間ごとのサイクル - すべての動物は、10と20±2℃で、標準的なエアコン付きの動物施設で飼育されました。到着すると、マウスを1週間検疫で開催されたと認定齧歯動物食を提供しました。

1.Radiation曝露と中期細胞のインビボ逮捕で

  1. 照射室で2 Gyの全身照射に非麻酔したマウスを公開します。照射中、彼らは自由に移動し、均一な線量を受けていないことを確認する風通しのよい保持室にマウスを置きます。
  2. 0.05％コルヒチン溶液100μLを注入（C腹腔内に1mlの使い捨て注射器を取り付けた25 G針を使用して、カルシウム及びマグネシウムを含まないPBSに溶解olchicine粉末）。任意の器官に直接注入は避けてください。
  3. 骨髄細胞の収穫前に2時間ケージに動物を残します。痛みや苦痛の徴候のために動物を観察します。

2.骨髄細胞収穫と密度勾配遠心分離により骨髄単核細胞の単離

  1. CO 2窒息によりマウスを安楽死させます。
  2. 背と腹側の70％エタノールをスプレーします。
  3. 鋭いハサミで腹部皮膚上の2cmの切開を行います。鈍ピンセットで切開部の両側に皮膚をつかみ、ゆっくりと腹筋を開き引き出します。
  4. ハサミで後ろ足の両方を切断し、すぐに4％のFBSを予め冷却PBSでそれらを置きます。
  5. 慎重に鋭いカミソリの刃と綿ガーゼ包帯で後肢に接続されているすべての筋肉を清掃してください。
  6. 大腿骨から脛骨を区切ります。カミソリの刃でそれぞれの骨の両方の先端をトリミング。
  7. 3 mLシリンジに取り付けた23 Gの針を用いて（4％FBSを含む）3 mLのPBSで骨髄の内容をフラッシュし、15 mL遠心チューブ内のコンテンツを収集します。単一細胞懸濁液を作製するために針を通して細胞懸濁液を少なくとも10回通過します。
  8. 細胞懸濁液と、リンパ球分離媒体との間の界面を乱すことなく、リンパ球分離媒体（3 mL）を等量の細胞懸濁液を慎重に重なります。室温で30分間、400×gで遠心分離します。
  9. 新しい15 mL遠心管に他の層と転送を乱すことなく、慎重にバフィーコートを収集します。

中期細胞スプレッドの調製

  1. バフィーコートを含むチューブに10 mLのPBSを追加します。
  2. 室温で5分間、400×gで遠心分離します。
  3. 上清を注意深く取り除きます。その後、トンを破ります彼は穏やかなタッピングでペレットをセルと10 mLのPBSを追加します。
  4. 室温で5分間、400×gで遠心分離します。
  5. 、細胞ペレットを乱すことなく上清を除去し、ペレットを分割し、予め温めた低張0.075 M塩化カリウム溶液の4 mLを加え。穏やか一定に振盪しながら降下により低張液滴を追加します。
  6. 水浴中で37℃で20分間細胞をインキュベートします。
  7. （：氷酢酸、3：メタノール1 v / v）を低張処理した後、固定液の等量（4 ml）を追加し15 mLチューブにおいて、チューブを反転させることにより穏やかに混合します。
  8. 室温で5分間、400×gで遠心分離し、上清を捨てます。
  9. 数秒間穏やかにボルテックス続いタッピングして細胞ペレットを破砕し、一定に振盪しながら降下により固定液滴の3ミリリットルを追加します。
  10. 室温で30分間インキュベートし、次いで5分間400×gで遠心します。
  11. 、上清を除去ゲントで細胞ペレットを破りますルは、タッピング、および3 mLの新鮮な固定液を追加します。
  12. 室温で5分間、400×gで遠心分離し、上清を除去します。穏やかなタッピングで細胞ペレットを破壊し、そして新鮮な3 mLの固定液を追加します。
  13. 手順を繰り返し3.12倍以上。
  14. 室温で5分間、400×gで遠心分離し、細胞ペレットを乱すことなく、上清を除去します。そして、400〜600μLの固定液を追加し、ピペッティングでよく混ぜます。
  15. 45°の角度で傾斜予備洗浄とウェットスライド上に30μLの固定細胞を削除し、完全に一晩空気乾燥さスライドを可能にします。

mFISH 4.マウス染色体の絵画

  1. 染色体変性
    1. 室温で2分間、2×SSC中で中期細胞のスプレッドを含むスライドを置きます。
    2. 70％、80％、100％で2分間、連続エタノール洗浄によってスライドを脱水。 65℃で60分間インキュベートします。
    3. 予熱40 mLの変性溶液（70％ホルムアミド/ 2×SSC; 30分間ガラスコプリンジャー中で70℃（±2℃）にpHが7.0）。 1.5分 - 1のための予熱した変性溶液中でスライドをインキュベートすることによって染色体を変性させます。
    4. 変性処理を停止するとともに、再アニーリングから変性染色体を防ぐために2分間氷冷70％エタノール中で直ちにクエンチスライド。次に2分間80％エタノールで洗浄することにより脱水します。 2分間100％エタノールでエタノール洗浄を繰り返します。完全に室温でスライドを乾燥させます。
  2. プローブ混合物の変性およびハイブリダイゼーション
    1. 簡単に言うと、製造業者によって供給されたプローブの混合物を遠心分離し、7分間水浴中で80℃（±2℃）でインキュベートすることによりキャップ遠心管をスナップ500μLにプローブ混合物の10μLを転送し、変性。
    2. 10分間37℃の水浴中でプローブ混合物を用いた遠心分離管を置きます。
    3. 変性chromosoでスライド上に変性したプローブ混合物を適用しますMES。
    4. 慎重に18ミリメートルX 18ミリメートルガラスカバースリップでエリアをカバーし、非常に静かにスライドさせるカバースリップを押すことにより、目に見える気泡を除去します。ゴムセメントでカバースリップのすべての4つの側面をシールし、ハイブリダイゼーションのための加湿チャンバー内で37℃、暗所で16時間〜12時間インキュベートします。
  3. ポストハイブリダイゼーション洗浄および検出
    1. 慎重にゴムセメントとカバースリップを削除します。
    2. 5分間74℃（±2℃）で予熱した0.4×SSCに入れスライド。
    3. 2分間の洗浄溶液II（4×SSC / 0.1％のTween-20）で洗浄スライド。
    4. DAPIの対比（1.5μgの/ mL）で抗退色封入剤の20μLを置き、ガラスカバースリップでカバーしています。気泡や過剰取り付け溶液を除去するためのラボの組織とカバースリップ上でそっと押し。マニキュアでカバースリップの端をシールします。
    5. 適切なフィルターを備えた蛍光顕微鏡を使用して表示スライド。

マウス染色体の5スペクトル核型分析（SKY）

  1. 染色体およびプローブ変性
    1. 振盪せず、2分間、室温で2×SSC中でスライドを平衡化します。
    2. 室温で2分間、エタノールシリーズ（70％、80％、および100％エタノール）中でスライドを脱水します。エタノールを完全に除去するために、スライドを空気乾燥させます。
    3. ウォーム40 mLの変性溶液（70％ホルムアミド/ 2×SSC; pH7.0）で30分間ガラスコプリンジャーです。
    4. 1〜1.5分間予熱した変性溶液中でスライドをインキュベートします。
    5. 直ちに変性プロセスを停止するとともに、再アニーリングから変性染色体を防ぐために2分間氷冷70％エタノールにスライドを浸します。
    6. 2分間80％エタノール中に置き、次いで室温で2分間、100％エタノールにすることによってスライドを脱水。
    7. 80℃（±2℃）に設定された水浴中でSKYプローブ（メーカーによって供給されたバイアル＃1）変性7分間、その後すぐに10分間37℃に設定し、異なる水浴中に配置します。
  2. プローブのハイブリダイゼーション
    1. 変性した染色体上に変性SKYプローブの10μLを追加します。
    2. 空気の泡がカバースリップの下に閉じ込めされないように、慎重にSKYプローブ上に18ミリメートル×18ミリメートルのガラスカバースリップを配置。
    3. ゴムセメントでカバースリップの端をシールします。
    4. 加湿遮光チャンバー内でスライドを置き、36時間〜24時間、37℃の暗所でインキュベートします。
  3. ハイブリダイゼーション後の洗浄及び蛍光検出
    1. カバースリップを乱すことなく、非常に慎重にゴムセメントを削除します。
    2. 振盪しながら5分間72℃（±2℃）で予熱した迅速な洗浄溶液（0.4×のSSC）にスライドを置きます。洗浄液III（4×SSC / 0.1％のTween 20）にスライドを浸し、振とうしながら1分間インキュベートします。
    3. オプション：ブロッキング試薬の80μLを追加します。ハイブリダイゼーションの領域上に（製造業者によって供給されたバイアル＃2）の2​​4mm×60ミリメートルのプラスチックカバースリップを置き、加湿チャンバー内で37℃で30分間、暗所でインキュベートします。
    4. 静かにプラスチックカバースリップを削除し、5分間予熱した（45ºC）洗浄液IIIとスライドを洗います。
    5. 80μLのCy5の染色試薬（メーカーによって供給されたバイアル＃3）を適用し、24ミリメートル×60ミリメートルのプラスチック製カバースリップを置き、加湿チャンバー内で40分間、暗所で37℃でインキュベートします。
    6. （4×SSC / 0.1％Tween 20）で予熱した（45ºC）洗浄液IIIを含有するガラスコプリンジャーにスライドを浸漬し、振盪しながら2分間、水浴中で45℃でインキュベートします。この洗浄工程を3回繰り返します。
    7. 80μLのCy5.5の染色試薬（メーカーによって供給されたバイアル＃4）を適用し、24ミリメートル×60ミリメートルのプラスチック製カバースリップを置き、加湿チャンバー内で40分間、暗所で37℃でインキュベートします。
    8. （予め温めてスライドを3回洗浄45ºC）洗浄液III。
    9. 余分な水分を排出するためにペーパータオルに対する傾斜位置でスライドを保持します。 20μL抗フェードDAPI試薬（メーカーによって供給されたバイアル＃5）を追加し、慎重に気泡を導入することなく、24ミリメートル×60ミリメートルのガラスカバースリップを配置。マニキュアでカバースリップの端をシールし、SKY画像を取り込むために装備落射蛍光顕微鏡で観察します。

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結果

全身照射は、照射したマウスの骨髄細胞における多数の染色体異常を誘発します。現在のプロトコルは、放射線暴露後の骨髄細胞のin vivoでの有糸分裂停止のために最適化され、密度勾配遠心分離、中期細胞スプレッドの調製、およびそれに続くによって照射されたマウス骨髄単核細胞の単離の後脚から骨髄細胞の採取mFISHとSKY技術による放射線誘発安定した染色体異常の検出。これらの技術を用いて塗装染色体は、種々の病態生理学的状態のリスクを検出し、評価することができます。

図1は、代表的な中期細胞は、正常と異常なマウス染色体のペア-1、-2、および-3で広がりを示しています。 図2は 、正常と異常のマウスの中期染色体のスペクトル核型分析を示しています。これらの結果は、電離放射線は、主に、多様な細胞型への自己再生および分化に関与している幹細胞および前駆細...

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ディスカッション

いくつかの重要なステップは、mFISHとSKYの成功を決定します。最初の最も重要なステップは、骨髄単核細胞のin vivoでの有糸分裂停止のためのコルヒチン処理を最適化することです。コルヒチン濃度と処理時間個別に、または分裂指数だけでなく、染色体凝縮-2効果的な染色体の絵画のための重要な前提条件を決定コンサートインチ高コルヒチン濃度や長い処理時間は、適切な変性およびハイブリダイゼーションのための互換性のない非常に凝縮した染色体につながります。また、凝縮された染色体で拡散中期細胞における複雑な再配列の正確な識別が達成するために簡単な作業ではありません。 22と26グラムの間の体重を有するマウスで2時間100μL、0.05％コルヒチンの腹腔内投与は、中期細胞の十分な数が適度に凝縮した染色体に広がる生産します。第二の重要なステップは、低張処理です。ボリューム、処理時間、および低張液の影響染色体の形態の温度及びスライドガラス上に染色体の広がり。短時間または準最適温度での低張処理は、適切な染色体重複、染色体との中期細胞の広がり、その結果、拡散を防止することができます。染色体重複はin situハイブリダイゼーシ...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この研究は、国立航空宇宙局を通じてアーカンソースペースグラントコンソーシアムと国立宇宙生物医学研究所によってサポートされていました、付与NNX15AK32A（RP）とRE03701（MH-J）、およびP20のGM109005（MH-J）、および米国退役軍人局（ MH-J）。私たちは、原稿の準備で編集の支援のために、クリストファーフェテス、アーカンソー医科大学環境学科や産業衛生プログラム・コーディネーターに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ホルムアミドSigma-Aldrich221198-100ML
SSCバッファー20倍;マウス用濃縮シグマ-アルドリッチS6639-1L
SKY実験用試薬応用スペクトルイメージングFPRPR0030/M40
CAD - 濃縮抗体検出キット応用スペクトルイメージングFPRPR0033
シングルペイント カスタマイズ - 3色;マウス染色体1:赤、マウス染色体2:緑、マウス染色体3:AquaApplied Spectral ImagingFPRPR0182/10
ガラスカバースリップFisher Scientific12-545B
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
塩酸、37%、Acros OrganicsFisher ScientificAC45055-0025 
フィッシャーブランドガラス染色皿 スクリューキャップ付きフィッシャーサイエンティフィック08-816
KaryoMAX塩化カリウム溶液 Life Technologies10575-090
フィッシャーブランド スーパーフロスト プラス 顕微鏡スライドフィッシャー サイエンティフィック12-550-15
コルセミド粉末フィッシャー サイエンティフィック50-464-757 
Histopaque-1083 シグマ・アルドリッチ10831
シェパード マーク I モデル 25 137Cs 照射器J. L. シェパード &AssociatesModel 484B
Syringe 1 mLBD Biosciences647911
Ethyl Alcohol, 200 ProofFisher ScientificMEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and MagnesiumFisher ScientificICN1860454
Fetal Bovine SerumFisher Scientific10-437-010
メタノールFisher ScientificA454SK-4
氷酢酸フィッシャーサイエンティフィックAC295320010
ツァイス顕微鏡ツァイス AXIO イメージャー.Z2

参考文献

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複数の蛍光によるインター染色体安定型異常の検出
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